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了解更多关于染色质的结构以及用于研究染色质可及性和相互作用的方法
染色质由组蛋白和 DNA组成:147个碱基对的 DNA缠绕在 8我想说的是
染色质的功能是高效地将 DNA包装成适合进入细胞核的小体积,并保护 DNA结构和序列。将 DNA包装到染色质中可以确保有丝分裂和减数分裂,防止染色体断裂,并控制基因表达和 DNA复制。查找有关染色质结构及染色质可及性和相互作用研究方法的更多信息。
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目录
基因组被有效地包装到细胞核中。DNA缠绕在组蛋白周围,形成核小体,核小体由 147个碱基对的 DNA和 8个核心组蛋白组成。核小体像珠串一样串连在一起,并被包装成更高阶的染色质结构(图 1)。
图 1:染色质结构。DNA缠绕在核小体周围,形成染色质纤维,然后再形成染色体
紧密缠绕在核小体或更高阶异染色质中的 DNA是无法与转录因子、转录机制和其他 DNA结合蛋白相结合的,从而导致基因沉默。但同时, “接头” DNA和
为了改变基因表达和细胞编程,染色质处于不断被重塑的动态中,例如在不同的发育阶段或响应特定的刺激时。大的基因组区域可能被沉默,可能被激活,或者核小体被打开,以便特定的基因和 DNA序列与之结合。
对于染色质结构和核小体定位的探索揭示了与特定细胞进程和疾病状态相关的表观遗传程序和机制。
为了了解在不同的细胞生物进程中染色质的结构与其功能之间的关系,首要步骤是对于暴露在外的活 跃转录区域和异染色质中紧密结合区域的基因组的比较研究。想要诠释某一时刻的基因组架构,研究人员可以使用以下三种方法之一:DNaseq、MNase-seq或 ATAC第2部分
DNA酶-seq和 ATAC-seq公司绘DNA的暴露区域, MNase-seq公司则绘制受核小体保护的区域。有一点很重要请记住,这些方法展示的是一个动态过程中的某一瞬间,通常是反应了数千个细胞的平均状态。 如果一个特定的区域呈现动态变化趋势,或者群体内细胞之间出现差异,那么不同方法得出的数据结构便会不一致。为了解决这些问题,一些单细胞分析方法正在开发中。
DNA序列
DNA酶序列利用 DNA酶来消化基因组的暴露区域,而与核小体结合的 DNA不会被 DNA酶消化。然 后对 DNA酶消化产生的小片段进行测序并将其定位到基因组,以确定活跃转录的区域。
(美国)
•最成熟和实用的实验方法
• 对 DNA酶剪切的偏差有明确解释
•可用于反向推导未被剪切的基因组区域,称为 DNA酶足迹法,旨在鉴定转录因子和核小体的结合位点。但是此类实验中,使用裸DNA工作DNA酶I的剪切偏差也可能导致错误的结论
• 可能会适用于单细胞分析
缺点
• 实际应用中有难度,尤其是在针对给定细胞类型/数量设计消化条件的时候
•需要几百万个细胞,可能不利于病人样本稀少的情况 。
MNase-seq公司
美国DNA酶-seq不同,MNase-seq公司利用金黄色葡萄球菌的微球菌核酸酶 (管理)来消化掉暴露的基因组区域。然后对与核小体结合的 DNA进行恢复并测序。
•从酵母到人类,是在众多种属的许多细胞类型中通用和成熟的实验方法并且消化和数据分析实现 了一定的标准化
•可与染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq)结合使用,用于研究与核小体结合的调控因子
•可用于生成碱基对分辨率图谱
•可用于检测核小体定位以及核小体占有率和甲基组测序(NOMe-seq)中的 DNA甲基化状态
英国
•需要大量细胞(1-2 千万)
•自动变速箱富集区消化过程中存在序列特异性偏差(尽管在染色质可及性检测中使用的大多数酶都表现出 了相似的偏差),但也存在未知 偏差可能导致错误的实验结果
• 尚不支持单细胞分析
ATAC-seq公司
转座酶可及性染色质分析测序 (ATAC)-序列建立于 2013年,使用 Tn5型酶DNA的暴露区域。然后用 定量PCR扩增接头之间的 DNA并测序。 ATAC-seq公司使用了一个预先装载 DNA接头的突变超活性 Tn5型转座酶,旨在对基因组进行酶切时,同 步标记被剪切的 DNA片段(这个过程称为标签化)。带标签的 DNA片段通过 聚合酶链反应扩增并做二代测序 NGS公司一个区域中序列的频率与打开的染色质构象相关。
•最简便的实验方法:无需超声、酚-氯仿抽提、抗体 (ChIP-seq)或酶消化 (DNase-seq、MNase-seq)
•最快速的实验方法:不到 三小时即可完成,其他方案可长达 4完
• 信噪比最佳
•仅需 50000个或更少的细胞(推荐使用 500-50000 个细胞)
•单核苷酸分辨率有望实现
•通过采用流式细胞术/微流体技术的改编方案,可进行单细胞分析
• 费用较高,需要使用 Illumina公司公司的试剂盒 (Nextera DNA文库准备试剂盒)。
•成熟度较低,需要针对特定的细胞类型、组织和生物体优化细胞数量和裂解条件,才能获得理想的片段分布。
•胞
图 2:ATAC-seq实验方案。在此处查看 ATAC序列分步指南。
染色体构象技术
我们可以通过染色质接触图谱(染色质接触图谱)来评估染色质三维结构,从而揭示远距离基因组区域之间的物理相互作用。染色质构象捕获 (3C)技术的出现与以此为基础发展的技术方法使 得这种类型的作图成为可能。每种方法对于特定应用都具有特殊的优势,基于方法学的多样性,根据特定的目的选择某一种方法具有一定的挑战性。
图 3个:染色体构象技术。3C、4C、5C、ChIA-PET和 高-C的不同步骤
获取(3C)
3C公司利用甲醛交联将 三维染色质结构固定,然后进行限制性酶切。通过 定量PCR和测序分析切下的 DNA片段,确定不同 DNA区域的连接位置。这种用于分析 三维染色质结构和相互作用的方法首次出现于 2002年 (Dekker等人,2002年)现已成为更大规模、更高通量或特异性分析的一系列相关技术的基础。
环状染色体构象捕获 (4C)
4厘米能够识别与目标位点相互作用的未知 DNA区域,因此是发现特定区域内新的相互作用的理想之选 (Dekker等人,2006年)
提示:
碳拷贝染色体构象捕获 (5摄氏度)
第5页会形成与目标位点相结合的 DNA区域的连接产物文库,然后进行 NGS公司分析。当需要了解目标区 域的所有相互作用,例如需要绘制特定染色体的详细相互作用矩阵,那么 5摄氏度是理想之选。但是,5摄氏度不是真正的全基因组,因为每个 5摄氏度引物必须单独设计,所以 5摄氏度最适合某一特定区域 (Dotsie和Dekker,2007)
日期:
利用配对末端标签测序的染色质相互作用分析 (ChIA-PET)
ChIA-PET公司结合染色质免疫沉淀 (ChIP)和 3厘米的特征,通过特定蛋白来分析远端 DNA区域的相互作用。
ChIA-PET公司最适用于发现目标蛋白与未知 DNA的相互作用,例如研究转录因子的结合位点。因为在体内 DNA就与转录因子结合,产生了相互作用 (Fullwood等人,2009年)
ChIP-停止
ChIP-停止是染色质免疫沉淀 (ChIP)和 3C公司的结合,其采用的抗体靶向至疑似结合目标 DNA区域的蛋白。当确认两个已知的 DNA区域是否与目的蛋白有相互作用,ChIP-停止是理想之选。它适合用于确认疑似的相互作用,但不适用于发现新的相互作用 (Horike等人,2005年)
高-C
高-C扩增与从全基因组得到的连接产物,然后通过高通量测序评估其频率。如果需要广泛覆盖全基因组,高-C是一个很棒的选择,而且无需担忧分辨率。例如,绘制肿瘤细胞染色体结构的全基因组变化 (Lieberman-Aiden等人,2009年)
捕获-C
捕获-C将 3C公司和寡核苷酸捕获技术 (华侨城)相结合,加上高通量测序,一次可研究数百个位点。如果既需要高分辨率,又需要全基因组范围,捕获-C是理想之选。例如,分析基因组中每个疾病相关 SNP公司对局部染色质结构的功能影响 (Hughes等人,2014)
参考文献
Belton JM、McCord RP、Gibcus JH、Naumova N、Zhan Y和Dekker J(2012)。Hi-C:捕获基因组构象的综合技术。方法,58,268-76。
Dekker J、Rippe K、Dekker M和Kleckner N(2002年)。捕获染色体构象。《科学》,第2951306-1311页。
Dekker J.(2006)。染色体构象捕获的三个C:对照、对照、对照。《自然方法》,3,17-21。
Dostie J和Dekker J(2007)。利用5C技术绘制基因组元件之间的物理相互作用网络。《国家协议》,2988-1002年。
Dostie J、Zhan Y和Dekker J(2007)。染色体构象捕获碳拷贝技术。Curr Protoc Mol Biol,第21章,第21.14单元。
Horike S、Cai S、Miyano M、Cheng JF和Kohwi-Shigematsu T(2005)。Rett综合征患者静-色氨酸环缺失和DLX5印迹受损。《自然遗传学》,37,31-40。
富伍德MJ等. (2009). 雌激素受体-α结合人类染色质相互作用组。《自然》,46258-64。
利伯曼-艾登E等. (2009). 对长程相互作用的全面测绘揭示了人类基因组的折叠原理。科学,326289-293。
Hughes JR(2014年8月)。电子邮件面试。
休斯·JR等. (2014). 在单个高通量实验中,以高分辨率分析数百个顺调控景观。《Nat Genet》,第46期,第205-212页。
Simonis M、Kooren J和de Laat W(2007年)。对捕获DNA相互作用的基于3C的方法的评估。《自然方法》,第11895-901页。
van de Werken H、de Vree PJ、Splinter E、Holwerda SJ、Klous P、de Wit E和de Laat W(2012)。4C技术:协议和数据分析。酶学方法,51389-112