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在《自然》杂志开展的一项关于科学可重复性的调查中,90% 的受访者认为存在可重复性危机,但只有 33% 的人考虑过如何解决这一问题1。可重复性危机是科学界长久以来一直都面临着的挑战,但通过选择稳定可靠的试剂,我们开始逐步克服这个挑战。
《自然》杂志对 1,576 名研究人员进行的一项调查显示,70% 以上的研究人员无法重复其他科学家的实验1。如果您细想一下您在开展研究时依赖其他实验室实验方案或结果的频率,便能理解这个问题的重要性了。
这种不可重复性会导致巨量的时间和资金被浪费;布拉德伯里在 2015年发表的论文中预计,全球在表征不良的抗体上花费的费用达 16亿美元2。但是,自这篇论文撰写至今,这一预计数字增长了不止一倍,达到 35亿美元三。
图1:布拉德伯里 在一bcam公司可重复性科学周上谈论蛋白结合试剂花费的资金
克服可重复性危机需要团队和个人的共同努力,我们也可以做出一些简单的改变,以提高研究中的可重复性。
批准《临床前研究中可重复性的经济学》(临床前研究中的再现性经济学)刊载的一篇论文4认为,这些因素可以分为以下几类:生物试剂、参考资料、研究设计、数据分析、报告和实验步骤。
据估计,约三分之一的不可重复性结果由使用的生物试剂造成4。因此,仔细挑选合适的试剂不仅能极大地影响您的研究,还能影响未来基于您的研究成果开展研究的其他研究人员。
研究人员通常会选择以往研究引用过的抗体。但仅仅基于引用次数来挑选抗体存在一定的风险。随着抗体生产和验证技术的不断发展,部分曾被认为具有特异性的抗体被证实还会与其他蛋白发生反应。例如,卢基纳维希乌斯等人研究发现,某些靶向 Cdk1型的抗体还能识别 第152页而且有 200多篇论文使用了这些抗体5。
图2:abcam公司可重复性科学周网络研讨会举例列示了受非特异性抗体影响的论文数量。演讲嘉宾:布拉德伯里、 巴勃罗·恩格尔、彼得·麦克弗森 和 安吉洛·德·马尔佐。
要想获得准确的可重复性结果,研究所使用的抗体必须具备高特异性和批间一致性,但是,多克隆抗体(多克隆抗体)、单克隆抗体(单克隆抗体)和重组抗体(重组单克隆抗体)的这类因素有所不同。
多克隆抗体源自天然免疫应答,因此异质性高,有能力结合多个表位。虽然多克隆抗体的异质性在一些应用中存在优势6,但每次生产新批次时,都需要给另一组动物重新免疫。因此很难获得一致的多克隆混合物,也就是说,特异性会发生变化,批间不一致性风险较高。
传统的单克隆抗体是由单个 B类细胞亲本克隆产生的,因此可以确保它们能检测特异性抗原表位。单克隆抗体是有效开发药物或发现生物标志物的宝贵工具,可用于定量测定、定位和调节目标蛋白。
虽然使用杂交瘤可以生成相同的单克隆抗体,很长一段时间过后,它们会发生基因漂变,导致抗体批次随着时间的推移而发生细微变化;此外,研究证实,40% 的杂交瘤单克隆抗体会表达其他的生产性重链或轻链,因此不具备特异性7。
由于感染是在体外使用合成基因生成的,所以克服了多克隆抗体和传统单克隆抗体存在的许多问题。将抗体基因克隆到高收率表达载体上,可以控制编码序列,从而提高抗体特异性和灵敏度。这样还能生成几乎可以靶向所有抗原(包括非免疫原性抗原和毒性抗原)的抗体。此外,重组生产方法还可以避免基因丢失、基因突变及细胞系漂变等问题。
使用重组单克隆抗体可以确保抗体的批间一致性极高,为您提供高可重复性结果。
美国
使用基因敲除细胞系(KO细胞系)检测抗体是确定抗体特异性的金标准。下图显示了通过 西方印迹比较单克隆抗体和重组抗体在野生型样本和基因敲除样本中特异性得到的结果。如果抗体特异性高,那么基因敲除样本中的靶蛋白条带或特定条带将消失。但这是重组抗体会出现的情况,传统单克隆抗体则存在其他交叉反应。
我们对 3,600 多种重组抗体进行了 击倒对手验证,从而确认了抗体的特异性,这意味着您可以更快地推进您的项目并获得可重复性结果。
图 3:abcam(abcam)TLE1级重组抗体 [EPR9386(2)](左)与 TLE1【OTI1F5】单克隆抗体在基因敲除样本和野生型样本上的检测结果对比。
您在实验中为提高可重复性采取的一些细小步骤,可能会对解决更大难题产生重大影响。无论是确保在应用中正确验证试剂、优化数据分析,还是改用重组抗体,只要同心协力,我们就能化解可重复性危机。