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所有解决方案都必须是冷冰冰的。含蔗糖的溶液必须在当天新鲜配制。在使用前向所有溶解溶液中添加蛋白酶抑制剂(0.1mM PMSAF和完整的微型蛋白酶抑制剂;商用)。
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通常,我们每0.5 mg DNA添加50 U微球菌核酸酶,反应体积为1.0 ml。这通常作为粉末提供;在dH中溶解微球菌核酸酶20至所需浓度,并在-20°C下小份储存。等分样品可以再次冷冻和使用一次。这一步骤需要仔细控制,尤其是在初始准备阶段。
高浓度的微球菌核酸酶可能过度消化染色质,导致亚核小体颗粒。你应该致力于获得长/中寡核苷酸阶梯。如果需要纯单核小体制剂进行线性蔗糖梯度(5-20%),这将提高分辨率。
向每个结合部分添加500μl培养缓冲液,以将SDS浓度降至0.5%。然后按如下方式处理未结合分数和结合分数:
或者,DNA水平通过实时PCR进行定量测量。引物和探针通常使用实时PCR设备提供的软件来设计。
10 x TBS(待定)0.1 M Tris-HCl(pH 7.5)150万氯化钠30 mM氯化钙220 mM氯化镁250 mM丁酸钠(pH 8.0)
消化缓冲液0.32 M蔗糖50 mM Tris-HCl(pH 7.5)4 mM氯化镁21 mM氯化钙20.1毫微米PMSF5 mM丁酸钠
裂解缓冲液1.0 mM三氯化碳(pH7.4)0.2毫摩尔钠2乙二胺四乙酸0.2毫微米PMSF5 mM丁酸钠
孵化缓冲液50 mM氯化钠20 mM Tris-HCL(pH 7.5)20 mM丁酸钠5 mM钠2乙二胺四乙酸0.1毫微米PMSF
缓冲器A50mM Tris-HCl(pH 7.5)10 mM乙二胺四乙酸二乙酯5 mM丁酸钠50 mM氯化钠
缓冲器B50 mM Tris-HCL(pH 7.5)10 mM乙二胺四乙酸二乙酯5 mM丁酸钠100 mM氯化钠
缓冲区C50 mM Tris-HCL(pH 7.5)10 mM乙二胺四乙酸二乙酯5 mM丁酸钠150 mM氯化钠
蛋白质A琼脂糖在4°C条件下,在缓冲液A中过夜。离心(10000 x g,10 min)并将颗粒重新悬浮在大约等量(50%v/v)的缓冲液A中。
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