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使用植物样本的 炸薯条的详细程序和技巧。根据 沃纳·奥夫萨茨提供的方案编辑。
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介绍
真核生物染色质是由 DNA和相关组蛋白组成的复合体,参与 DNA到染色体的高级包装过程。给定 DNA批准DNA和组蛋白的潜在可逆共价修饰的调节。
组蛋白在灵活 N个这是一个很好的例子
交联染色质与特定组蛋白修饰(染色质免疫沉淀,ChIP)特异性抗体的免疫沉淀 (IP)及随后通过 聚合酶链反应对 IP(IP)组分内目标 DNA序列的潜在富集或耗竭进行的检测,构成了简洁而直接的单个基因特定染色质状态查询方法,已在许多实验室中常规化使用。
然而,与动物细胞不同的是,植物细胞具有坚硬的细胞壁,限制了动物实验方案的简单应用。本方案描述的方法用于研究植物模式生物拟南芥中的组蛋白修饰。本方案是 劳伦斯及其同事发表的原始程序的改编版本(劳伦斯等人,2004年)。
本方案描述了如何从拟南芥中制备随后可用于染色质免疫沉淀 (ChIP)的染色质。开始 X-ChIP公司检测前,应测定确切的染色质浓度。查看我们的交联染色质免疫沉淀 (X-ChIP)方案,该方案应在下面详细介绍的染色质制备完成后使用。
拟南芥种子在 4℃0.1%Phytablend w/v中分层 48小时,然后播种到土壤上。每次制备染色质使用 1.5克3-4周龄的完整幼苗。采收时要尽量避免土壤污染。
染色质交联
染色质制备
确保溶液在超声处理期间不会产生泡沫,例如,在超声处理步骤实施期间,使用含 100%w/v乙醇的冰块冷却试管。
在冷却的台式离心机中以 13000转/分转速离心 10分钟。向新的 埃彭多夫管中加入上清液。
重复步骤 14。取 10微升在琼脂糖凝胶上运行。
在 1.5%w/v琼脂糖凝胶上将通过步骤 12和 15获取路线等DNA应该发生偏移且强度更大,范围在 200-2000基点之间,集中在 500个基点附近。
步骤 16完成后,可在液氮中“速冻”,并在 -80℃ 条件下存储染色质样本。但应避免反复冻融。
预清除和免疫沉淀 (IP)
免疫复合物的收集、清洗和洗脱
反向交联
DNA清除
提取缓冲液1
40万蔗糖
10 mM Tris-HCl,pH 8.0
10毫摩尔氯化镁
5 mMβ-巯基乙醇
蛋白酶抑制剂
提取缓冲液2
0.25万蔗糖
1%w/v Triton X-100
提取缓冲液三
170万蔗糖
2百万氯化镁
0.15%w/v Triton X-100
细胞核裂解缓冲液
50 mM Tris-HCl,pH 8.0
10毫摩尔乙二胺四乙酸 (EDTA)
1%w/v十二烷基硫酸钠
1毫微米PMSF(最终浓度)
中国(遵照生产商说明)
炸薯条稀释缓冲液
1.1%Triton®声波风廓线仪X-100
1.2 mM乙二胺四乙酸二乙酯
16.7 mM Tris-HCl,pH 8.0
167米氯化钠
洗脱缓冲液
1%十二烷基硫酸钠
0.1 M NaHCO3
低盐清洗缓冲液
150毫摩尔氯化钠
0.1%十二烷基硫酸钠
1%Triton®声波风廓线仪X-100
2百万乙二胺四乙酸 (EDTA)
20 mM Tris-HCl,pH 8.0
高盐清洗缓冲液
500毫米氯化钠
氯化锂清洗缓冲液
0.25万氯
1% 乙基苯基聚乙二醇
1% 脱氧胆酸钠
1百万乙二胺四乙酸 (EDTA)
TE公司缓冲液