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一般流程
1. 用聚乙烯亚胺或多聚赖氨酸涂覆盖玻片,在室温下放置 1小时候
2. 用无菌水充分漂洗盖玻片 3 次,每次 1 小时。
3. 充分干燥盖玻片,在紫外光下灭菌至少 4 小时。
4. 使细胞在玻璃盖玻片上生长,或制备细胞分裂素或
5. 用磷酸盐缓冲液(PBS)简单漂洗。推荐使用1×PBS 0.1%吐温20作为洗涤缓冲液。
固定
可使用以下两种方法中的一种固定细胞:
1. 室温下,在 100% 甲醇(-20℃冷冻)中孵育细胞 5 分钟。
2. 室温下,在 4% 多聚甲醛(溶于公共广播系统中,pH值7.4)中孵育细胞 10分钟。
冰公共广播系统洗涤细胞 3 次。
抗原修复(可选步骤)
在抗原修复缓冲液对细胞进行加热处理后,有些抗体的效果会更好。查看产品信息,了解每种一抗的使用建议。
1. 将抗原修复缓冲液(100 mM Tris,5%[w/v]尿素,pH值9.5)预热至 95 ℃。水95 ℃。
2. 用小型宽头镊子小心将盖玻片置于盖玻片染色缸内的抗原修复缓冲液中,记下长有细胞的盖玻片面。
3. 在 95 ℃ 下加热盖玻片 10 分钟。
4. 从抗原修复缓冲液中取出盖玻片,浸入 6 孔组织培养板内的公共广播系统在中国
5. 用 公共广播系统洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。
通透
如果靶蛋白位于细胞内,对细胞进行通透处理尤为关键。用丙酮固定的样品不需要进行通透处理。
1. 用公共广播系统(含0.1–0.25%Triton®声波风廓线仪X-100或 100μM洋地黄或 0.5%皂苷)孵产品 10 分钟。Triton®声波风廓线仪X-100是用于提高抗体渗透性最常用的去垢剂。但Triton®声波风廓线仪X-100会破坏细胞膜,因此不适用于细胞膜抗原。
2. 确定每种目标蛋白的Triton®声波风廓线仪X-100最佳比例。
3. 用 公共广播系统洗涤细胞 3 呼,呼 5 分钟。
封闭与免疫染色
1. 用 1%牛血清白蛋白,22.52 mg/mL甘氨酸的PBST(PBS+0.1%吐温20)孵胞 30 分钟,封闭抗体的非特异性结合(可替代的封闭液包括 1% 明胶或来源于产生二抗的物种的10%血清:查看抗体数据表了解相关建议)。
2. 室温下,用稀释抗体(溶于1%英国标准协会的PBST公司中)在湿盒中孵育细胞1个小时,或 4 ℃ 过夜孵育。
3. 倒出溶液,用PBS公司洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。
4. 室温下,用二抗(溶于1%英国标准协会中)避光孵育细胞 1 小时。
5. 倒出二抗溶液,用PBS公司避光洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。
多色染色(可选步骤)
要检测同一个样品中两种或多种抗原的共同分布情况,需要使用双重免疫荧光流程。该流程可在混合物中同时进行检测,也可逐个抗原依次进行检测。
确保抗体来源于不同物种并且这些抗体有相应的二抗。例如,抗抗原 A类的兔抗体和抗抗原B类的鼠抗体。也可使用偶联至不同荧光团的直标一抗。
中国
1. 用封闭液孵育细胞 30 分钟。
2. 室温下,用两种一抗(溶于1%英国标准协会的PBST公司中)在湿盒中孵育细胞1个小时,或 4 ℃ 过夜孵育。
3倒出溶液,用公共广播系统洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。
4. 室温下,用两种二抗(溶于1%英国标准协会中)避光孵育细胞 1 小时。
5倒出二抗溶液,用公共广播系统避光洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。
依次孵育
1. 第一封闭步骤:室温下,用第一封闭液(来源于产生二抗的物种的 10% 血清)孵育细胞 30分钟。
2室温下,用第一种一抗(溶于1%英国标准协会或 1%血清的PBST公司中)在湿盒中孵育细胞1个小时,或 4 ℃ 过夜孵育(一抗溶于 1% 明胶或 1%牛血清白蛋白的PBST公司中)。
3. 倒出第一种一抗溶液,用公共广播系统洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。
4. 室温下,用第一种二抗(溶于1%英国标准协会的PBST公司中)避光孵育细胞 1 小时。
5. 倒出第一种二抗溶液,用公共广播系统避光洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。
6. 第二封闭步骤:室温下,用第二种血清(乐观主义10% 血清)避光孵育细胞 30 分钟。
7. 室温下,用第二种一抗(溶于1%英国标准协会或 1%血清的PBST公司中)在湿盒中避光孵育细胞1个小时,或 4 ℃ 过夜孵育。
8. 倒出第二种一抗溶液,用公共广播系统避光洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。
9. 室温下,用第二种二抗(溶于1%英国标准协会中)避光孵育细胞 1 小时候倒出第二种二抗溶液,用公共广播系统避光洗涤细胞 3 次,每次 5 分钟。
如需检测两种以上的抗原,其余抗体按照步骤 1–5 继续操作。
复染
1. 用 0.1-1μg/mL赫斯特或 DAPI(DNA染色)孵育细胞 1分钟。
2. 用 公共广播系统漂洗细胞。
封片
1. 用一滴封片介质封闭盖玻片。
2. 用指甲油密封盖玻片,避免样品变干和在显微镜下移动。
3. -20 ℃ 或 4 ℃ 下避光保存。