取2 x 50 ml Falcon试管,标记为HBSS和HBSS+BSA。将HBSS从HBSS容器中倒入50 ml标有HBSS的试管中。
混合HBSS和BSA:量出约45 mg BSA(不含脂肪酸),加入标有HBSS+BSA的空试管中。转移约45 ml HBSS并轻轻混合,以免产生大量气泡,但要完全混合BSA,让其沉淀。这应该是1 mg/mL BSA和HBSS的混合物。
混合Fura-2+HBSS+BSA:解冻Fura-2 AM 50µl二甲基亚砜并在关闭室内灯的情况下混合。一次只能装入2个35毫米的盘子,因为成像时间对Fura清洗后的时间安排不起作用。用吸液管将此Fura-2/HBSS/BSA混合物的4-10µL/35 mm培养皿中的细胞移到15 mL Falcon管中(成像细胞中较低浓度的Fura-2 AM将降低细胞内的缓冲容量)。在装有Fura-2的15 mL试管中加入4 mL HBSS+BSA。从培养箱中取出两盘盖玻片,放在工作台上,然后将15 mL试管在高处旋转1分钟。将2 x 50 mL HBSS和HBSS+BS A试管放入架子中(松开/取下所有Falcon试管的盖子)。附近有一个废物容器,无菌吸管尖端打开并准备好。
加载Fura:从培养箱中取出2个35毫米培养皿。用1 mL无菌移液管尖端,从一个35 mm培养皿中取出所有培养基,并将其喷射到废物容器中。用同样的尖端,取出1毫升HBSS,轻轻地添加到细胞中,小心地沿着侧面放置,并轻轻地避免破坏电镀细胞。取出同样的1毫升HBSS,并将其喷射到废物容器中,用同样的尖端取出下一毫升HBSS并轻轻放在细胞上。再次取出溶液,并丢弃尖端。用一个新的无菌移液管尖端,用移液管移取1 mL HBSS+BSA,轻轻清洗,将其移到废物中。使用相同的移液管尖端,再重复2次,用HBSS+BSA洗涤细胞3x。使用相同的尖端,立即加入1 mL Fura+HBSS+BSA,涡旋1分钟。向细胞中加入第二个1 mL Fura-2 AM,并用时间标记盖玻片的盖子。对第二道菜重复上述步骤。
通常,加载45分钟,但这可能需要改变,以及在2 mL HBSS+BSA中加入4-10µL Fura-2 AM。在CO中更换两个培养皿2/37o(o)C培养箱,加载时间为45分钟。
清洗:取下两个培养皿,用新的无菌尖端轻轻地将1 mL Fura-HBSS+BSA混合物倒掉,然后再倒出第二个1 mL。用新的移液管尖端,用1 mL哈佛商学院(不是HBSS+BSA),每次轻轻一点,然后把洗好的东西放在垃圾中。在4之后第个清洗,保留1 mL HBSS并添加第二mL HBSS。标记时间并在培养箱中更换30分钟-45分钟。