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通过 ChIP-seq公司法和 ChIP-qPCR法开展交联 炸薯条的详细步骤和技巧。
2021年11月9日审核
下载或打印该方案。
查看 X-ChIP公司方案图。
ChIP-seq公司和 ChIP-qPCR功能强大,可实现蛋白或组蛋白修饰与基因组区域的特异性匹配。分离染色质后,使用靶向目标抗原的抗体确定靶点是否与特定的 DNA序列结合或绘制整个基因组的分布图(微阵列或 DNA测序)。该步骤在空间和时间上均可行。
该方案提供了如何在细胞上进行 炸薯条的具体细节。使用该方案产生的输出 DNA既可以采用 qPCR(ChIP-qPCR)分析,也可以进行测序 (ChIP-seq)分析。
用福尔马林交联蛋白质和 DNA交联程序与时间有关,需要优化。
提示:样本的建议交联时间为 2 - 30 第二
1.1首先,准备两个 150厘米2长满细胞的培养皿(每个培养皿 1x10个7-5x10像素7个细胞)。直接向培养基中逐滴滴加福尔马林,至终浓度为 0.75%,然后在室温 (RT)下轻柔旋转 10分钟,促使蛋白质与 DNA交联。
1.2向培养基中添加甘氨酸,至终浓度为 125mM室温下振荡孵育 5分钟。
1.3用 10毫升冰冷 美国公共广播电视公司冲洗细胞两次。
1.4加入 5毫升冰冷 PBS、胞刮刀刮50毫升试管中。
1.5向培养皿中添加 3毫升PBS再次刮片,将剩余细胞转移至 50毫升试管中。
1.64摄氏度下,按照 1000克的转速离心 5分钟。
1.7小心吸取上清液,将沉淀重悬于 炸薯条裂解缓冲液中(每 1 x 107胞750微升)置于冰上孵育 10分钟。
提示:悬浮细胞的起始用量为 1 x 107-5 x 107个细胞,如上所述用 0.75% 福尔马林和甘氨酸处理细胞(步骤 1)。离心沉淀细胞(5 分钟,1000 x g)用冰冷 美国公共广播电视公司洗涤 三你好炸薯条裂解缓冲液重悬沉淀(750μL/1 x 107个细胞)。
2.1对裂解液进行超声处理,以剪切 DNA并确保 DNA的平均片段大小为 200-1000 bp不同细胞系所需的超声处理时间不同,因此这一步骤需要优化。
提示:为了确定最佳条件,应对交联裂解液进行一个时程的超声处理。时程结束后,取出样本,并按照步骤 三所述分离 DNA应在 1.5% 琼脂糖凝胶上分析片段大小,如图 1所示。
2.2超声处理完成后,在 4摄氏度下按照 8000 x克的转速离心 10分钟,沉淀细胞碎片,转移上清液至新管中。该染色质溶液将用于步骤 4希腊语(IP)中。
2.3取 50微升经超声处理的样本,测定 DNA浓度和片段大小。
提示:经超声处理的染色质可在液氮中速冻保存,可在 -80摄氏度下保存 三个月之久。请勿反复冻融。
图1(如上):对U2OS系列细胞进行5、10、15和20分钟的超声处理。片段大小随着超声时间的增加而减小。15分钟时观察到最佳片段大小。
提示:超声处理时间过长会破坏核小体-DNA相互作用,因此条带大小应不小于 200个基点
经过超声处理的染色质样本可用于计算后续 IP(IP)的 DNA浓度,并测定 DNA片段大小。
3.1向 50微升染色质中加入 70微升洗脱缓冲液。
3.2加入 4.8µL 5 M氯化钠和 2µL核糖核酸酶A(10 mg/mL),65°C下振摇孵育过夜。
为什么使用核糖核酸酶A?
使用 聚合酶链反应纯化试剂盒时,高水平的 核糖核酸会干扰 DNA纯化,因此需要使用 核糖核酸酶A处理样本。否则纯化柱吸附饱和时产物会大大减少。
3.3加入 2微升蛋白酶 K(20 mg/mL),60°C下振摇孵育 1小时。
为什么使用蛋白酶K(K)?
用蛋白酶 K(K)处理样本,可使邻近脂肪与芳香族氨基酸羧基的肽键断裂。从而破坏蛋白质和 DNA之间的交联,促进 DNA的纯化。
3.4使用 聚合酶链反应纯化试剂盒或苯酚:氯仿萃取法纯化 DNA
3.5为测定 DNA浓度,取 5微升纯化 DNA转移至含 995微升TE的试管中,稀释 200倍,并读取 外径260DNA浓度 (微克/毫升)为 外径260 x 10000用于计算制备染色质的 DNA浓度。在带 100 bp DNA标志物的 1.5% 琼脂糖凝胶中运行纯化 DNA以测定片段大小。
4.1使用步骤 2.2制备的染色质。建议每次 IP(IP)使用约 25μg DNA按 1:10 的比例用 RIPA公司缓冲液稀释每个样本。设置一个抗体对照和一个仅加磁珠的对照。取 50µL染色质作为 输入样本,-20摄氏度下保存备用。
4.2在所有样本(仅加磁珠的对照除外)中加入一抗,并在 4摄氏度下旋转孵育 1小时。抗体用量应事先通过实验确定;一般来说,每 25μg DNA加入 1-10微克抗体。
4.3制备蛋白 A/G公司磁珠:如果同时使用蛋白 A类和蛋白 G公司磁珠,混合等体积的蛋白 A类和蛋白 G公司磁珠,在 RIPA公司缓冲液中洗涤 三动作路线RIPA公司缓冲液,加入单链鲱鱼精 DNA至磁珠终浓度为 75纳克/微升再加入 英国标准协会至磁珠终浓度为 0.1微克/微升加入 RIPA公司缓冲液,至磁珠体积翻倍,室温下旋转孵育 30分钟。用 RIPA公司缓冲液洗涤一次,加入 里帕缓冲液,至磁珠体积翻倍。
4.4在所有样本中加入 60微升封闭的蛋白 A/G公司磁珠,4摄氏度下旋转 IP(IP)过夜。
提示:应使用蛋白 A类磁珠、蛋白 G公司磁珠或两种磁珠的混合物。表 1显示了蛋白 A类和 G公司磁珠对不同免疫球蛋白同种型的亲和力。
4.5按照 2000 x克的转速离心免疫沉淀样本 1分钟,除去上清液。
4.6按照以下步骤进行洗涤:分别在低盐洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液和氯化锂洗涤缓冲液中洗涤一次。每次洗涤后,按照 2000 x克的转速离心 1分钟,除去上清液。
提示:如果观察到高背景,可能需要额外增加洗涤步骤。也可以在实施步骤 4.2之前,用蛋白 A/G公司磁珠孵育 1小时,从而预先清除经过超声处理的染色质。该步骤可以去除与磁珠发生的非特异性结合。将上清液(经过超声处理的染色质)转移至一个新管中,然后按照前述步骤 4.2对抗体和磁珠进行孵育。
5.1在蛋白 A/G公司磁珠中加入 120微升洗脱缓冲液,以洗脱 DNA,30°C慢涡15分钟。
5.2按照 2000 x克的转速离心 1分钟,并将上清液转移至新管中。
5.3加入 4.8µL 5 M氯化钠和 2µL核糖核酸酶A(10 mg/mL),65°C下振摇孵育过夜。
5.4加入 2微升蛋白酶 K(20 mg/mL),60°C下振摇孵育 1小时。
5.5DNA可使用 聚合酶链反应纯化试剂盒或苯酚-氯仿萃取法进行纯化。
6.1DNA水平通常采用实时定量 聚合酶链反应法进行测定。引物和探针通常使用实时 聚合酶链反应仪提供的软件或在线设计工具进行设计。我们在网站上提供了一些预先设计好的引物和探针。
6.2使用 ChIP-seq公司方法时,也可以通过测序进行 DNA水平分析。使用该方案产生的 DNA适合用作制备测序文库的 输入
提示:建议根据我们的疑难解答提示优化该方案,确保其适用于您的特定实验条件。
下载或打印完整方案
种属
免疫球蛋白同种型
蛋白A类结合强度
蛋白G公司结合强度
人
IgG1
+++
免疫球蛋白G2
IgG3
-
免疫球蛋白G4
免疫球蛋白M
使用人 免疫球蛋白M
人免疫球蛋白M
免疫球蛋白E
+
免疫球蛋白A
小鼠
IgG2a
IgG2b
++
大鼠
IgG2c
鸡
所有同种型
母牛
山羊
豚鼠
仓鼠
马
猪
兔
羊