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所有实验均使用以下混合组分。本实验方案已经过优化,可用于新生大鼠心肌细胞的转染。对于需要更多转染混合物的实验,只需加倍使用下述试剂:对于 24等等L7RH-β-半乳糖质粒。接种后立即在各孔内加入 40微升内容物(20微升荧光素酶质粒和 20μLβ半乳糖苷酶混合物)。所有混合操作(需要涡旋的除外)均应在无菌细胞培养罩中进行。
总体积
400μL(左)
600μL(左)
800μL(左)
无菌 250万氯化钙2
25微升
37.5微升
50μL
质粒
10微克
15微克
20微升
无菌水
加入后,共 200微升
加入无菌水,至总体积达 300微升
加入无菌水,至总体积达 400微升
将上述三种试剂装入 1.5毫升无菌 埃彭多夫管,并放入培养罩中。轻柔混合。请勿涡旋。
无菌 2X HBS(肝素缓冲盐水)
逐滴加入 200微升并轻柔搅拌上述混合物(涡2)。
滴加 300微升并轻柔搅拌。然后多次翻转,充分混匀。
滴加 400微升
添加 2倍HBS后,盖上 埃彭多夫的盖子,并在室温下静置 15分钟以上。可以将混合物用于细胞时,搭配使用等量的报告质粒和 β-加仑对照混合物。翻转数次,轻柔混匀,并在 24孔板的每个孔内加入 40微升合(需要根据具体实验进行优化),轻柔涡旋细胞,以便将转染混合物分散到培养基中。在 10厘米板上转染另一质粒/构建体时,向 6毫升培养基中加入总体积为 300微升的转染混合物效果较好。
理查德图案博士
塔夫茨新英格兰医学中心
分子心脏病学研究中心
马萨诸塞州波士顿