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回顾线粒体在细胞凋亡执行中的重要作用,研究线粒体参与的方法,以及线粒体在非凋亡形式的细胞死亡中的可能作用。
Stephen Tait博士在英国皮尔布赖特的动物健康研究所进行了研究生研究,他在那里研究了病毒免疫回避策略。他的博士后培训在荷兰癌症研究所、阿姆斯特丹和孟菲斯圣裘德儿童研究医院进行。
自2012年以来,他在英国比森癌症研究所和格拉斯哥大学成立了自己的研究小组。他的团队部分得到了皇家学会的奖学金支持。
Tait实验室的主要研究兴趣是研究癌症中线粒体功能的放松调节,同时关注细胞死亡和自噬。
我很高兴向您介绍今天的主持人,高级活动和营销协调员Lucy Purser。露西,你现在可以发言了。
LP:谢谢你,卡拉。嗨,欢迎参加今天的Abcam网络研讨会。今天的主讲人是英国癌症研究所、Beatson研究所和格拉斯哥大学的Stephen Tait博士。斯蒂芬在英国皮尔布赖特动物健康研究所进行研究生学习。这是他研究病毒免疫回避策略的地方。他的博士后培训在阿姆斯特丹的荷兰癌症研究所和孟菲斯的圣裘德儿童研究医院进行。自2012年以来,Stephen在英国癌症研究所、Beatson研究所和格拉斯哥大学成立了自己的研究小组。他的团队部分得到了皇家学会的奖学金支持。他的实验室的主要研究兴趣是研究癌症中线粒体功能的放松调节,重点是细胞死亡和自噬。
Abcam研究领域内容助理David Bruce今天将加入Stephen。David拥有阿伯丁大学生物医学(药理学)学士学位。在加入Abcam之前,David在邓迪大学攻读博士学位,研究了新型蛋白磷酸酶和泛素E3连接酶对TGF-β信号通路的调节。
在开始之前,只需快速提醒一下,网络研讨会结束时的问答环节的问题可以随时通过屏幕顶部下拉部分的问答面板提交。我现在将移交给Stephen,他将主持这次网络研讨会。
非常感谢,露西,谢谢你的介绍。今天,我真的要谈谈细胞死亡的线粒体途径以及如何研究这些过程。我真的要把我的演讲分成三个独立的部分:第一,将讨论线粒体或细胞凋亡的内在途径,其机制,及其在疾病中的功能障碍,并真正概述了该领域仍然存在的几个悬而未决的问题。由此,我将继续讨论至少一些可以用于检测正在研究的系统中线粒体依赖性凋亡的方法。最后,我将展示我们开发的一种新方法,用于确定非凋亡细胞死亡中的线粒体功能。
所以,首先,我要谈谈细胞凋亡。凋亡细胞死亡需要激活称为半胱天冬酶的蛋白酶,这会导致细胞快速死亡。实际上,有两种不同的途径,或两种主要途径,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶可以被激活。一种被称为凋亡的外源性途径,通常由死亡受体配体激活。这些蛋白与受体结合,受体聚集并激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8,活性半胱氨酸蛋白酶-8继续前进,然后裂解半胱氨酸水解酶-3和7,导致细胞快速死亡。我不想谈太多关于凋亡的外在途径。
今天,我们将重点关注细胞凋亡的内在途径,也称为细胞凋亡的线粒体途径,这是由DNA损伤或内质网应激等众多应激之一激活的。这导致BH3-only蛋白质的激活,进而激活Bax和Bak过程中的两个蛋白质。我们将对此进行更详细的讨论,但这些蛋白质被激活后会导致线粒体外膜渗透。然后,这反过来通过从线粒体释放诸如细胞色素C或SMAC和OMI等蛋白质激活caspase,然后在细胞色素C的情况下驱动caspase激活。另一方面,SMAC和OMI抑制一种称为XIAP的caspase抑制剂,其净效应是一旦发生线粒体通透性,也被称为MOMP,我在谈话中也会称之为MOMP。细胞在几分钟到几个小时内就会死亡。
因此,仅仅强调线粒体凋亡途径,在健康细胞中,线粒体在其线粒体膜间空间获得各种蛋白质,如细胞色素c、SMAC和OMI,当这些蛋白质释放时,它们会主动杀死细胞。因此,在某种意义上,线粒体可以被认为类似于自杀胶囊。当细胞受到死亡触发时,它会激活BH3-only蛋白,其中一个是tBid。这些蛋白反过来激活Bax和Bak,当Bax和Bak被激活时,它们会选择性地渗透线粒体外膜。线粒体外膜渗透,这对前面提到的细胞有灾难性的后果。细胞色素c结合这种适配器分子Apaf,反过来激活半胱天冬酶,裂解数百种不同的蛋白质,导致细胞快速凋亡死亡。如前所述,SMAC和OMI抑制了这种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂XIAP,因此,最终的效果是您可以快速、强健地激活半胱氨酸蛋白酶并快速导致细胞死亡。
我们可以通过共焦显微镜对整个过程进行成像,如图所示。你将在这部电影中看到的是线粒体被荧光融合蛋白SMAC-mCherry标记为红色。它们还表达YFP-Bax,这在健康细胞中主要是胞质的。现在,当细胞死亡时,细胞看起来非常健康,直到线粒体通透性发生。此时,SMAC-mCherry在整个细胞中释放,你会看到它从点状模式转移到弥散模式,同时Bax转移到线粒体上。因此它移动到线粒体上,从弥散模式转移到点状模式。一旦发生线粒体通透性化,这将参与快速而强大的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性,从而导致细胞凋亡的特征,你可以在这些细胞中很好地看到这一点。细胞收缩,细胞核浓缩,最后,细胞暴露于磷脂酰丝氨酸。这是可以检测到的,因为我们添加了与APC结合的膜联蛋白V,当它从质膜的内叶翻转到外叶时,它与磷脂酰丝氨酸结合。所以我将把这部电影播放几遍,只是为了强调线粒体通透性是线粒体凋亡途径中的关键事件。最后,如我所说,这些细胞暴露在磷脂酰丝氨酸中,在我们的体内,这些细胞被邻近的吞噬细胞迅速清除。再次,在那一点上,我们得到大量半胱氨酸天冬氨酸酶激活,细胞收缩,膜泡,细胞核浓缩,磷脂酰丝氨酸暴露。
因此,这将给你一个想法,即线粒体通透性通过caspase活性导致细胞死亡,实际上,即使在底物没有caspase裂解的情况下,线粒体通透通常也代表着一个无可挽回的点。在这部电影中,细胞被转染了GFP/tBid蛋白,导致线粒体通透性。这些细胞已经在整个细胞中释放了SMAC-mCherry。然而,这些细胞已经被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂孵育,虽然细胞不会在短期内死亡,但随着时间的推移,你可以很好地看到细胞经历了大量的血管化,并经历了看起来像坏死细胞的死亡。因此,即使我们阻止半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活,只要线粒体发生通透性,细胞也会死亡。通常,这一事件会导致caspase依赖性凋亡,但不知何故,缺乏caspase活性的细胞仍会死亡。一些研究认为,这可能是线粒体在触发半胱天冬酶非依赖性细胞死亡中的积极作用。此外,死亡可能仅仅是由于线粒体功能的逐渐丧失。
线粒体凋亡在健康和疾病中有许多作用,这是正常胚胎发育所必需的,这在线粒体通透性不足的小鼠身上得到了最好的证明,例如,缺乏Bax和Bak的小鼠;这通常是胚胎致死。它也是调节免疫系统等许多其他功能所必需的。因此,线粒体通透性不足导致淋巴细胞成熟、内环境稳定缺陷,最终触发自身免疫。所以这仅仅是线粒体凋亡在维持健康中作用的两个例子。
它在疾病中也有许多作用,也许在癌症中可以看到线粒体凋亡放松调控的最佳证据。因此,癌症的特征之一是,在致瘤过程中,细胞必须发生凋亡。为什么会这样?好吧,许多肿瘤抑制途径参与细胞凋亡并杀死细胞,这有变为恶性的风险,所以抑制细胞凋亡可以促进转化。此外,它还可以促进肿瘤细胞在缺氧或营养不良条件下的存活,这是肿瘤细胞面临的常见条件。凋亡促进癌症的另一个方面是,许多细胞从基质上脱落时会经历一种称为失巢凋亡的凋亡形式。这可以防止细胞在体内移动,并防止转移。因此,很明显,再次抑制细胞凋亡将促进这一过程以及癌细胞在其体内的运动。最后,它具有这种副作用,许多抗癌疗法都可以诱导凋亡,因此通过抑制凋亡细胞死亡,细胞不仅可以癌变,还可以逃避化疗或放疗。
正如前面提到的几张幻灯片所示,Bax和Bak实际上是两种关键蛋白质,对MOMP、线粒体通透性和凋亡至关重要。在促凋亡触发物上,激活BH3-唯一蛋白,导致Bax和Bak活性,最终触发MOMP。这在缺乏Bax和Bak的小鼠身上得到了最好的证明,其中一个细胞死亡的生理例子是我们四肢的指间间隙;这个网状结构通过凋亡过程死亡,如果我们敲除Bax和Bak,我们可以有效地防止这些指间网状结构中的细胞死亡,你可以看到网状结构仍然存在。此外,如果我们从Bax和Bak缺乏的动物身上提取细胞,我们可以很好地看到DKO细胞,在没有Bax和Bak细胞的情况下,所有凋亡的内在或线粒体触发因素,如staurosporine、etoposide或UV,都对这些刺激完全有抵抗力。
那么这些蛋白质是如何被激活的呢?好吧,正如几张幻灯片前那部电影中所示,Bax主要在健康细胞中是一种胞质蛋白,所以这是绿色GFP Bax。当细胞经历线粒体通透性化,经历细胞凋亡时,Bax从胞质位置易位到线粒体上,正如你在这里很好地看到的,与线粒体共定位。在这种易位中,它参与线粒体通透性化,你会在这部电影中很好地看到,Bax易位,所以它从这种弥漫性定位转变为点状线粒体定位。实际上,同时,线粒体的通透性只涉及线粒体膜间隙中的mCherry,然后从整个细胞的线粒体中释放出来,最终导致细胞死亡。正如你在这里可以很好地看到的那样,Bax将移位,同时发生线粒体通透性。
那么活性Bax和Bak是如何引起线粒体通透性的呢?这确实是一个很有争议的问题。有一件事很清楚,就是在细胞凋亡过程中Bax和Bak形成同源寡聚体,这在使用化学交联剂的实验中非常明显。用tBid活性形式处理的细胞或线粒体参与线粒体通透性,在交联剂存在下处理。当我们观察Bak时,它会从单体状态转移到存在状态,或者当它被激活时,我们可以交联更大分子量的物种,Bax也是如此。所以有两种流派:一种,我们认为Bax和Bak在活化后会形成同源二聚体,如果你愿意的话,是一种依赖性的,头对头的同源二聚物。然后形成重量更高的低聚物,最终导致线粒体的通透性。或者,活性Bax和Bak被提议导致这些菊花链状低聚物最终导致线粒体通透性的形成。
线粒体外膜如何渗透?两个主要模型认为,Bax和Bak激活后,它们要么形成蛋白质通道,因此它们在线粒体本身形成孔,从而释放膜间空间蛋白质。另一种模式,当然也有很多争议,是不是直接在激活Bax和Bak的线粒体外膜上形成孔,而是弯曲线粒体外膜脂质,形成脂质孔,最终释放细胞色素c。这一过程是如何发生的,正如我提到的,仍在激烈辩论。
它是如何控制的?简单地说,我到目前为止所讨论的内容会让你认为它只是单向的,只要有一个激活信号Bax,Bak就会被激活。然而,事实并非如此。有许多蛋白质抑制Bax和Bak活化,因此,BCL-2蛋白家族成员基本上调节线粒体通透性。该家族可分为两个主要亚群:一个是抗凋亡BCL-2蛋白家族,由BCL-2、BCL-W、BCL-XL、A1和MCL-1组成,具有四个BCL-2同源结构域。其次,有促凋亡BCL-2蛋白,正如我提到的,Bax和Bak是其中的两个,它们是效应分子。你与这些蛋白质的相似性,无论它本身是否是效应蛋白,都不清楚。最后,如果你愿意的话,还有一类凋亡信号分子,即BH3-only蛋白,其中有许多激活凋亡的BID、BIM、BAD、BIK、BMF等。因此,抗凋亡BCL-2蛋白抑制线粒体通透性的过程,而它们做到了这一点,整个系统通过蛋白质相互作用进行工作。
例如,这是MCL-1与BH3-only蛋白BIM的BH3结构域结合的结构。发生的是BIM的BH3-唯一结构域与MCL-1的疏水屋顶结合,这样MCL-1可以中和BIM功能。在幻灯片的这一部分,你可以很好地看到这些是抗凋亡BCL-2蛋白,它们在不同程度上与不同的BH3-唯一蛋白结合。因此,例如,BIM、PUMA和tBID似乎能够结合所有它们,BAD和NOXA是其他仅BH3的蛋白质,它们的结合特异性受到更多限制。其次,BCL-2蛋白可以与Bax和Bak结合,而且,抗凋亡BCL-2蛋白质可以与Bak或Bax结合似乎具有某些特异性。
因此,BCL-2蛋白究竟如何调节MOMP仍是一个有争议的问题。直到最近,有两种模型提出了这种效应。一是Bax或Bak,就这一点而言,直接被BH3-only蛋白质激活,因此,例如,BIM激活Bax,然后继续驱动线粒体通透性。在这个模型中,BCL-2蛋白是一种直接的激活模型,它仅仅用于结合和隔离这些仅激活BH3的蛋白,并且在这样做的过程中,它们可以阻止Bax和Bak的活性。另一种模式,即间接激活模式,是指这些蛋白质(如Bax和Bak)不是直接被激活,而是以组成活性形式存在,因此BCL-2家族成员,即抗凋亡蛋白,起到阻断激活Bax和Bak的作用。该模型中BH3-only蛋白中和抗凋亡BCL-2功能,使活化的Bax和Bak驱动线粒体通透性。
最近,有一个我称之为“统一”的模型,它是对嵌入在一起的模型的详细阐述,它确实认为直接模型和间接模型都可能是正确的。在这个模型中,BIM或另一种仅BH3的蛋白质可以激活Bax,导致Bax活化和线粒体通透性。BCL-2,抗凋亡BCL-2蛋白通过结合这些仅激活BH3的蛋白以及通过结合激活的Bax和Bak来抑制该过程。因此,这两种模型最有可能的方面都是正确的。
最近,已经开发出治疗癌症线粒体凋亡的新药。这些药物被称为BH3-模拟物,它们通过结合抗凋亡BCL-2家族蛋白中的疏水沟发挥作用,并中和其保护功能。因此,通过结合在例如BCL-xL中的疏水沟槽中,这种药物Navitoclax ABT-263阻止BH3-only蛋白质与BCL-2家族成员结合,从而释放这些BH3-onlyly蛋白质继续并激活Bax和Bak。
因此,已经开发了多种BH3模拟物,以面板为目标,例如,BCL-xL、BCL-W和BCL-2或BCL-2家族成员,ABT-737、263和所有三种模拟物。最近,开发了针对BCL-xL的新的WEHI-539,ABT-199针对BCL-2。值得注意的是,这也是我们稍后将要谈到的,还有其他各种抗凋亡和BCL-2家族成员,目前我们还不能明确针对这些成员。
那么这些药物在实践中是如何起作用的呢?正如我所说,抗凋亡BCL-2蛋白阻止线粒体通透性。当我们添加BH3-模拟化合物时,它会靶向并中和抗凋亡BCL-2功能,因此如果您愿意,它会在凋亡过程中消除这个中断。现在,细胞更加敏感,例如,你可以用较低的药物治疗来触发细胞死亡。这导致释放或上调少量BH3-only蛋白,触发线粒体通透性。因此,在这些药物存在的情况下,许多细胞,特别是肿瘤细胞实际上对细胞死亡更敏感。
这里有一些证据表明,它们是有效的,这些药物不仅作为研究工具非常有用,而且它们本身或与化疗联合使用都非常有效,导致肿瘤细胞死亡。例如,这些是裸鼠体内生长的异种移植瘤。它们要么是用载体生长的,你可以很好地看到肿瘤一直在生长,要么是在ABT-737存在的情况下。其次,在临床上,它们也被使用过,这是一名患有淋巴瘤的患者,正在接受一种BH3模拟物的预治疗,正如你可以看到这里的淋巴瘤肿块。治疗后,大部分淋巴瘤已经消退。所以,正如我所说的,它们看起来是非常有前途的药物,要么单独使用,要么用于治疗某些淋巴瘤或白血病,要么与其他化学疗法一起使用,以特异性杀死癌细胞。
总结这一部分,我到目前为止告诉你的是线粒体外膜通透性是线粒体凋亡途径中的关键事件。它导致从线粒体膜间隙释放蛋白质,如细胞色素c,激活半胱氨酸天冬氨酸酶。然而,重要的是,即使在缺乏半胱氨酸蛋白酶活性的情况下,MOMP也代表着一个不可逆点,因此一旦发生,细胞就会死亡。BCL-2家族蛋白是线粒体通透性的主要调节因子。促凋亡BH3-only蛋白发出促凋亡信号,或传递促凋亡信号激活Bax和Bak,阻断保护性抗凋亡BCL-2功能。激活后的Bax和Bak使线粒体外膜渗透。抗凋亡BCL-2蛋白结合两类促凋亡蛋白,从而阻止凋亡。这些或这种相互作用网络已经被设计用于特异性结合和中和抗凋亡BCL-2蛋白的新药所利用。
所以我刚刚概述了三个悬而未决的问题,我认为关于线粒体凋亡途径还有很多其他问题,但至少有三个问题浮现在我脑海中;至少在我脑海中闪现。一个是活化的Bax和Bak如何渗透线粒体外膜?如前所述,这有两种模型,但这一过程是如何发生的还不清楚,关键是我们要理解它,因为这是决定细胞是否存活或死亡的真正事件。
其次,当我们考虑针对这种网络疾病时,我们能否有效地针对癌症患者的BCL-2家族成员?我的意思是,我们可以清楚地开发出抑制抗凋亡BCL-2蛋白的药物,但耐药性会有问题吗?例如,MCL-1的上调,我们目前无法实现这一目标。其次,如果我们同时靶向许多抗凋亡BCL-2蛋白,是否会导致毒性问题?此外,远离这种使细胞对凋亡敏感的想法,有些疾病中过多的凋亡是一件坏事。例如,各种神经退行性疾病可能是由过多的细胞凋亡引起的。
那么,另一方面,我们能否靶向BCL-2家族成员,以防止细胞死亡中的线粒体外膜通透性?真的,我认为这是一个相对未开发的领域,值得更多关注。
所以接下来我将和大家讨论一些方法——当然不是详尽的列表——但一些检测线粒体依赖性细胞凋亡的方法。首先,你有一种杀死细胞的兴趣刺激。MOMP真的发生在我的兴趣刺激之后吗?大多数围绕检测线粒体通透性的分析都依赖于膜间空间蛋白(如细胞色素c、SMAC和OMI)从线粒体到胞体的强力释放。正如我在那部电影的早些时候向你展示的那样,这真的是一个黑白事件,大多数(如果不是全部)线粒体在细胞中渗透,导致这些蛋白质大量释放到细胞体中。因此,我们可以使用这种差异定位来检测MOMP的存在。
我们可以通过几种方法做到这一点:一种是对细胞色素c、SMAC或OMI进行免疫荧光染色。在正常、健康的条件下,它呈点状,当MOMP发生时,它进入弥散细胞溶质状态。这些图很好地显示了这一点,其中细胞色素c在健康细胞中被染色,你可以看到它有点状的定位。或者用放线菌素D处理过的细胞发生凋亡,你可以看到这些细胞聚集在一起,细胞色素c在整个细胞中释放。在zVAD存在的情况下,我们可以看到细胞色素c从整个细胞的线粒体中释放出来。zVAD是一种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂,这可以防止细胞聚集,实际上使它们更容易可视化。所以我认为进行这些分析,一个关键的技巧是在实验中添加caspase抑制剂,以防止细胞圆形和脱落。需要注意的重要一点是,只有在半胱天冬酶不是线粒体通透性上游的情况下,这才有效。因此,最初,无论有无半胱氨酸蛋白酶抑制剂,可能两种方法都是有益的。
它的优点是它很简单,有很好的线粒体和膜空间蛋白抗体,当细胞经历MOMP时,这很明显,这不是很主观的分析。你可以很清楚地看到健康细胞和经历过MOMP的细胞之间的区别,而且可以是非常定量的。我认为一个主要的缺点是,在量化许多不同的样本时,这相当费力。
或者,我们可以使用细胞溶质和/或线粒体膜组分的蛋白质印迹检测整个细胞膜间隙的蛋白质释放。这是一个刺激细胞的例子,用不同的方法进行分离。我们经常使用基于洋地黄素的溶解,但同样好的是,高渗溶解也有效。通过使用这些选择性溶解条件,可以选择性地渗透质膜,使线粒体外膜保持完整。再次,我认为在实验中添加qVD半胱天冬酶抑制剂或zVAD有助于防止细胞溶解和细胞色素c丢失,至少是从细胞溶质部分。因此,作为一个例子,在这里,这些细胞要么用对照药物,要么用足叶乙甙或γ射线照射不同时间。高渗溶解,然后用细胞溶质检测细胞色素c,作为线粒体通透性的测量手段,你可以很好地看到这些是凋亡触发因素,我们可以很有效地检测细胞溶质提取物中的细胞色素c。
其中一个主要优点是它非常简单,然而,我们对这种方法的反对意见是,你需要比免疫染色更大的样本,而且它不是非常定量的。因此,很明显,只有在至少一部分[记录中断]发生线粒体通透性化的细胞中,我们才能获得一定百分比的细胞。
最后一种方法,至少,使用抗体免疫染色方法,我今天要讨论的是通过FACS分析或细胞色素c检测整个细胞膜间隙中蛋白质的释放,或者也可以对线粒体释放的SMAC或OMI进行检测。所以这个方法是由奈杰尔·沃特豪斯(Nigel Waterhouse)几年前开发的,其背后的原理是我们可以取一个健康的细胞,当你选择性地渗透质膜时,线粒体仍然完好无损,所以我们没有丢失线粒体膜间空间蛋白信号,我们可以对这些细胞进行免疫染色并用FACS染色,因此这些染色很高。然而,当细胞发生凋亡时,膜间隙蛋白会渗入整个细胞,然后我们可以选择性地使质膜渗透,如果你愿意,这种蛋白可以是细胞色素c,可以从细胞释放到胞浆中。我们将这些细胞染色,这些染色较低,因此,本质上,我们可以得到两个峰值:一个是健康的,没有发生MOMP;发生了第二种不健康的情况,即MOMP。我们可以用非常定量的方式来区分这一点,这从奈杰尔的论文中可以很好地看出。这些是健康的细胞,而不是MOMP;这些都是经历过MOMP的人,我们可以很容易地对其进行量化,如我几年前所做的一些工作所示。
这种方法的优点是它简单、定量,而且实际上,你也不需要太多的细胞。你可以同时做许多不同的样品。缺点是,至少,我对这种方法的经验是,有时正峰值和负峰值有些重叠,这使量化变得复杂。其次,必须在动力电池类型的基础上优化洋地黄素的浓度。
我今天要为大家讨论的检测MOMP的最后一种方法是使用活细胞成像。因此,我们可以用细胞色素c-GFP、SMAC-mCherry、SMAC-GFP或OMI-mCherry等蛋白质对线粒体进行荧光标记。这些蛋白质明显存在于健康细胞的线粒体膜间空间,但我们可以随着时间的推移反复成像这些细胞,当细胞经历线粒体通透性时,这些蛋白质就会释放出来。我们可以检测到这些蛋白质在整个细胞中的释放。
我认为这很好地显示了这些细胞,MCF-7细胞经过凋亡处理后,它们表达基质,线粒体基质靶向的dsRED,即使它们经历线粒体通透性化也会留在线粒体中。然而,这些细胞也在SMAC-GFP中表达,当细胞经历线粒体通透性时,SMAC-GPP在整个细胞中以爆炸性的方式快速释放。你可以很清楚地看到。因此,实时观察线粒体通透性是一种相对简单的方法。
它的一个巨大优势是,我们可以在动力细胞的基础上观察这些细胞,我们可以成像这些细胞,当细胞经历线粒体通透性时,我们可以很容易地通过在单个细胞周围设置门控来量化。所以我们应用了一个所谓的点状漫反射指数,这是对许多不同单元的平均值。这是线粒体通透性的开始,实际上在10分钟内,大多数细胞已经完全释放,线粒体完全通透性,然后最终死亡。
因此,这种方法的优点是它是定量的,获得的小细胞数可以很容易地与其他探针多路复用。例如,我们可以同时观察半胱氨酸蛋白酶激活和BACS易位。缺点是,它的吞吐量相对较低,分析时间可能相当长,至少对于某些报告蛋白,它们可能必须稳定地引入细胞。所以瞬时转染,尤其是细胞色素c之类的东西,往往会定位错误,因此不能正确定位到线粒体。因此,从这个意义上讲,可能需要一段时间才能产生一个非常有用的细胞系。
因此,接下来,我想问一个问题或给出一些提示,我如何判断我的治疗是否诱导了线粒体依赖性凋亡?首先,你要解决的是,你的细胞是否正在经历凋亡,通常我们在实验室通过流式细胞术进行这项工作。在这里,我们使用细胞无色染料,如碘化丙啶,它被带入濒死细胞,所有濒死细胞都会吸收碘化丙锭,无论它们是否发生凋亡。然而,我们与膜联蛋白V和PI共同标记细胞,这使我们能够对凋亡人群进行特异性染色,这些人群是膜联蛋白V阳性的,通常是PI阴性的,但最终,当细胞停留足够长的时间后,他们会吸收PI。这里显示了一个例子,这些细胞发生了凋亡,这些是健康的细胞。我们沿着底部进行PI染色,沿着侧面进行annexin V染色。细胞发生凋亡时,膜联蛋白V呈阳性,这是因为我在演讲开始时提到的发生在凋亡过程中的磷脂酰丝氨酸暴露。它从质膜的内叶翻到外叶,我们可以用膜联蛋白V检测到,最终,这些膜联蛋白阳性的细胞也会吸收PI。但我们可以通过观察膜联蛋白V阳性、PI阴性人群来具体测量细胞凋亡。
其次,你可以通过添加化学半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂来确定是否发生了凋亡,我们在实验室中经常使用的抑制剂也有很多,如qVD或zVAD。如果出现caspase依赖性过程,caspase依靠性凋亡,那么这些应该至少可以减缓细胞死亡。值得注意的是,MOMP还可能导致caspase-independent细胞缓慢死亡,这使得进行广泛的动力学研究变得非常重要。此外,你可以通过生成过度表达抗凋亡BCL-2蛋白的细胞株来询问线粒体通透性是否是细胞死亡所必需的。在我的实验室里,我们在U2OS细胞中表达了BCL-xL,BCL-xL是一个抗凋亡的BCL-2家族成员,然后我们测量了蛋白酶体抑制剂中细胞死亡的下降。你可以很好地看到细胞死亡,这是通过观察annexin V阳性,BCL-xL抑制了这个过程。我们认为线粒体-蛋白酶体抑制剂MG132通过线粒体依赖效应触发细胞死亡。另外,除了过度表达抗凋亡BCL-2蛋白外,我们还可以敲除Bax或Bak。需要注意的是,在大多数情况下,Bax或Bak都足以驱动细胞凋亡,因此在大多数情况中,两者都需要被敲除。
我刚刚说过,我认为在许多情况下,用广泛的动力学进行细胞死亡分析很重要。这真的突出了这个例子,我们可以过表达BCL-xL,用星形孢菌素处理细胞,星形孢菌素是一种凋亡触发物,观察线粒体通透性的百分比,所有这些不同浓度的星形孢菌素BCL-xL有效阻断细胞死亡,至少在短期内是这样。如果这些细胞停留的时间更长,你可以很好地看到,只有在较低浓度的星形孢菌素下,BCL-xL才能使克隆体存活。显然,这种化合物星形孢菌素和许多其他触发物也是这样。在较长期的情况下,这些凋亡刺激或死亡前刺激可能会触发其他形式的细胞死亡,因此尽可能利用广泛的动力学进行这些分析非常重要。
其他可以研究的方面,可以观察Bax的活化,例如,通过观察线粒体上的易位,利用Richard Youle实验室多年前开发的活性构象特异性抗体6A7来观察活化的Bax,可以通过成像或流式细胞术来使用。同样,可以通过使用构象特异性抗体Ab-2来观察Bak活性
此外,已经对MOMP及其在细胞死亡中的作用进行了广泛的研究,利用在体外线粒体通透性测定。因此,在许多情况下,这些都是使用从小鼠肝脏中分离出来的线粒体,尽管它们也可以从许多细胞系中分离出来。小鼠肝线粒体可以在Eppendorf管中与不同的BH3-纯蛋白一起孵育,但这只是一个例子。你把它与这些与MOMP结合的蛋白质一起培养,进行线粒体通透性,然后你可以很容易地通过离心线粒体膜颗粒或上清液分离出来。你可以很清楚地看到,然后我们封锁细胞色素c。在对照情况下,颗粒中没有MOMP或细胞色素c残留。在线粒体通透性被激活的情况下,细胞色素c完全从线粒体中释放出来。因此,我建议您参阅本文,了解如何分析线粒体通透率的更详细方法在体外方式。
所以在最后几分钟里,我将和你们谈谈,或者和你们讨论一些新的方法,我们一直在利用这些方法来研究线粒体在非凋亡形式的细胞死亡中的重要性。我们一直在用这种方法研究线粒体在坏死中的作用,这是几年前首次描述的细胞死亡,奇怪的是,这是一种细胞死亡形式,实际上被半胱氨酸蛋白酶抑制。我不打算详细介绍半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是如何抑制这一过程的,但这确实证明了我们可以用肿瘤坏死因子治疗细胞,而且许多细胞类型在存在肿瘤坏死因子的情况下都很好。cVAD半胱天冬酶抑制剂被联合添加,然后我们看到大量的细胞死亡,这是通过细胞色素绿的吸收检测到的,当细胞死亡时,我们吸收它,它们就会变绿。教科书上对细胞死亡的观点是,细胞死亡实际上可以分为两种形式:一种是坏死,这是一种被动的、未编程的细胞死亡形式。它不受任何蛋白质的调节。细胞凋亡显然是细胞死亡的一种活跃形式,这是程序性的。当然,关于这是否属实还有一些讨论,但传统上,细胞凋亡被认为是一种非炎症性的细胞死亡形式,而坏死被认为是炎症性的。
坏死症介于两者之间,因为它是一种具有坏死样特征的程序化细胞死亡形式。人们认为这种形式的细胞死亡实际上可能会促进炎症。因此,这是一种非凋亡的程序性细胞死亡形式,由各种刺激物引发,如病毒、肿瘤坏死、因子-病原体识别受体,毫无疑问,许多其他刺激物也可以激活坏死性凋亡。到目前为止,它们都需要激活这种叫做RIPK3的激酶。这反过来激活了级联反应中另一种称为MLKL的蛋白质,从而导致具有坏死样特征的细胞死亡。我们对细胞死亡是如何执行的感兴趣。
多年来,许多论文都暗示了线粒体坏死执行的核心作用。因此,例如,在坏死性活性氧(ROS)期间,反应性选择空间增加,这可能来自线粒体。ATP缺失,线粒体显然是细胞的动力来源,线粒体功能的丧失将导致ATP的丢失,这也意味着线粒体在坏死性坏死中的功能障碍。最近,线粒体蛋白(如PGAM5或Drp-1)与坏死细胞死亡有关,根据凋亡信号的先前形式,线粒体可能参与主动导致细胞死亡具有一定的优先性。
因此,我们对线粒体是否参与坏死细胞死亡感兴趣,实际上是从最初的电影中,我们观察了细胞坏死时线粒体的功能。所以这些细胞被一种叫做TMRE的电位染料染色,这种染料可以染色健康的线粒体,并将其染成红色。我们拍摄了这些细胞坏死时的图像,随着时间的推移,你会看到这些细胞最终破裂,然后,它们吸收进入细胞的膜联蛋白V 488,从细胞内部照亮质膜。我只想强调一下,我将重复几次,当细胞死亡时,在失去TMRE时,他们失去了膜电位。正如你所见,线粒体功能丧失是坏死性下垂的晚期事件。所以这只是从电影中拍摄的一张照片,在溶解的时候,这些线粒体仍然保留着一些膜电位。但这部电影至少没有暗示或低估线粒体在坏死中的作用。
因此,我们认为,如果我们能够提取细胞,并询问是否耗尽线粒体,它是否对坏死有任何抵抗力,这将是非常酷且非常重要的?所以我们做这件事的方法是利用帕金介导的线粒体自噬。因此,Parkin是一种E3泛素连接酶,早在2008年,Richard Youle的实验室就在哺乳动物细胞中描述了它可以引起线粒体自噬,即通过自噬过程选择性去除受损的线粒体。因此,如果你通过解偶联剂(如CCCP或FCCP)破坏线粒体的跨膜电位,Parkin会被募集到这些线粒体上,然后对它们进行ubiquinate,这会驱使它们从细胞中去除。
所以我们采用这种方法稳定地生成稳定表达YFP-Parkin的细胞系或细胞,然后用解偶联剂处理它们,然后观察线粒体含量。你可以很清楚地看到,线粒体在这里是红色的,细胞表达的是YFP-Parkin,它是绿色的。一旦用解偶联剂处理后,大多数情况下我们都无法检测到残留的线粒体。通过共焦分析,我们将其扩展到EM分析,这里用红色突出显示的线粒体是YFP-Parkin控制细胞。你可以看到它们充满了线粒体,一旦这些细胞用解偶联剂处理几天,我们就会完全耗尽大部分细胞的线粒体。因此,我们可以产生真正有效地同质消耗线粒体的细胞系。
你可以用其他多种方法证实这一点:一种是对不同的线粒体蛋白质进行免疫印迹。只有在Parkin存在的情况下,并且只有在添加解偶联剂后,我们才能看到不同线粒体蛋白质的耗竭。我认为重要的是要注意,如果你在实验室中进行这种方法,那么对不同的线粒体蛋白质进行印迹确实是有益的。例如,TOM 20被Parkin证明是泛素化的,并且在没有线粒体吞噬的情况下从线粒体中去除。因此,研究基质蛋白和膜空间蛋白非常重要。如果你影响了线粒体耗竭,这些也应该从细胞中去除。
因此,重要的是,至少一些细胞系可以在线粒体耗竭的短期内存活下来。你在这里看得很清楚。我们提取了与线粒体解偶联的表达Parkin的细胞,我们得到了有效的线粒体耗竭,我们通常在添加CCCP后40小时对这些细胞进行分析。如果我们观察一下这里的细胞存活率,细胞实际上会在耗尽后的许多天内继续存在。最终,他们都会死。
因此,我们知道它产生了一种细胞系,可以在没有线粒体的情况下存活一个学期。我们确实看到了克隆形成存活的强烈抑制,但我认为重要的是我们有这个机会窗口,在那里我们有没有线粒体的细胞,然后我们可以问不同的问题。所以我们用这个方法来问,如果我们耗尽线粒体,我们对坏死有影响吗?
这里,我们使用了安德鲁·奥伯斯特(Andrew Oberst)开发的系统,该系统位于西雅图华盛顿大学,他在那里开发了非常好的系统,可以干净地激活caspase-8并触发凋亡,或者干净地激活RIPK3并触发程序性坏死或坏死。所以这里他融合了caspase-8或RIPK3的FKBP域。在存在二聚体药物的情况下,这会将caspase-8聚集在一起,导致其激活,然后允许凋亡。RIPK3也是如此,它实际上会导致RIPK3的寡聚并引发细胞死亡。因此,使用这种方法,我们要么让细胞凋亡,要么让细胞坏死,要么让线粒体枯竭,来问如果我们去掉线粒体,它会影响细胞死亡的动力学或程度吗?
你可以很清楚地看到这些是caspase-8二聚体细胞。如果添加化学二聚体,就会触发细胞快速凋亡。然而,如果你耗尽细胞中的线粒体,然后触发caspase-8激活,你就完全阻断了caspase-9触发这些细胞凋亡的能力。这表明至少在这些细胞中,caspase-8需要线粒体参与触发凋亡细胞死亡。
另一方面,当我们对RIPK3进行二聚或寡聚时,我们会迅速出现坏死。当细胞线粒体耗尽时,你会做同样的事情,而我们看到的细胞死亡的程度完全相同。我们可以很好地量化它。这些细胞线粒体已经耗尽,并引发坏死。这些是线粒体充满并经历坏死的细胞。实际上,您可以覆盖这两个图形。真的认为线粒体消除不会影响由RIPK3直接激活引发的细胞死亡。
所以我想在最后一部分强调的是,线粒体的消除并不能防止由RIPK3的直接激活驱动的坏死,或者我们在TNF诱导的坏死后也这样做了。除此之外,我认为帕金驱动的线粒体自噬是一种强有力的工具,可以定义线粒体在任何特定生物过程中的重要性,而不仅仅是细胞死亡。因此,我们认为RIPK3独立于线粒体触发坏死,事实上,在我们的工作之后,有证据表明RIPK3通过MLKL可以通过直接引起质膜透化来触发坏死。
最后,我想感谢我实验室中那些确实在帮助这项工作的人,并继续这项工作。此外,我在本次演讲中提到,安德鲁·奥伯斯特(Andrew Oberst)开发了这些通过凋亡或坏死来杀死细胞的干净方法。最初的有丝分裂研究是在道格·格林的实验室开始的,这些人是资助我实验室的人。我想借此感谢你们的聆听,我将把你们交给大卫,他将与你们讨论一些与神学院有关的产品。非常感谢。
DB:谢谢你,斯蒂芬,你的演讲真的很棒。我相信你会从我们的听众那里听到很多问题。您好,我想借此机会告诉您更多关于Abcam可用于癌症研究的一些资源和产品的信息。
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我们目前正在abcam.com/cancer上收集不同的癌症研究资源。我们汇集了我们的产品、文章、途径以及相关的网络研讨会和活动。这是一项正在进行的工作,我们一直致力于改进这个页面。
最后,我想重点介绍一下我们即将举行的会议之一:染色体三体、集群突变和复杂染色体重排。这将于9月在马萨诸塞州剑桥市举行。如果您想了解有关此次会议的更多信息,请访问我们的网站abcam.com/events。我现在把你交给斯蒂芬,他准备回答我们在网络研讨会上收到的问题。感谢您的关注。
ST:非常感谢,大卫。所以,谢谢你们的提问,我会尽力回答其中的一些问题。一个是来自维多利亚的,那就是:我在这些实验中使用的CCCP浓度是多少?通常,我们在实验室中使用12.5µM。虽然我们一直在使用CCCP,但现在我们已经稍稍过渡到使用抗霉素a和寡霉素。原因是CCCP也会影响溶酶体功能,因此使用其他方法移动或确认我们的结果确实是有益的。
这是另一个问题:坏死下垂会引发炎症吗?我认为肯定有一些小鼠模型缺乏RIPK3,例如,我们认为坏死性下垂不会引发炎症,因此它可以减少炎症性肠病。好吧,至少,我想,这说明RIPK3是必需的。我认为对于这些暗示坏死下垂的小鼠模型是否在炎症中起作用,是否真的与坏死下垂有关,或是RIPK3实际诱导细胞因子产生的能力,仍有很多争论。所以我认为这仍然是一个有争议的问题。此外,一些实验室认为坏死下垂实际上是通过杀死细胞来抑制炎症。所以我认为,正如我所说,坏死性下垂本身是否具有炎症性仍是一个活跃的争论领域。
那么另一个问题是:在多路复用过程中,哪种探针是合适的?我认为这显然与我之前讨论过的成像方法有关,我们正在研究线粒体通透性。因此,用于PS或观察磷脂酰丝氨酸暴露的膜联蛋白V结合物有多种颜色。因此,如果你观察SMAC-mCherry从线粒体释放的图像,你肯定可以使用annexin V偶联到Alexa Fluor®488来观察磷脂酰丝氨酸的暴露。此外,还可以使用多种半胱氨酸蛋白酶活性探针:其中一种或多种基于FRET或FRET丢失,因此荧光共振能量转移,在半胱氨酸酶裂解时,信号丢失。这些通常可以与SMAC mCherry相结合,并且有一些这样的记者。为了观察质膜的完整性,简单地说PI是一种很好的化合物。当细胞发生凋亡细胞死亡时,它被迅速而有力地吸收,最终,在整个过程结束时,它们吸收PI,因此,可以再次与许多SMAC-GFP或SMAC-mCherry型活细胞成像方法复合。
我在看这里是否还有其他问题。如果一个细胞没有线粒体,它会影响细胞的其他功能吗?毫无疑问,这就是我们现在正在研究的问题,线粒体在蛋白质分泌、囊泡运输中的作用,我们很有兴趣解决这些问题。如果没有线粒体,这些功能真的会受到影响吗?不仅仅是通过线粒体提供能量的作用,线粒体是否具有与细胞器运输、细胞中的囊泡运输相关的信号功能?我认为,毫无疑问,情况会是这样的,你从细胞中去除线粒体,它会对细胞产生许多不同的影响。
我将以其他几个问题结束发言,其中一个问题是:所有的癌症治疗都是通过细胞凋亡杀死的吗?这当然也是一个有争议的问题。正如我在一张幻灯片中提到的,凋亡细胞死亡通常是细胞死亡的主要方式,但很明显,在癌症治疗期间,细胞也经常发生坏死或坏死细胞死亡。因此,如果细胞暴露在足够高水平的药物或辐射下,而凋亡可能是细胞死亡的主要方式,最终,细胞也会通过其他方式死亡。
另一个问题是:在缺乏半胱天冬酶活性的情况下,线粒体通透性是如何杀死细胞的?真的,我们不知道这是怎么发生的,我认为文献中最好的证据就是线粒体功能逐渐丧失,最终导致细胞死亡。因此,我想感谢你的提问,感谢你收听网络研讨会,我想把我自己交给大卫。非常感谢。
DB:谢谢你,斯蒂芬,谢谢你。我现在把你交给露西,她将在研讨会结束时为你做准备。
LP:谢谢,大卫。我们要感谢今天参加网络研讨会的每一个人,很快就会通过电子邮件向您发送此演示文稿的副本。如果您对今天讨论的任何内容有任何疑问或有任何技术查询,Abcam支持团队将非常乐意为您提供帮助。可以通过电子邮件发送给他们technical@abcam.com,有关相关电话号码的更多详细信息也可以在Abcam网站上找到。我们希望您发现本次网络研讨会内容丰富,对您的工作有帮助,并且我们希望欢迎您在未来参加另一次Abcam网络研讨会。再次感谢您的参与,祝您研究顺利!