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抗体有时会与抗原以外的蛋白质发生非特异性结合。这通常在多克隆抗体中更常见,但也可能在单克隆抗体中发生。为了确定哪条带或哪种染色是特异性的,可以进行免疫肽阻断实验。在继续染色方案之前,将抗体中和(与抗体识别的表位对应的多余肽孵育)。与封闭肽结合的抗体不再能够与蛋白质或细胞中的表位结合。然后将中和抗体与单独使用的抗体并排使用,并将结果进行比较。通过比较封闭抗体和单独抗体的染色,您可以看到哪种染色是特定的:在用中和抗体进行的免疫印迹或免疫染色中,这种染色将不存在。
封闭肽和相应抗体可在肽数据表的应用部分或抗体数据表的免疫原部分找到。
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材料和试剂
1.阻断缓冲液:TBST中5%的脱脂干乳(NFDM/TBST)
2.特异性抗体阻断肽
3.微管
1.将抗体在5%NFDM/TBST中稀释至1:100(1µl在99µl 5%NFDM/TBS中)
注:可能需要在特定方案中持续产生阳性结果的最佳抗体浓度
2.向100µl稀释抗体中添加5µl(1mg/ml)肽
3.在4ºC下搅拌培养过夜
4.运行western blot。使用不含阻断肽的抗体作为对照。