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了解使用 CRISPR/案例9系统进行基因编辑如何有效创建敲除细胞系,以及该技术的优势和注意事项。
人类基因组完整序列的确定可以帮助研究人员识别疾病特异性突变,探索多种遗传疾病的基础,还可以激发研究人员移除和修饰特定基因以研究其功能的愿望。
在特定蛋白缺失的情况下,检测信号通路运作和异常可以深入了解该蛋白发挥的作用。它可以发挥直接的功能性作用,也可以作为反馈调节过程的一部分。此外,高度精准地敲除特定基因可以促进基因疾病模型的开发,从而为新的治疗方法和新的基因疗法提供参考。
利用一系列 DNA切割技术(例如锌指核酸酶(采埃孚)和总资产效应子核酸酶(人才)可以对基因序列进行初步修饰。但是,这些技术既复杂又耗时。CRISPR/案例9基因组编辑技术的发现大大提高了基因编辑的特异性。该技术进一步提高了DNA编辑的潜力1。
规律成簇的间隔短回文重复(更脆)是指组成细菌适应性免疫系统的 DNA该短回文重复序列可以提供有关要切割的目标 DNA序列的记忆,用于帮助保护细菌免遭病毒入侵并促进病毒的破坏。这些重复的间隔区序列可以引导核酸酶切割与将来入侵细胞的序列相同的 DNA2。
这一 DNA切割过程通过具有 DNA切割能力的 案例9酶完成。转录的 CRISPR公司序列由单链 核糖核酸组成,可以引导案例9核酸酶到特定位点对病毒基因组进行破坏。
CRISPR/案例9系统的分子组分现被用作真核细胞的基因编辑系统1。CRISPR/案例9基因编辑利用向导 核糖核酸的短合成片段来引导 案例9酶切割基因组中的目标位置。案例9酶直接作用于靶标,在目标序列末端第三个碱基处切割 DNA
该 CRISPR/案例9系统能够可靠地替换、删除或插入精确的基因组序列。案例9的活性模式由目标切割位点周围的核苷酸决定,人们已经编制了一套描述这些作用的规则,因此可以可靠、精确地预测 CRISPR-Cas9 DNA修饰三。
切除整个基因可以研究该基因的功能或插入的精确定点突变,重塑已知会导致人类疾病的突变,从而提供基因类疾病的模型。
CRISPR/案例9提高了基因编辑的准确性和特异性,使以前不可能开展的实验成为可能。它的效率是传统 ZFN(采埃孚)和人才系统的三到四倍4。而且,只需导入几个不同的引导 RNA即可删除多个基因5。
该技术已广泛用于构建敲除细胞系,在这类细胞系中,靶标基因可以精确删除,从而完全去除其编码的蛋白质。这样一来,人们就可以研究基因功能和基因之间的相互作用,并且深入研究人类基因疾病。
使用 CRISPR/案例9基因敲除的注意事项
要想提高 CRISPR/案例9敲除的准确性和成功率,应考虑多个注意事项。
所有基因组编辑方法都普遍存在一个问题,即核酸酶在目标位置以外切割 DNA时会产生脱靶效应。这种意外的 DNA断裂会引起与靶标基因无关的其他效应。因此,可以加入合适的单核苷酸多态性或荧光标签来验证敲除的准确性。执行该验证步骤时需要格外小心,以免将自然发生的多态性误解为脱靶突变。
一旦进行敲除,必须确认目标基因已被删除。表现型可以作为成功的初始指标。但是,通常还会使用分子技术来决定性地表征编辑事件。首先,可以使用 DNA错配检测验证 CRISPR-Cas9公司反应导致的敲除结果;但是,要想验证单克隆细胞系中所有等位基因均已敲除并且未造成脱靶效应,则必须对 DNA进行完整测序。
CRISPR公司工作
要想在不具备 CRISPR-Cas9公司基因编辑技术专业知识的情况下利用基因敲除细胞系的优势,研究人员可以购买各种 CRISPR-Cas9公司基因敲除细胞系或裂解液。
阿布卡姆提供种类繁多的基因敲除细胞裂解液,适用于多种研究应用6。实际上,阿布卡姆拥有业界最大的永生二倍体基因敲除细胞系库,包含 海拉、HEK293T、A549、HCT116、Hep G2和最大持续流量等。
每种敲除细胞裂解物均使用标准化的 CRISPR-Cas9公司方法生成,并配有亲本野生型裂解液,可以在一致的细胞背景下评估敲除的生物学影响。细胞系均为单克隆,并通过 桑格测序验证,可以确保编辑的准确性。
参考文献
1 Lomov NA等人,《生物聚合物和细胞》。2015;31:243–248.
2 Barrangou R等人,《科学》。2007;315(5819):1709–1712.
三。 Chakrabarti A等,《分子细胞2019》;73:699-713.
4 Ye L等人,《美国国家科学院院刊》,2014;111(26):9591–9596.
5 Kabadi AM等人,《核酸研究》,2014年;42(19):e147。
6 阿布卡姆。https://www.abcam.cn/reagents/knockout-lysates网站