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冷冻保存是一种使细胞在冷冻数月或数年,并在解冻后仍保持其活力的方法。细胞冷冻保存可尽可能减少遗传变化并避免污染造成的损失。最好在细胞处于其最佳生长速率时将其冷冻保存。
甘油协议方
CoolCell®冷却电池快速冷冻机 (生物循环)
冷冻培养基
在冷冻管上标记好日期、研究者姓名、细胞数、细胞传代数和细胞类型(以及任何其他有用信息,比如遗传修饰)。
如果细胞贴壁,则去除细胞培养基,用 美国公共广播电视公司涤、酶、胞37摄氏度培养箱中孵育约 2分钟。在细胞培养基中重悬细胞并移入 50毫升猎鹰管中。
如果细胞为悬浮状态,只需将所需体积细胞直接移入 50毫升猎鹰管中。
用血细胞计数器进行细胞计数以确定其活力。用于冷冻保存的细胞活力至少应为 75%。
在1000转/分离心 5分钟。
准备冷冻培养基(表 1)。
请注意,二甲基亚砜并不适合所有的细胞类型,因此甘油可作为替代使用。
去除上清液(上清液需要保留用于冷冻培养基,见表 1),轻轻散开沉淀物。
添加冷冻培养基至所需的细胞密度。对于哺乳动物细胞,所需细胞密度通常为 1000000/mL冷冻培养基。在室温下,细胞不应在冷冻培养基中超过 10分钟。
在各冷冻管中各分装 1毫升并盖紧盖子。
室温下将冷冻管移至 冷却电池快速冷冻机中,然后放入 -80摄氏度冰箱中。冷却电池快速冷冻机将确保温度以 1摄氏度/分钟稳步下降。
大约 24小时后,从 CoolCell公司快速冷冻机中取出冷冻管并转移到液氮中长期储存。
使用离心步骤中的上清液(步骤 7)。
在使用前充分混合并升温至 37°C
表1用于哺乳动物细胞系的不同类型冷冻培养基
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