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了解需要 炸薯条分析的不同表观遗传因子,并帮助您确定适合您的 炸薯条方法
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目录
染色质免疫沉淀 (染色质免疫沉淀,ChIP)是一项强大的技术,研究人员可以在自然条件下检测表观遗传调控因子与 DNA之间的相互作用。利用 炸薯条,研究人员可在整个基因组内识别目的蛋白结合的特定基因和序列,为其调控功能和机制提供关键线索。通过解析蛋白质-DNA工作炸薯条提供了对核心生物学过程和疾病病理学的见解。
炸薯条用途极广,可在多种应用中使用。从查看序列特异性蛋白结合到整体调控过程,炸薯条为研究人员提供了整合发现和绘制复杂表观遗传调控系统全貌的工具。
炸薯条在阐明基因调控、转录机器和染色质结构方面发挥了核心作用。下面是利用 炸薯条可以检测的一些关键蛋白。
转录因子
中国人
通过 炸薯条和其他方法进行的进一步研究,揭示了这些转录因子是疾病病理学背后的主要调控者,参与编排了导致癌症、自身免疫性疾病、过敏和许多其他疾病的表观遗传失调。通过识别这些主调控因子及其下游的遗传程序,炸薯条为多种疾病的诊断和治疗策略提供了新的靶标。
转录机制
炸薯条研究检测了 核糖核酸聚合酶 二以及其他转录组分的结合位点,揭示了启动子和增强子序列以及转录调控的新机制。
染色质结构
炸薯条研究在组蛋白密码的发现和表征方面起着关键作用。通过绘制特定组蛋白修饰的结合位置,并与已知的基因激活状态进行比较,研究人员已经记录了特定组蛋白残基上的乙酰化或甲基化如何影响基因激活或沉默以及高阶染色质结构。通过 炸薯条,这些组蛋白修饰特征可以用来预测表观遗传调控在特定基因组区域的那些特性。
随着新组蛋白修饰和染色质调控元件的发现,在基因组调控中,炸薯条仍然是揭示这些元件的功能及其相互作用复杂性的重要工具。
组合分析
将多种蛋白质的 炸薯条分析结合起来,是构建基因组调控全貌的有效方法。通过该方法,研究人员能够研究不同类型的蛋白及蛋白复合物如何在空间和时间上在特定基因或基因组上的特定位点进行相互作用,从而调控基因转录 (Barski等人,2007年)
炸薯条拓展了表观遗传学研究的范围和精度
炸薯条有助于在多种尺度上分析表观遗传机制,精确性极佳。下面是可以利用 炸薯条实现的内容。
局部表观遗传机制
全基因组表观遗传程序设计
动态表观遗传过程
炸薯条方案是利用抗体免疫沉淀目的蛋白及其结合的 DNA然后回收纯化 DNA并通过 PCR、微阵列或测序进行分析,以确定基因组序列和蛋白结合位置。
炸薯条流程可分为 5个基本部分(图 1):
图 1:炸薯条合作
1交联
在某些情况下,可能需要将DNA和蛋白质交联来稳定其相互作用,特别是以蛋白复合物身份参与相互作用但并不直接接触 DNA的蛋白质。交联可以在特定的时间点固定冻结这些分子间的相互作用,这种炸薯条称为交联 ChIP(X-ChIP)美国ChIP(N-ChIP)无需预先交联。
交联一般用甲醛进行,甲醛可使蛋白质与 DNA、RNA和其他蛋白质发生可逆性交联。其他化学物质,如顺铂,只能用于 DNA和蛋白质之间的选择性交联。研究 DNA和性/核糖核酸复合物之间的相互作用时,可能需要用额外的试剂进行双重交联。紫外线交联是不可逆的,因此与 炸薯条不兼容。
2. 染色质片段化
染色质必须片段化,才能进行有效的免疫沉淀,并将靶抗原精确地定位到基因组上。DNA片段的大小将最终决定基因组图谱的分辨率,因此优化片段化方案很重要。
步骤 1和步骤 2的优化对于获得最高质量的 DNA并用于后续的 炸薯条分析是非常重要的。
3. 免疫沉淀
目的蛋白及其结合的 DNA片段被免疫沉淀。利用琼脂糖微珠或磁珠将染色质混合物与目的蛋白及抗体在 4摄氏度条件下一起孵育过夜,形成微珠/抗体/蛋白/DNA复合物。然后通过离心收集蛋白质A、蛋白质G或蛋白质A/G琼脂糖微珠,或通过磁管架收集磁珠,从而免疫沉淀抗体/蛋白/DNA复合物。非特异性结合在后续洗涤过程中去除。
4.DNA回收和纯化
通过 SDS公司和加热,从微珠上洗脱抗体/蛋白质/DNA复合物。X-ChIP公司接着必须通过氯化钠和加热逆转蛋白质和 DNA的交联。然后用蛋白酶 K(K)和核糖核酸酶A降解存在的任何蛋白质和 RNA剩余的 DNA用酚氯仿抽提或 聚合酶链反应纯化试剂盒纯化。
您可以登录www.abcam.com/X-ChIP查看我们的完整 X-ChIP公司实验方案
也可以登录网址:www.abcam.com/N-ChIP查看我们的 N-ChIP实验方案
5. 分析DNA
接下来通过 qPCR、杂交阵列 (芯片上的ChIP)或新一代测序 (ChIP-seq)分析纯化的 DNA以识别并定量已被免疫沉淀的序列。这些序列被定位到基因组,以确定目的蛋白结合的基因和区域。
交联的目的在于将靶抗原固定在其染色质结合位点上。组蛋白本身一般不需要交联,因为它们已经与 DNA紧密相连。其他亲和力较弱的 DNA结合蛋白或组蛋白可能需要交联才能将固定到位。
染色质片段化差异
N-通道IP和X-ChIP公司都需要通过染色质片段化来使相互作用的蛋白/DNA复合物容易被抗体接近,可以 通过利用微球菌核酸酶或超声处理来片段化 (尼尔等人,2003年)
N-ChIP:对于 N-ChIP实验,用微球菌核酸酶进行酶消化应该足以将您的样本分解成单个核小体片段(含有大 约 175个碱基对 DNA的单体)。
• 纯化的核小体单体不适合分析转录因子及某些染色质结合子的相互作用,这些转录因子通常与核 小体间 DNA结合。建议在这些情况下进行超声处理。
• 核小体是动态的,可能在酶消化过程中重排。这会给基因组特定区域的绘制带来一定的问题,并且 任何变化都应该用合适的对照来监测(见定量 聚合酶链反应的检测对照)。在没有交联的情况下,应将 XChIP公司用作对照,以评估任何动态变化和不需要的变化。
• 酶切不会产生完全随机的染色质片段。微球菌核酸酶对基因组序列的某些区域有倾向性,造成对 DNA的消化不均匀或不相同。某些位点可能被过度表达,而其他位点可能不存在,这将影响数据 的准确性。
• 中国(压缩程度等)会更高;新的染色质样本制备过程不能简单和之前处理的其他样本相同。
X-ChIP(X-ChIP):甲醛交联限制了微球菌核酸酶等酶接近其靶点,使得酶消化在 X-ChIP公司实验中不起作用。取而代之的 是通过超声处理产生 500-700 碱(2-3 个核小体)的随机 DNA片段。
• 避免起泡,起泡会减少溶液内的能量转移,降低超声效率。超声处理也可能受到交联时间、细胞密 度或细胞类型的影响。
• 中国-80℃下保存长达 2个月,但要避免反复冻融。
• 尽管超声处理理论上不会有切割倾向性,但实际上很少如此。
•DNA片段通常较大,会影响检测的分辨率。但是,长达 1.5千字节大小片段的分辨率能实现 炸薯条的 多数目的。微球菌核酸酶消化结合超声处理可提高分辨率,对温和或不完全交联的样本可能有用。
无论选择哪种片段化方法,重要的是,在设置实验时,应始终优化片段化时间,以优化片段大小。
表 4:N-ChIP相对 X-ChIP公司的优缺点。
染色质免疫沉淀
优势
高效沉淀 DNA和组蛋白
适用于非组蛋白。可对所有细胞类型、组织和生物体进行检测。
结合特异性的可预测性更高
实现 DNA-蛋白质、核糖核酸-蛋白质和蛋 白质-蛋白质交联
高分辨率(约 175个基点/单核小体)
减少染色质重排的机会
缺点
仅适用于组蛋白
过度固定会妨碍有效的超声处理
输入染色质不同可能产生不同选择性核酸酶消化
甲醛可能改变抗原的结合特性
高浓度的核酸酶可能过度消化染色质
与 N-ChIP相比,分辨率较低
并不是所有的抗体都适合 炸薯条实验,而且很多抗体不符合 炸薯条质量要求或未经过 炸薯条应用验证。 选择合适的 炸薯条级抗体对您成功地进行 炸薯条实验而言至关重要。
如果没有市售抗体,或者您想尝试一种尚未经 炸薯条测试的抗体:
炸薯条方案和数据分析可能较为复杂,因此添加正确的对照来确保实验正常进行非常重要。
样本对照
设置未进行免疫沉淀的 输入样本对照,以便与免疫沉淀样本结果进行比较,这一点至关重要。这种比 较最终会使数据标准化,以提供可解释的结果。
对组蛋白修饰进行免疫共沉淀时,纯化的组蛋白 H3级和上半年可以作为组蛋白制备质量的阳性对照(组 蛋白 上半年常用于 X-ChIP)
抗体对照
不同的抗体对照对于确保免疫沉淀成功以及排除污染可能性而言非常重要。下面是关键对照的部分示例:
染色质重塑也可能会移动或移除特定位点的组蛋白(例如活性启动子位点)。为了确认核小体保留在特 定基因组位点,应使用针对非修饰组蛋白(如组蛋白 H3)的对照抗体。分析组蛋白修饰时,用抗 组 蛋白 H3级抗体为组蛋白研究标准化。
次聚合酶链反应对照
如果通过 定量PCR分析数据,则需要额外的对照,以确保数据分析的质量。基因组的某些区域会比其他 区域纯化效果更好,并且一些核小体在酶促断裂过程中可能发生重排。因此,针对 输入以及 炸薯条纯 化后 DNA流行音乐聚合酶链反应引物,避免虚假结果。裂解起始细胞,制备 输入并取样用于 炸薯条实验的平行对照。
此外,在 定量聚合酶链式反应阶段,对您知道应该或不应该结合目的蛋白的基因组位点进行阳性和阴性对照 定量PCR至关重要。此外,还有必要进行不加模板对照 qPCR作为阴性对照,以确保 聚合酶链反应过程中没有污染。
炸薯条方案必须对多个步骤进行优化才能达到最佳效果。以下是您需要进行额外优化的内容,优化后才 能获得最佳 炸薯条结果。
交联(仅 X-ChIP)
甲醛推荐用于可逆交联。甲醛是一种高效的 DNA-蛋白质交联剂,但不是一种有效的蛋白质-蛋白质交 联剂,因此很难对不与 DNA直接结合的蛋白质进行 炸薯条分析。其他交联剂可用于不同距离分子间 的交联。
交联过程对时间要求严格,通常是几分钟。过度交联会产生多个问题,包括抗原可及性和超声效率降 低。举个例子,抗原决定簇可能被掩盖或改变,导致抗体与抗原的结合减少。
染色质片段化
将染色质切割成适当大小至关重要。片段大小应小于 1kb地址:200-1000 bp通过 M底座酶切 将片段切割成单核小体水平(175个基点)可以实现最佳分辨率。设置酶切消化时间梯度摸索最佳消化时 间(2-30分钟)纯化 DNA凝胶电泳,以确定达到最佳 DNA片段大小的条件和时间(图 7)。 N-ChIP和X-ChIP公司都需要优化片段化时间。
图 2:超声时间梯度实验示例。对 U2OS系列细胞进行 5、 10、15和20分钟的超声处理。逆转交联并在 1.5% 琼脂糖 凝胶上电泳纯化的 DNA片段大小随着超声时间增加而不断减小。15分钟时观察到最佳片段大小。
抗体浓度
信息25-35毫克纯化核小体单体加 3-5微克抗体为起始量。对于 定量 炸薯条,您可能需要染色质和抗体等量匹配。炸薯条通常需要大量的一抗(每 微克微珠需要 1-10微克一抗)。与许多实验技术一样,必须在实验开始时优化抗体的用量。
洗涤缓冲液
确定洗涤步骤中缓冲液组分的合理浓度,通常是 250-500毫米氯化钠或氯化锂。盐和洗涤剂的浓度越 高,洗涤结果越好。但是,必须在低背景和对靶标的破坏之间取得平衡。如果缓冲液过强,会破坏特异 性抗体相互作用,导致信号偏低。如果缓冲液不够强,非特异性的相互作用将仍然存在,导致高背景。 NP-40型可作为去污剂,而 X-ChIP公司常用 RIPA公司缓冲液。
标准 炸薯条工作流程需要大量的细胞。需将约 106完107个细胞作为起始材料,如果低于该细胞量, 检测会受到高背景结合、低富集效率和富集文库复杂性丧失影响。但是,获得这么大的样本量很难,特 别是在检查像转基因小鼠组织或临床样本这种珍贵的样本类型时。可以应用一些策略解决样本含量少 的问题。
1提高富集效率,最大限度地减少样本损失
对 炸薯条工作输入样本的样本损失 (Mao等人,2013和Dirks等人,2016)
阿布卡姆的高灵敏度 炸薯条检测试剂盒采用独特的嵌合蛋白来捕获抗体/蛋白/ DNA复合物,具有以下显著优势:
2读数和下游数据处理平台
除了检测本身,下游处理(即测序、阵列或 PCR)信息分析
组织 炸薯条
检查特定组织中的表观遗传机制可以揭示组织特异性遗传编程、发育和生物过程的基本要素。炸薯条可 作为检测组织特异性转录因子、基因活化和表观遗传调控的其他方面作用和机制的有效工具。对组织 样本进行 炸薯条需要专门的染色质制备方案,以确保 输入材料的质量和可靠的结果。
所需的组织用量取决于蛋白质丰度、抗体亲和力和交联效率。每次进行 炸薯条测定时,使用 5-15微克染 色质优化以下方案,每次 炸薯条大概准备 30毫克肝组织。开始 X-ChIP公司检测之前,应确定每种组织类 型的确切染色质浓度。
点击此处查看我们来自组织样本的 炸薯条缔约方
即使进行了优化,首次实验的结果也可能不尽完美。您可以在这里找到一些常见问题及其相应的解决方案。
不加抗体对照中出现高背景
潜在问题
解决方案
与微珠非特异性结合
增加额外洗涤或者免疫沉淀之前将超声处理的染色质与 蛋白质A/G微珠一起孵育 1小时进行预清除步骤
微珠背景高
尝试不同品牌的微珠和不同的封闭策略,了解哪种微珠和策略在您的对照中提供的背景最低
洗涤缓冲液受污染
更换缓冲液
信息
细胞未有效裂解
RIPA公司缓冲液应该有良好效果
起始材料不足
炸薯条通常需要大量的 输入每种 IP(IP)条件下至少有 25微克染色质(3-4 百万个细胞)
染色质片段可能太小
琼脂糖凝胶电泳,确保大小正确,必要时再次优化片段化
抗体不足
通常 3-5微克即可,但如果未观察到信号,则可能需要高达 10微克
单克隆抗体可能不适合,特别是对 X-ChIP公司而言,因为交联可能会掩盖表位
尝试多克隆抗体或 炸薯条级单克隆抗体
洗涤缓冲液过强,消除了特异性抗体结合
缓冲液中的氯化钠不得超过 500毫米如上所述,应对洗涤缓冲液进行优化
亲和微珠选择错误
确保抗体种类和亚型与选择的微珠结合或使用 蛋白质A/G混合微珠
如果使用的是 X芯片胞胞胞胞胞胞胞胞胞胞胞胞胞胞胞胞IP(IP)过程中 DNA的下拉
分析 DNA亲和力较弱的蛋白质可能需要 X-ChIP、以保持蛋白质与 DNA的交联
此外,还需优化交联的时间
注:信号低可能是真的,而且目标区域没有抗体富集。
添加阳性对照抗体和位点,确认 炸薯条有效。
抗原可能存在,但不结合在预期的基因组位点。
整个较大区域内,分辨率低且背景高
DNA片段可能过大
片段大小应小于 1kb但最好为 200-1000 bp通过 M底座酶切将片段切割成单核小体水平 (175个基点)可以实现最佳分辨率。琼脂糖凝胶电泳确认,必要时进一步优化染色质片段化步骤。
聚合酶链反应我很高兴
聚合酶链反应后,所有样本出现高信号,包括不加模板对照
定量PCR溶液可能被污染
采用储备原液制备新溶液
样本中无 DNA(美国)
还有哪些处理可能会影响我的 炸薯条嗯
一、SDS公司的影响。添加 TSA、丁酸盐或秋水仙胺一般不会影响 炸薯条。
请勿在高转速(不超过 6000转/分)下离心琼脂糖凝胶微珠,高转速会压缩并损坏微珠。
炸薯条结果分析
一旦拉下的 DNA片段被免疫沉淀和纯化,可以通过不同的方法对其进行分析。
定量PCR
利用基因或靶标特异性引物扩增纯化 DNA中已知的靶标位点
局限性:
芯片上的ChIP
采用微阵列检查整个基因组内多个目标位点、特定结构域等的存在。扩增下拉样本和对照样本 DNA并用互补荧光探针标记。合并样本并与目标微阵列杂交。荧光信号的比率表示目的蛋白已经结合的富集区域。
ChIP序列
最常用的全基因组分析方法是提高碱基对分辨率,没有 芯片上的ChIP所遇到的限制。扩增下拉 DNA和对照样本 DNA然后对片段进行高通量测序,再将其与基因组进行比对。重叠片段形成一个峰,代 表目的蛋白与基因组结合的位置。
图三:ChIP序列概述。进行 炸薯条后,将沉淀的 DNA用于文库制备、测序,然后将获得的序列定位到参考基因组上, 接着再进行峰检测,以确定目的蛋白的结合位点。
数据分析
应针对起始材料的量不断进行数据标准化,以消除样本量不均匀引起的误差。若要标准化数据,取最 终扩增子值,并将其除以 输入的扩增子值。对于组蛋白修饰,除了 输入量可以来标准化,相应组蛋 白免疫沉淀量也可以作为标准化参照。例如,通过 H3K4me3型抗体进行的 炸薯条可以用 输入量和组蛋 白 H3级免疫沉淀量标准化。
测量(和质量)是有效解释结果的关键。
使用在线软件进行 ChIP-seq公司数据分析的教程
虽然 ChIP序列数据分析可能很复杂,但它可能是实验中最重要的部分。稳健的数据分析是获得准确、 可靠结果的关键。在线工具为生物信息学专家和实验室生物学家提供了分析数据的机会。 本分步指南说明了如何从 ChIP-seq公司数据中提取可靠的结果,以及如何解读数据集,从而成功进行 ChIP-seq公司分 析 (Hurtado等人,2010年,Yan等人,2013年)更多信息此处查看 阿布卡姆的数据分析网络研讨会。
本次网络研讨会涵盖了 炸薯条数据分析的以下步骤:
1测序读段 QC(快速QC)
2读段比对/匹配 (银河系/领结)
三。峰检测 (Galaxy/macs)
4结合信号可视化(UCSC基因组浏览器)
5.重新开始基序查找(MEME-ChIP)
6结合位点的基因本体分析 (很棒)
7结合信号的热图生成 (seqMINER)
参考文献
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