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回顾染色质和炸薯条的实验方案的简要介绍,包括相关出版物中被用于绘制基因组区域和组蛋白修饰的ChIP、ChIP-on-ChIP和ChIP-seq公司的重点。
大卫·格罗茨基目前是 阿布卡姆的表观遗传学专家。
他在圣路易斯的华盛顿大学获得了分子遗传学和基因组学博士学位。他的博士论文专注于研究DNA修复因子的调控以及它们如何影响肿瘤细胞的基因组稳定性和增殖。
欢迎参加 阿布卡姆的“ChIP应用”在线讲座。今天的主讲人是 大卫·格罗茨基大卫在圣路易斯华盛顿大学取得了分子遗传学和基因组学博士学位。他的博士论文重点研究 DNA修复因子的调控以及其对肿瘤细胞的基因组稳定性和增殖的影响。大卫嗯阿布卡姆科学支持部门的表观遗传学专家。今天和 大卫一起进行讨论的还有 阿布卡姆一抗产品经理 肯·哈米尔肯已经在 阿布卡姆工作七年了。他毕业于麻省理工学院生物化学系,随后在波士顿大学获得了工商管理硕士学位。现在就由 大卫开始本次在线讲座。
数据g:感谢 维姬,非常感谢大家参加这次在线讲座。首先,我想简单介绍本次在线讲座的主要内容。我首先要介绍染色质结构和修饰,然后简述 炸薯条基本实验方案。接下来我要介绍在 2000年首次提出的组蛋白密码假说,然后讲解 ChIP-qPCR数据,再回顾一些采用 炸薯条芯片-基于ChIP分析染色质修饰和基因组结构的论文。接下来,我将讨论一些使用 ChIP-seq公司测序 技术的论文,最后讲一下由 炸薯条实验方案延伸而来的最新实验方案。
那么,什么是染色质?在人类基因组中,有大约 32亿个 DNA碱碱DNA长约 5英尺。因此,DNA只有被紧密地压缩成一个称为染色质的高阶结构,细胞核才可以容纳 DNA染色质也是控制基因表达的一个重要因子。核小体是染色质的基本结构单位,每个核小体由146个基点的DNA缠绕组蛋白八聚体近两圈形成。核小体由H2A、H2B、H3、H4四种组蛋白组成,每种组蛋白各有两个拷贝。组蛋白 上半年位于该结构的顶部,用于固定缠绕的 DNA这种“串珠”结构称为常染色质。当多个核小体进一步压缩,缠绕成 30纳米的纤维,就形成异染色质。最后,在有丝分裂中通过更高水平的包装形成中期染色体。
我之前提到的组蛋白可能有很多翻译后修饰,这会影响他们与DNA的相互作用。组蛋白H3级和H4型是最常见的修饰组蛋白,组蛋白的 N个-端尾部从核小体的中心向外延伸,大量氨基酸残基就很容易被化学基团所修饰,如乙酰化、甲基化、磷酸化、脱氨与泛素化。也有一些组蛋白变体修饰,比如组蛋白H2AX型第139位丝氨酸磷酸化,可作为DNA损伤标记物。特定修饰对基因转录有不同的影响,我们稍后会看讲到。
-DNA相互作用位点,开发了染色质免疫共沉淀 (ChIP)技术。在 炸薯条中,用甲醛将 DNA交联到蛋白质上。,而随后再通过超声处理将 DNA打碎成含 200-1000 个碱基对的片段。在某些情况下,当蛋白质与 DNA的结合相当紧密时(比如核小体),则无需进行交联,这叫做自然 炸薯条。在自然 炸薯条中,使用微球菌核酸酶将 DNA分解为单染色核小体大小的 DNA片段。接下来,添加靶标的特异性抗体,使其与靶蛋白质 - DNA复合物结合发生免疫沉淀反应,只把直接结合到靶蛋白的 DNA片段拉下来。经过几轮清洗后,如果发生了逆转交联,则消化蛋白质和 核糖核酸如果是DNA可以被纯化用于后续分析。通过与 输入DNA含量或起始染色质含量进行比较来确定拉下来的 DNA丰度。
现在我们大概了解了 炸薯条,我想展示 1988年的一个早期 炸薯条实验,这是第一批确定组蛋白乙酰化和转录活性激活之间的联系关系的研究之一。在这里,作者开发和分出了一种个对抗H4型乙酰化组蛋白 H4型中国15日龄鸡胚红细胞中分离出染色质,并用微球菌核酸酶分解片段化 DNA用抗体孵育后,因为这时还没有蛋白质A或蛋白质G磁珠,作者用福尔马林固定的金黄色葡萄球菌细胞进行免疫沉淀,因为该细胞外膜具有活性蛋白质A然后他们对 DNA进行斑点杂交,每个点统一上洋量为500 ng DNA条款三阶段实验中染色质的 用α-D-珠蛋白球蛋白探针进行 南方印迹杂交。α-D-珠蛋白球蛋白在这些细胞中被转录激活。如图第 5列所示,作者在含有H4型乙酰化组蛋白 H4型抗体的结合组分中发现了非常高的 α-D-珠蛋白球蛋白信号,,这表明H4型乙酰化组蛋白 H4型结合于非常活跃的基因座位点。
因此,在我刚刚展示的这个图的第一部分,作者发现H4型乙酰化组蛋白结合于活性 α-D-珠蛋白球蛋白基因座位点。他们将这些结果与失活的卵清蛋白卵清蛋白基因位点进行了比较。正如您在第 5列看到的,和 输入相比,结合组分中未发现增强的卵清蛋白卵清蛋白信号,这表明H4型乙酰化组蛋白 H4型不存在于结合卵清蛋白位点卵清蛋白。总的来说,这些结果表明, H4型乙酰化组蛋白结合在进行活性转录的基因而不是失活基因。
我展示的这项研究以及许多其他研究表明,不同的修饰组蛋白修饰与转录激活和抑制特异性相关,科学家们开始好奇,这些修饰是否会在基因组结构和功能中起到更多作用。所以在这里我想介绍一个概念,即 2000年由 布莱恩·斯特拉尔和 大卫·艾利斯第一次提出的组蛋白密码假说。这一假说提出,特定的修饰组蛋白修饰将有助于招募其他蛋白质来改变染色质结构或影响转录。在这个概念中,他们给出了当时功能已知的常见修饰组蛋白修饰,以及相关或有相互作用的所有已知蛋白质。事实证明,最初提出的组蛋白密码是非常复杂的,影响蛋白质招募和转录调控的修饰组蛋白有非常多可能的组合。目前为止,科学家们已经取得了巨大的进步,并鉴定出了许多组蛋白翻译后修饰的功能,而组蛋白密码假说至今还是备受争议的研究热点。
随着新技术的涌入,我们已经能够利用 炸薯条进一步研究修饰组蛋白修饰和其他 DNA结合蛋白的功能、以及整个基因组结构。分析 炸薯条数据的最常用方法包括ChIP-qPCR、ChIP-芯片、ChIP公司-测序。
我想简要介绍一个从 定量PCR获取炸薯条结果的例子。在这里,我将展示经我们实验室测试的一种抗体 — 组蛋白 H4型第 8位赖氨酸K8公司乙酰化组蛋白抗体的数据。拉下结合于H4K8型乙酰化组蛋白 H4型的 DNA后,用引物 定量PCR扩增 左边三个三个具有转录活性的基因(左边三个)和右边 三三(右边三个)。H4K8型乙酰化组蛋白与基因激活有关,所以你可以看到,乙酰化组蛋白的三 三个活性基因的 输入对比丰度高于失活基因。ChIP-qPCR是目前最常见的 炸薯条实验分析方式,需要主要针对有一个特定 的聚合酶链反应我觉得这是一个很好的例子
我们可以使用 ChIP-on-ChIP芯片进行全基因组 炸薯条分析,如图所示。例如,在 ChIP-on-ChIP芯片中,我们可以利用微阵列技术在整个基因组中确定组蛋白 人3第 4位赖氨酸K4型三甲基化组蛋白的存在与否。在 ChIP-on-ChIP芯片中,炸薯条程序实验过程正常执行,直到 DNA纯化出来。在这时,免疫沉淀的 DNA被扩增并标记上周期5荧光探针。输入DNA也被扩增并标记上互补Cy3(Cy3)荧光探针,两组标记 DNA都同时结合并杂交至对应的特定结构域、目标基因座位点、甚至是全基因组的微阵列上。通过 ChIP DNA和对照 输入DNA的荧光标记信号比率可以识别富集区域。
这里有一个早期 ChIP-on-ChIP芯片实验案例。作者分析了酿酒酵母全基因组的乙酰化和甲基化组蛋白模式型。他们使用靶向乙酰化组蛋白 H3、H4乙酰化组蛋白 和组蛋白 人3第 4位赖氨酸K4型二甲基化组蛋白的抗体进行染色质免疫沉淀。本研究中所用的微阵列适用于编码区的开放阅读框,或含有该基因启动子的基因间隔区。这个图表明,人3和 H4型乙酰化组蛋白在启动子区富集程度最高,在编码区的富集程度也很高,而组蛋白 人3第 4位赖氨酸K4型二甲基化组蛋白不在启动子区富集,但在编码区的富集程度较高。
由于这是一个早期的 ChIP-on-ChIP芯片实验,他们使用了传统的 ChIP-PCR公司来验证结果,这是普遍有效的方法。他们用在靶向活性转录基因 SUB2、MNN9、YHM2的抗体进行 ChIP-PCR、在 A类图可以看到,组蛋白 H3级乙酰化组蛋白 在 子2处乙酰化,其在子2启动子区的富集程度高于编码区,而第 H3K4型位赖氨酸二甲基化组蛋白在子2编码区的富集程度高于启动子区。B图中 MNN9型和 YHM2型的情况也相同,这验证了 炸薯条意大利面-基于ChIP实验所发现的结果。
几年后,改进后的 ChIP-on-ChIP公司芯片可提供更高特异性和更高分辨率的结果。在这篇论文中,作者使用 ChIP-on-ChIP公司芯片鉴定了人类基因组中的活性启动子。他们定位了 核糖核酸聚合酶 Ⅱ 转录前起始复合物的结合位点,这个复合物包括 核糖核酸聚合酶 二、TFIID转录因子 二维和其他通用转录因子。他们采用识别复合体TFIID公司复合体中 TAF1型亚基的抗体对 TFIID公司结合 DNA进行染色质免疫沉淀,然后通过微阵列杂交展示出人类基因组中的所有非重复 DNA结果发现了 12150个 TFIID公司结合位点。你可以在 B图中看到一个数据案例,最高峰对应基因的转录起始位点,另外有一个展示 我们将TCFL1公司基因位点 启动子峰的处放大可以看到 TAF1通道数据近视图TCFL1公司启动子处的峰图。
研究人员将 炸薯条得到的 TFIID公司结合位点与已知转录的 5’端相匹配,发现其中 83% 是位于转录本起始位点的 附近500碱C类所示。这 9328个 DNA序列被定义为启动子。如图 D类和图 E类所示,这些启动子与匹配到 8960个 EnsEMBL公司基因和 5118个已知启动子匹配,分别如图 D类和E类所示。进一步分析后,作者定义了 1239个与已知转录单位无关的可能启动子,这些启动子不能匹配到已知的转录单位。如图 F类所示,这些假定预测的启动子的大部分都显著富集已知的启动子序列,如 CpG公司岛、起始因子元件和下游的启动子元件,如图 F类所示。
有趣的是,这项研究还表明,许多基因含有两个或两个以上的活性启动子。该图作者深入解剖析了 WEE1号机组观看2个 TFIID公司结合位点。每个启动子对应 2个不同 信使核糖核酸转录本物的 5’端,第一个转录本物编码全长 WEE1号机组基因,而另一个转录本物仅编码激酶结构域。如图 B和图 C、在 90国际货币兑换率细胞不同时期群体和细胞周期同步化群体中对两个转录本物进行检测,如图 B和图 C、较短的转录本物在 G0级中国G0级和 S公司期最常见。这些结果表明,WEE1号机组基因的这两个启动子可能具有不同的细胞周期功能。
在另一项非常有趣的研究中,ChIP-on-ChIP公司芯片被用来反映射启动子的修饰组蛋白与启动子的结合修饰。在这篇论文中,研究者采用了 ChIP-on-ChIP公司芯片分析人类基因组的 30兆碱基,探究启动子和增强子区域的染色质特征。他们观察了核心组蛋白 人3和H3级乙酰化组蛋白 H3、H4乙酰化组蛋白 H4型以及第 4位赖氨酸H3K4型单、双、三甲基化组蛋白 H3、他们也对 核糖核酸聚合酶 二和 TAF1型进行了 炸薯条用于识别活性启动子,正如我前面提到的,TAF1型是 TFIID公司转录因子的最大亚基,。用于识别活性启动子,他们同时对 第300页进行 炸薯条来识别活性增强子。图 A类显示的热度图中红色是修饰富集区域,图 B显示的是四类基因基于转录活性的热度图量化,其中 第1页是低转录,第4页是高转录。作者发现核糖核酸聚合酶二和TAF1型结合的 核糖核酸聚合酶 2和 TAF1型观看H3级组蛋白的结合,说明转录调控因子结合位点缺乏核小体。此外,你可以看到组蛋白 人3第 4位赖氨酸K4型组蛋白自转录起始位点处,依次由三单甲基化转变为双甲基化、单三甲基化时,富集的DNA且迅速偏向在起始位点下游区域向起始位点靠近,尤其是三甲基化 H3K4从图中我们还可以看到H3级乙酰化组蛋白 人3和H4型组蛋白 H4型的富集。
为了研究增强子处的染色质特征,作者观察了 300页结合富集 DNA附近 10000个碱基区域。第300页是普遍存在于能够结合增强子处的乙酰转移酶。从数据中我们看到,在增强子处缺乏没有组蛋白 人3组蛋白的结合,这表明该位点缺乏核小体,这与我们在启动子处的观察结果类似。单甲基化 H3K4型单甲基化组蛋白显著富集在所有缺乏三甲基化 H3K4型三甲基化组蛋白富集 的增强子处,这与我们在启动子处的观察结果有很大的不同。在一些增强子中,H4型乙酰化 H4、H3乙酰化 人3和H3K4型和二甲基化 H3K4型组蛋白均有不同程度的存在富集,核糖核酸聚合酶 2二和 TAF1型也以较低程度存在。然后,作者使用这些在启动子和增强子处发现的染色质特征来高准确性地预测这些原件在基因组中的位置。
ChIP-on-ChIP公司芯片有一些局限性,但随着技术的进步,这些问题将不再是问题。首先,ChIP-on-ChIP公司芯片实验需要大量的细胞。其次,ChIP-on-ChIP公司芯片并非对人类基因组中的所有重复序列不敏感。另外,另一个问题是,要想覆盖整个基因组必须进行大量的微阵列,。最后一个问题是,ChIP-on-ChIP公司芯片可能会受到 DNA扩增后的扩增偏倚影响。
在,在2007年研发出了 ChIP-公司下一代测序 (ChIP-seq)技术,成为全基因组芯片分析的一个非常强大的工具。我从首次描述该项技术的论文中提取了 ChIP-seq公司测序流程图。作者用微球菌核酸酶分解染色质后进行自然 炸薯条,我不得不插一句,这个研究中的大多数抗体都来自 阿布卡姆免疫沉淀后收集 DNA后进行免疫沉淀,将接头蛋白加到 DNA末端,然后进行限制性 聚合酶链反应扩增和聚类,而最后则是下一代测序。产生的短序列可以被映射比对到基因组。
美国ChIP-on-ChIP公司芯片相比,ChIP-seq公司测序最大的区别和最好的改进就是 ChIP-on-ChIP公司芯片无法比拟的碱基对分辨率。ChIP序列测序也避免了我之前提到的 炸薯条芯片-片上的许多局限性。在图中我们可以看到黑腹果蝇细胞中染色质蛋白 色谱仪的结合模式位点。你可以清楚地看到,上方蓝色图片中的 ChIP-on-ChIP公司芯片数据峰值更宽,而红色图片中 ChIP-seq公司测序数据峰值更窄、碱基对分辨率更高。
如果我们回到 2007年的这篇 ChIP-seq公司测序论文中,可以看到修饰组蛋白修饰的高分辨率图谱。作者将修饰组蛋白修饰与其他一些蛋白质(如 核糖核酸聚合酶 二)的结合,与人类静息 CD4细胞阳性 T型细胞已知表达水平基因(其表达水平已知)联系起来。他们将基因按表达水平分为高、中、低或沉默基因,由不同的颜色表示,并且将其相对于转录起始位点对齐排列。这数据和 ChIP-on-ChIP公司芯片的结果非常类似:转录起始位点缺乏核小体缺乏区域就在转录起始位点,修饰组蛋白的双峰分布在起始位点附近,以及修饰组蛋白修饰结合偏向起始位点的 5’端。我们再一次看到,从转录起始位点开始存在着 H3K4型美国E类所示,H3K27型三甲基化组蛋白果然在失活启动子处富集,但有点出人意料的是,如图 F类所示,单甲基化 H3K27型单甲基化组蛋白存在结合于活性启动子中。
在这个图中,作者将修饰组蛋白修饰与表达水平关联起来。他们根据表达水平将基因分成 100组,可以看到从左到右按表达水平高低画出的黑虚线。然后,每个修饰组蛋白修饰标签密度相对于表达水平作图。在图 A类中,大家可以看到 H3K4型水H3K27型二甲基化和三甲基化组蛋白与基因抑制相关,而H3K27型单甲基化组蛋白则与基因激活相关。H3K36型三甲基化组蛋白也与基因激活相关,而 H3K79型三甲基化组蛋白与基因抑制相关,这有些出人意料,因为这些个修饰组蛋白与酵母中的基因激活相关。
整合我迄今提出的数据和所有关于修饰组蛋白修饰的证据,可以勾画出修饰组蛋白修饰的“仪表盘”。这里我列举了一些修饰组蛋白,其中有结合在启动子上的特异性修饰组蛋白,这取决于启动子是否处于活跃、稳定或不活跃的状态;还有结合在基因内的特异性修饰组蛋白及结合在增强子的修饰组蛋白。正如我们之前看到的,H3K4型甲基化和乙酰化组蛋白结合在活性启动子和增强子上,而 H3K9型二甲基化和三甲基化组蛋白结合在非活性基因中。可以看到在基因、增强子以及标志着大规模抑制的修饰处存在的失活、静息、活性基因启动子的特定修饰。H3K4型修饰和乙酰化常见于活性启动子和增强子,H3K9型二、DNA甲基化、核纤层相关结合结构域、多梳体和 LOCKs(锁定)或大型染色质 K(K)修饰等实施 炸薯条来进行测量。
炸薯条是一个非常强大的工具,可以产生非常多的数据。现在请大家看一个活性基因的表观遗传学数据,这些数据是通过进行 炸薯条测序分析数千个已知活性基因获得的,以确定修饰组蛋白结合位点。转录发生时,随着聚合酶沿着 DNA移动,组蛋白修饰剂引入并激活修饰组蛋白。启动子区域有非常明确的染色质标记,核小体缺失区域非常清晰,聚合酶在这里结合并极大地促进了对 H3K4型甲基化和乙酰化组蛋白的激活。这是另一种我认为能很好地呈现活性基因上组蛋白修饰的方法。组蛋白修饰物与 核糖核酸聚合酶 2相互作用,当聚合酶沿着 DNA小时候H3K4型修饰和乙酰化的、划分明确的启动子区。大家可以清楚地看到,通过所有 ChIP-on-ChIP公司芯片和 ChIP-seq公司测序数据给我们提供的大量信息,可以了解基因组不同部分发生的修饰组蛋白结合修饰情况。
一个名为“编码项目编码“的大型项目代表了 DNA序列原件的百科全书,一直致力于促进多个研究小组与国家人类基因组研究所的合作。这个项目的目标是建立一个人类基因组中功能元件的综合列表。你可以通过 UCSC公司基因组浏览器浏览数据。在这里,我们看到伸展开来的 21号染色体,在下面上部您可以看到上面红色标记在这个位置存在的基因,内含子和外显子分别被标出,还可以看到 单核苷酸多态性、RNA测序后确定的转录水平、H3K27型乙酰化中国IP H3K27水平数据、DNA酶1超敏位点、转录因子 炸薯条数据等信息。您可以选择您想要和不想要的信息。
编码编码项目还有一个目标,就是创建 ChIP-seq公司测序指南来规范所有这一类型的实验。他们建议在 ChIP-seq公司预测2000万读取实验的重现复性显然是重要的,他们建议至少进行两次实验以确保再现性。该协会也有质量控制指南,推荐使用交叉相关分析来评估 ChIP-seq公司测序实验中的信噪比。最后,他们推荐使用 ChIP-seq公司测序数据报告指南来确保所有实验室之间实现数据共享。他们指出,所有的 ChIP-seq公司测序数据都应提交至公共数据库。
到目前为止,我已经介绍了 ChIP-qPCR、ChIP-on-ChIP是的ChIP-seq公司测序及这些 炸薯条数据的读取结果。现在我想介绍一些最近出现的 炸薯条延伸实验方案。自第一次引入 炸薯条应用以来其主要问题是,每次沉降 (下拉)实验需要大量初始细胞和染色质,但是现在有一套能够以极在abcam公司提供一套能够以极低的细胞数进行 炸薯条的试剂盒和实验方案。炸薯条的另一个问题是,每个实验的周期长达数天,现在abcam公司有一种试剂盒能让你在 5小时内就完成 炸薯条。
ChIP-停止是 炸薯条和染色质构象捕获的结合,通常被称为 3C、3厘米用于识别长片段 DNA的相互作用,有了 ChIP-停止你可以找出由特定目的蛋白介导的相互作用。首先进行细胞交联、DNA限制性酶切,然后利用抗体对染色质进行免疫沉淀。随后连接 DNA片段,逆转交联得以逆转,然后再进行 DNA纯化。最后可通过 定量PCR检测相互作用。
ChIA-PET公司是指用配对末端标签测序法进行染色质相互作用分析。这基本上是全基因组 ChIP-停止在连接步骤,链接序列被添加到 DNA末端以创建相互作用区域库,然后可以使用下一代测序进行测序。
ChIP外部可通过移除任何不直接结合蛋白质的 DNA精确检测结合到单核苷酸上的蛋白质。免疫沉淀后,向 DNA添加 聚合酶链反应接头,用 5’端到 3’端外切酶分解蛋白质 - DNA复合物中突出 DNA的 5’端尾巴。发生逆转交联后,再利用第一个接头的引物扩增 DNA向 5’端添加第二个接头,并对产物进行测序。接头之间的所有序列都是目标蛋白的精确结合位点。
最后是 ChIP-BS-seq该方法是在 炸薯条后进行亚硫酸氢盐测序,以查看特定修饰组蛋白修饰或目标染色质结合蛋白区域的 DNA甲基化。完成 炸薯条后,DNA经亚硫酸氢盐硫化处理并进行测序。
现在大家可以看到,基于 炸薯条衍DNA-蛋白质相互作用的强有力的工具。我要感谢大家参加此次在线讲座,我希望这次讲座对大家是一次有趣和翔实的体验。现在,就由 肯向大家介绍一些优秀的 阿布卡姆表观遗传学产品。肯的介绍结束后,我会回来回答你们的一些问题。
韩国韩元:谢谢 大卫这么清晰的介绍。我相信听众会提出很多有趣的问题。现在我想花几分钟时间介绍一些 阿布卡姆为研究者们提供的激动人心的 炸薯条产品,并且重点介绍大家可能感兴趣的技术资源和即将举行的会议。
比起常规 炸薯条方法,阿布卡姆的 炸薯条试剂盒有一些关键优势。首先,反应发生在 96孔板中,所以很容易进行规范化操作,而且非常适合于高通量应用。您的实验只需要 5小时。试剂盒包含所有必要的试剂(除了交联试剂)。沉淀 DNA可以直接用于后续分析,如 ChIP-on-ChIP芯片或 ChIP-seq公司测序等 大卫刚才介绍过的技术。
新技术炸薯条已进行专门优化,特别适用于样品数量有限的 炸薯条分析。例如,处理患者样本、转基因小鼠组织或干细胞的情况。使用高灵敏度 炸薯条试剂盒,每次反应您只需 2000个细胞或 0.5毫克组织便能获得富集的目标序列。此外,仅用 5个小时就能得到实验结果,所以实验可以在一个工作日内完成。
我们还提供甲基化 DNA免疫沉淀试剂盒。这些试剂盒包含高度特异性抗体,用于富集甲基化和羟甲基化 DNA这些修饰与不同的基因表达相关,因此,需要有适当的工具来研究其功能。我们的免疫沉淀试剂盒还可以完善常规 DNA甲基化实验,如亚硫酸氢钠修饰不能区分甲基化和羟甲基化胞嘧啶。
最后,请记住,投入决定回报,所以成功的 炸薯条实验离不开良好的起始材料。精心设计的 阿布卡姆染色质提取试剂盒,可制备 炸薯条实验所需的染色质。不到 1小时,您从细胞或组织中提取的染色质就可以用于 炸薯条实验了。
如果你想了解更多有关不同技术和应用的信息和知识点,欢迎您随时访问我们的在线讲座资料库,观看您所需的在线讲座录像。请访问 www.abcam.cn/webinars网站。
最后,我想借此机会向您推荐即将举行的两个 阿布卡姆会议,您可能会感兴趣。首先,我们将举办名为“非编码 核糖核酸在进化、表观遗传学和治疗应用中的作用”的免费会议。本次会议将于 2015年 1月 15日在新加坡基因组研究所召开。如果你想加入我们并展示您的研究成果,我们正在招募展示摘要。有关会议的更多信息及报名方法,请访问活动网站 www.abcam.com/singapore2015
第二节“信号转导前沿大会”将于 2015年 6月 21 - 24 日在上海举行。您可以获取讲座内容以及注明讲座地点的海报,还可以在在线报名时提交您的摘要。更多信息请访问 www.abcam.com/cellsignaling2015
事不宜迟,这里交给 大卫他将回答我们在讲座期间收到的问题。
总经理:谢谢 肯中国人炸薯条与自然 炸薯条的主要区别和优缺点是什么?一般来说,当蛋白质 - DNA相互作用不是很强烈时,建议使用交联 炸薯条,举个例子,观察与 DNA结合的转录因子或大分子蛋白质复合物的情况。对于甲醛,建议进行交联 炸薯条,因为甲醛形成的交联是可逆的。染色质经超声处理后形成长短不一的片段,每个片段含 200 - 1000 对碱基对。交联 炸薯条在这里
当蛋白质 - DNA相互作用较强时,建议使用自然 炸薯条,比如观察组蛋白和组蛋白修饰的情况。在自然 炸薯条中,使用微球菌核酸酶分解染色质以产生单体大小的片段,大约是 175对碱基对。这是在 炸薯条实验中可能达到的最高分辨率。自然 炸薯条也没有交联可能造成的抗原表位遮蔽。自然 炸薯条的缺点是不适用于非组蛋白,并且核小体可能在消化期间发生重排。
另一个问题是:炸薯条实验有什么好的对照吗?在抗体对照方面,对于活性基因的阳性对照,可以使用抗组蛋白 人3第 4位赖氨酸三甲基抗体,而对于失活基因的阳性对照,可以使用抗组蛋白 人3第 9位赖氨酸三甲基抗体。一般的组蛋白抗体,如抗组蛋白 人3抗体,也可以是一个很好的阳性对照,这也是将组蛋白修饰按照组蛋白含量进行归一化的重要方法。对于阴性对照,可以使用无抗体添加的磁珠、相应的 免疫球蛋白G同型对照、或靶向非染色质靶点的抗体((希腊语)GFP公司抗体)。对于 聚合酶链反应对照,应该包括一个不包含 DNA的无模板对照,以及目标蛋白应当结合位置以及目标蛋白不应结合位置的引物对照。
现在看来,我们还可以回答一个问题,这个问题是:在 ChIP-seq公司之前如何验证抗体?编码项目已经提出了指南,我刚才也谈到了抗体验证。他们认为,第一步是通过蛋白质印迹法或免疫荧光法来检测抗体。下一步他们推荐以下 4种方法之一的抗体检测:在靶蛋白敲除细胞中验证、免疫沉淀加质谱验证、针对目标蛋白不同部位的多个抗体进行免疫沉淀、或表位标记蛋白进行免疫沉淀。之后抗体就可以用于 炸薯条和 ChIP-seq公司测试ChIP系列
好的,感谢 大卫和 肯的精彩介绍。如果您对本次在线讲座的讨论内容有任何问题,或有任何技术方面的咨询,我们的科学支持团队很高兴为您服务。您可以通过cn.technical@abcam.cn 联系他们。我们希望大家在今天的讲座中能收获到对自己有帮助的东西。我们期待您参加下一次在线讲座。