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因为原来的绿色荧光蛋白(GFP公司)基因于1992年被克隆1,荧光蛋白种类激增(FPs公司)可用。它们可以在转基因与抗体结合的细胞或动物,甚至在酶反应中用作底物。
在为这些应用中的任何一种选择荧光蛋白之前,需要记住一些关键的考虑因素。
C端与N端融合
如果可能的话,尝试两者;C末端融合蛋白通常更好。用抗体确认定位。
励磁和发射
确保你有正确的激光器来激励,并且发射峰值不会重叠。
亮度
选择同样符合您实验要求的最亮FP。
到期
选择快速/时间敏感事件的短成熟度。
漂白
选择具有高光稳定性的FP进行长时间的实验。
环境条件
确保pH值、温度和氧气适合您的FP。
密码子优化
检查FP密码子序列是否已优化/适合您的物种,尤其是在使用较旧的质粒时。
齐聚作用
通常,尽量使用单体FP。
要查看一些最流行的荧光蛋白的特性,请看我们的快速参考卡。
C对N:哪个终端?
你是否选择将FP融合到你感兴趣的蛋白质的C或N末端,很大程度上取决于蛋白质本身:它是如何折叠的,你选择的末端是否有功能要求。例如,如果C末端折叠在蛋白质内部,你就不太可能收到任何FP信号;或者,如果你的蛋白质在你的FP融合的末端被翻译后裂解,那么你的FP-将从你感兴趣的蛋白质中移除。
如果您有资源或者您的实验是新颖的,那么最好克隆C和N末端标记的构造,以确定最佳选项。一个研究小组发现,与N末端标记的融合蛋白相比,更多的C末端融合蛋白定位于预定的亚细胞隔室2然而,重要的是要强调,虽然C末端标记的蛋白质倾向于按预期定位和行为,但这并不总是可以预测的。
您应该使用针对天然蛋白的抗体来确认融合蛋白的定位。免疫荧光可用于检查融合蛋白是否正确定位;免疫印迹将有助于确认融合蛋白的大小正确,并以预期水平表达;联合免疫沉淀法可以帮助评估融合蛋白如何与已知底物相互作用三.
激发、发射和亮度
如果您计划使用多个FP,重要的是选择具有不同发射峰值的FP,以及可用激光器瞄准的激发峰值。如果排放峰值重叠,将很难或可能不可能区分它们。
为了获得清晰的信号并克服任何潜在的背景荧光,您通常希望在可用光谱中获得最亮的FP。亮度值是蛋白质消光系数和量子产率的乘积。然而,结果可能很难解释,因此FP相对于定义明确的FP(如EGFP)的亮度是一种常见的替代测量方法。
成熟和漂白
成熟度定义FP正确折叠、形成生色团并开始发出荧光所需的时间。对于活细胞中的时间敏感事件,较短的成熟时间可能很重要。例如,超级文件夹GFP(sfGFP)可以在10分钟内折叠,而mOrange2则需要4个多小时。
漂白是衡量光稳定性的一个指标,即激发后多久发色团失去发光能力。如果你计划进行长时间的延时实验,考虑一个具有高光稳定性的FP。T-saphire的漂白半衰期(T½;x光子/s的初始发射率降至一半的时间)为25秒,但EGFP更稳定,漂白T½为174秒4.
与大多数蛋白质一样,FP受pH值、温度和氧气水平的影响。根据您计划在其中使用FP的环境,您可能需要稍微调整条件或选择更合适的FP。
pH值会影响激发和发射峰值,大多数FP对酸敏感。一些FP可以在pH值变化时改变荧光强度(例如pHTomato)。pKa值是一个很好的pH敏感性指标:它显示了一半发色团荧光的pH值。
温度和氧气水平都会影响成熟时间:缺氧条件往往会延迟成熟时间,超出FP最佳范围的温度也是如此(例如EGFP已优化为37o个C) ●●●●。然而,像UnaG这样的新FPGFP公司从日本淡水鳗鱼中分离出来(日本鰻),即使氧气含量低也会发出荧光5.
由于大多数FP来源于水母或珊瑚蛋白质,而不是类似于哺乳动物细胞和组织的蛋白质,因此所使用的氨基酸密码子可能存在种间差异。这可能导致FP表达不良,从而导致低信号。
幸运的是,许多较新版本的FP都经过了密码优化,以反映哺乳动物细胞的偏好。在GFP公司例如,Jürgen Haas及其同事通过修改GFP密码子序列将信号提高了40–120倍6.
如果使用较旧的质粒生成融合蛋白,它可能不包含修改的FP序列。检查您的FP序列是否已被修改以用于特定物种。
重要的是要确定你的FP是单体还是二聚体(单体通常由蛋白质名称前的“m”表示,例如mCherry),以及这是否会影响你的实验。许多早期FP容易形成寡聚物,寡聚会影响融合蛋白的生物功能。例如,EGFP是一种单体,当使用到足够高的浓度时,可以形成二聚体,从而扭曲亚细胞器7或破坏FRET等实验8.
在绝大多数情况下,建议使用真正的单体FP。
有关FP的更多信息,访问我们的GFP页面.
工具书类
1.Prasher,D.C.、Eckenrode,V.K.、Ward,W.W.、Prendergast,F.G.和Cormier,M.J.维多利亚绿荧光蛋白的一级结构。基因 111,229–233 (1992).
2.Palmer,E.&Freeman,T.使用反向转染微阵列对C端和N端GFP融合蛋白进行亚细胞定位研究的研究。公司。功能。基因组学 5,342–353(2004年)。
3.Snapp,E.L.荧光蛋白质:细胞生物学家用户指南。趋势细胞生物学。 19,649–655 (2009).
4.Shaner,N.C.、Steinbach,P.A.和Tsien,R.Y.《荧光蛋白选择指南》。自然方法 2,905–909 (2005).
5.熊井,A。等。鳗鱼肌肉中的一种胆红素诱导荧光蛋白。单元格 153中,1602–1611 (2013).
6.Haas,J.、Park,E.-C.和Seed,B.HIV-1包膜糖蛋白表达中密码子的使用限制。货币。生物。 6,315–324 (1996).
7.Snapp,E.L.公司。等。低亲和力蛋白质相互作用形成堆积的内质网池。《细胞生物学杂志》。 163,257–269 (2003).
8.Zacharias,D.A.、Violin,J.D.、Newton,A.C.和Tsien,R.Y.将脂质修饰的单体GFP分配到活细胞的膜微结构域中。科学类 296,913–6 (2002).