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鬼笔环肽是一种选择性很强的双环肽,用于对肌动蛋白丝(又称 如果-肌动蛋白)进行染色。它能与多种不同种属动植物中的所有肌动蛋白丝变体结合。
通常情况下,会将鬼笔环肽与荧光染料(如 FITC、罗丹明、TRITC)或类似染料(如 Alexa Fluor公司®488或 iFluor 488)偶联使用。
鬼笔环肽可用于经福尔马林固定和透化的组织切片、细胞培养物等样本类型以及无细胞实验,也可用于已脱蜡的石蜡包埋样本。
目录
选择合适的鬼笔环肽偶联物
鬼笔环肽偶联物的选择范围很广:- 磷灰石-氟488- 磷灰石-氟405- Phalloidin iFluor类化合物555 - 磷灰石-荧光粉647- 罗丹明标记鬼笔环肽- 磷灰石FITC
推荐使用我们的 磷灰石-氟染料偶联物,可购买单独的试剂,也可以购买成套的 如果-肌动蛋白染色试剂盒。iFluor公司染料比 FITC公司和更多Alexa Fluor公司®染料的性能相似。
未标记的鬼笔环肽可在 如果-肌动蛋白染色实验中用作对照品。生物素偶联鬼笔环肽是染料偶联鬼笔环肽的替代品,可与链霉亲和素染料偶联物一起使用。
所需试剂
本方案需要使用以下试剂:
制备贴壁细胞的细胞培养物
1在黑壁/透明底 96孔板中培养细胞,直至细胞汇合度达到 70-80%。
2也可以直接在陪替氏培养皿内的盖玻片上培养细胞。
3吸出细胞培养基(需谨慎操作,避免细胞脱落)。
4用 美国公共广播电视公司洗涤一次。
制备悬浮细胞的细胞培养物
1培养细胞,直至达到预期的细胞汇合度(70-80%)。
2以 1000转/分的速度离心细胞 5分钟,吸出上清液,保留细胞沉淀。
3在预热(37摄氏度)的生长培养基中轻轻重悬细胞沉淀,随后转移到微孔板或盖玻片上。
4小心吸出细胞培养基,防止细胞脱落。用 美国公共广播电视公司是的
培养细胞的染色流程
1在含 3-4% 福尔马林的 美国公共广播电视公司中室温固定细胞 10-30 分钟。
2吸出固定液并用 美国公共广播电视公司洗涤细胞 2-3 次。
可选步骤:用含 10毫米乙醇胺(或 10万甘氨酸)的 美国公共广播电视公司淬灭过量的福尔马林 5分钟。
可选步骤:将含 0.1%海卫一X-100的 美国公共广播电视公司添加到固定细胞中,静置 3-5 分钟,以增加渗透性。然后用 美国公共广播电视公司洗涤细胞 2-3 次。
3添加鬼笔环肽偶联物工作液。室温孵育 20-90 分钟。
可选步骤:此时加入 DNA土豆泥
可选步骤:对于脊椎动物细胞,可以在最后一次的 美国公共广播电视公司洗涤液中加入鬼笔环肽偶联物,并在该培养基中进行封固。
4用 美国公共广播电视公司冲洗细胞 2-3 次,每次冲洗 5分钟
5添加封固剂,以保留荧光(如果使用的是盖玻片,则用载玻片密封)
6在 Ex/Em 493/517纳米处观察细胞
其他样本类型的染色流程
为优化固定条件,便于染色,建议在一定范围内变更固定时间和福尔马林浓度。
同意
已在 4% 福尔马林中固定的 注载玻片可能无法有效保留细胞骨架结构。
成功技巧
1鬼笔环肽对 pH值值敏感:如果 pH值值升高,鬼笔环肽中关键的硫醚桥键会被裂解,从而失去对肌动蛋白的亲和力。
2鬼笔环肽的半数致死量 劳埃德50为 2毫克/千克-请根据良好实验室规范进行处理。但是,通常情况下,鬼笔环肽的用量很小,不会造成重大的关键风险。
3鬼笔环肽染色可以与抗体染色搭配使用。在一抗或二抗孵育期间加入鬼笔环肽偶联物。
4鬼笔环肽偶联物的最佳浓度和孵育时间取决于具体的细胞类型、固定/样本制备条件和/或细胞/组织对探针的通透性。
5避免使用含甲醇或丙酮的固定剂:这类固定剂会破坏肌动蛋白的结构,并阻止鬼笔环肽进行染色。
6悬浮细胞可以附着在多聚-D类-赖氨酸微孔板或盖玻片上,然后使用贴壁细胞方案进行染色。
7用含 1%牛血清白蛋白的 美国公共广播电视公司预孵育固定细胞 20-30 分钟可以改善染色效果。
8对盖玻片进行染色时,将它们放置于有盖的容器中,尽可能减少蒸发。
9在某些情况下,可以使用一步法快速进行鬼笔环肽染色:4ºC下,在 3.7% 和50-100微克/毫升棕榈酰溶血磷脂酰胆碱与鬼笔环肽偶联物中 孵育 20分钟,然后洗涤 三次并封固。
10如果细胞看起来不健康,在染色和洗涤液中加入血清(2-10%)。
11在未固定的样本中使用时,鬼笔环肽的结合会降低肌动蛋白亚基与肌动蛋白丝末端的解离速率,从而通过防止肌动蛋白丝解聚来稳定肌动蛋白丝。
经典图像
希拉牌手表细胞中的肌动蛋白丝染色。肌动蛋白丝(绿色)用磷灰石-氟488试剂 (约176753)染色;微管蛋白丝用微管蛋白小鼠抗体/山羊抗小鼠 免疫球蛋白G(红色)染色。细胞核用 赫斯特33342染色。
希拉牌手表细胞中的肌动蛋白丝染色。肌动蛋白丝(红色)用磷灰石-氟555试剂 (约176755)染色。细胞核用核绿 DCS1(ab138905)是的
希拉牌手表细胞中的肌动蛋白丝染色。肌动蛋白丝(蓝色)用磷灰石-氟350试剂 (约176751)染色。
塞浦路斯和CyDye公司是通用电气医疗有限公司的商标。
Alexa Fluor公司® 是生命科技的注册商标。