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查找您进行 安息实验所需要的一切,包括一份正确试剂的列表以及实验方案每个步骤的疑难解答提示。
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安息是一种基于抗体的技术,用于定位体内的核糖核酸-蛋白质相互作用。将所关注的核糖核酸结合蛋白(RBP)与其结合的核糖核酸一起进行免疫沉淀,鉴定结合转录RNA(mRNA、非编码 核糖核酸或病毒RNA)可以通过实时PCR、微阵列或测序检测。
最近,表观遗传学和核糖核酸生物学领域对不同核糖核酸作用和功能的关注大大增加。据观察,核糖核酸的功能远不止转录和后续的翻译。例如,核糖核酸-蛋白质相互作用能够调控信使核糖核酸和非编码核糖核酸的功能。对核糖核酸潜能的这一新认识带动了新方法的发展,使研究人员能够定位 核糖核酸-蛋白质相互作用。安息是一种研究单个蛋白质和 核糖核酸分子间物理结合的实验方案。
(希腊语)安息实验方案修改自 Khalila等人(2009)、Hendrickson等人(2009年)和Hendricgson等人(2008年)和 Rinn等人(2007年)
在这里查找更多的核糖核酸和核糖核酸修饰的实验方法及内容。
实验方案概述
1收集细胞(内部-核糖核酸复合物)2分离细胞核,裂解细胞核沉淀三。染色质片段化4将所关注的 核糖核酸结合蛋白 (RBP)和结合的 核糖核酸一起进行免疫沉淀5洗去未结合的物质6纯化免疫沉淀后 RBP公司上结合的 核糖核酸7将 核糖核酸逆转录为 cDNA通过 qPCR、微阵分析
1.1.培养细胞至一定密度,按照实验要求进行处理。
1.2.如果需要进行交联步骤,则需要优化固定时间。
查看我们炸薯条实验方案中的交联部分。
1.3.通过胰蛋白酶消化收集细胞并在 公共广播系统(条例草案107个细胞使用2毫升PBS)新鲜制备的细胞核分离缓冲液(2毫升)和水(6毫升)中重新悬浮。冰上放置20分钟(不时搅拌)。
中国人
2.1. 2500克离心15分钟沉淀细胞核。
2.2. 将细胞核沉淀重新悬浮于新鲜制备的安息缓冲液 (1毫升)中。
为避免污染,使用不含核糖核酸酶的试剂,如不含核糖核酸酶的枪头、试管和试剂瓶;同时使用不含DNA酶和核糖核酸酶的超纯蒸馏水制备缓冲液和溶液。
3.1.将重悬后的细胞核分成两份,每份500微升(用于模拟实验和IP(IP))。
3.2.使用杜恩斯匀浆器捣碎15 - 20次对染色质进行机械剪切。
针对不同的细胞系可能需要优化剪切条件。
3.3.13000转/分离心10分钟沉淀细胞核膜和碎片。
在液氮中冷冻一份裂解物用于核糖核酸分离对照。
4.1.将所关注的蛋白质的抗体(2-10微克)加入上清液中(6-10毫克),4o个C类轻柔搅动孵育2小时(至过夜)。
4.2.加入蛋白质A/G(希腊语)(40微升),4o个C类轻柔搅动孵育 1小时。
根据所关注的蛋白质和抗体,加入的抗体量和孵育时间可能需要进行优化。如果一种抗体可以用于IP(IP),则表明它也可能用于安息。
5.1. 2500转/分离心30秒沉淀磁珠,移去上清液,在500微升RIP(独立电源)缓冲液中重悬磁珠
对蛋白质A/G磁珠沉淀的严格清洗至关重要,并且可能需要优化。
5.2. 安息中重复清洗共三次,随后在美国公共广播电视公司中清洗一次
第二次清洗后,将5%的磁珠进行冷冻,用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(例如,如果您的磁珠悬浮液总体积为100微升,则冷冻5微升)
1根据制造商的说明,在三唑核糖核酸提取试剂(1毫升)中重悬磁珠,分离共沉淀的核糖核酸。在我们的 核糖核酸分离实验方案中可查看更多信息。
2使用不含核酸酶的水(例如20微升)洗脱核糖核酸。
将约 15–25微升()环境保护部处理的 TE公司缓冲液或水加入 核糖核酸沉淀中。洗脱的 核糖核酸可储存于 -80°C
三。可以使用工作分解结构分析检测通过磁珠分离的蛋白质。可在我们的工作分解结构实验方案中查看更多信息。
如果进行了交联步骤(1.2),则此时应进行逆交联。请查看我们炸薯条实验方案中的逆交联部分获取详细信息。
1根据制造商的说明,使用逆转录DNA酶处理核糖核酸。
2如果靶标已知,使用定量PCR分析cDNA。如果靶标未知,可使用 cDNA文库创建、微阵列和测序进行分析。
聚合酶链反应扩增之后对照实验不应该产生可检测的产物,且这些对照文库的高通量测序应该只返回非常少量的独有序列。
中国
安息缓冲液
Hendrickson DG、Hogan DJ、McCullough HL、Myers JW、Herschlag D、Ferrell JE和Brown PO(2009年).人类microRNA数百个靶点的翻译和mRNA丰度的一致调节。公共科学图书馆生物学7 (11), 2643.
Hendrickson DG、Hogan DJ、Herschlag D、Ferrell JE和Brown PO(2008年)。通过特异性microRNAs对Argonaute 2招募的mRNAs的系统鉴定及其转录丰度的相应变化。公共科学图书馆One 3(5), 2126.
Rinn JL、Kertesz M、Wang JK、Squazzo SL、Xu X、Brugmann SA、Goodnough LH、Helms JA、Farnham PJ、Segal E和Chang HY(2007)。非编码RNA对人类HOX基因座中活性和沉默染色质结构域的功能划分。单元格 129, 1311——1323
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