重组抗β连环素抗体[E247]-芯片等级（ab32572）

Western blot假彩色图像：抗β连环蛋白抗体[E247]-1/5000稀释度切片级染色，绿色显示；小鼠抗GAPDH抗体[6C5](ab8245)在1/20000稀释度下加载控制染色，以红色显示。在Western blot中，ab32572与β连环蛋白特异结合。在野生型HepG2细胞裂解物中，在85 kDa处观察到一条带，而在CTNNB1基因敲除细胞株中，在这个大小没有观察到信号(阿布277911)为了得到这张图像，我们分析了野生型和CTNNB1基因敲除的HepG2细胞裂解物。首先，样品在SDS-PAGE凝胶上运行，然后转移到硝酸纤维素膜上。在3%的牛奶中，在TBS-0.1%吐温中，膜被阻塞^®20（TBS-T），然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。在TBS-T中清洗印迹四次，在室温下与二级抗体一起孵育1小时，再次清洗四次，然后成像。使用的次级抗体是山羊抗兔IgG H&L（IRDye^®800CW）预吸收(ab216773号)山羊抗鼠IgG H&L（IRDye^®680RD）预吸收(ab216776号)稀释1/20000。

ab32572在CTNNB1（β-连环蛋白）野生型HAP1细胞（上图）和CTNNB1（β-连环蛋白）基因敲除的HAP1细胞中的ab32572染色。细胞用100%甲醇固定（5min），用0.1%Triton X-100渗透5min，然后用1%BSA/10%正常山羊血清/0.3M甘氨酸在0.1%PBS吐温中封闭1h。然后在AB72/250稀释液中培养细胞ab195889号在1/250稀释度下（以伪红色显示）在+4°C下过夜，然后在室温下进一步培养1h山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor®488）预吸附（ab150081）二级抗体浓度为2μg/ml（以绿色显示）。用DAPI标记细胞核DNA。

这张照片是用共焦显微镜（徕卡微系统公司，TCSP8）拍摄的。

1-4车道：合并信号（红色和绿色）。绿色-在90 kDa下观察到ab32572。红色-装载控制，ab8245观测到37 kDa。

ab32572在野生型HAP1细胞中与CTNNB1（β-catenin）特异性反应。用β-catenin基因敲除样品未观察到条带。野生型和CTNNB1（β-catenin）基因敲除样品进行SDS-PAGE分析。ab32572和ab8245（小鼠抗GAPDH负荷对照）分别在4℃和1/5000稀释度和1/10000稀释度下培养过夜。用山羊抗兔IgG H&L（IRDye®800CW）预吸附（ab216773）以及山羊抗鼠IgG H&L（IRDye®680RD）预吸附（ab216776）二级抗体在1/20000稀释度下在室温下进行1小时成像。

人宫颈癌组织β-连环蛋白在1/500稀释度下的免疫组化分析。用柠檬酸缓冲液（pH6）进行热介导抗原回收

根据Abcam双X-芯片协议*从HCT 116细胞制备染色质。细胞用1.5mmEGS固定30min，然后用甲醛固定10min。

芯片使用25µg染色质、5µg ab32572（红色）或5µg兔正常IgG进行ab172730（灰色）和20µl蛋白质A/G琼脂糖珠。免疫沉淀的DNA用实时PCR定量（活性和非活性位点采用Taqman方法，异色位点采用Sybr green方法）

底漆和探针来自纸张PMID:28625518

*http://www.abcam.com/resources？keywords=X%20ChIP%20protocol

石蜡包埋大鼠肝胰腺的免疫组化分析，在1/1000稀释度下用ab32572标记β连环蛋白，然后使用兔特异性IHC聚合物检测试剂盒HRP/DAB(ab209101号)大鼠胰腺膜染色。在室温下用ab32572孵育30分钟。免疫染色在Leica Biosystems BOND®RX仪器上进行。苏木精复染。用Tris-EDTA缓冲液（ph9.0，表位检索溶液2）进行热介导抗原检索20分钟

二级抗体对照：用PBS代替一级抗体，二级抗体是一种现成的兔特异性IHC聚合物检测试剂盒HRP/DAB(ab209101号).

车道1-2：合并信号（红色和绿色）。绿色-在86 kDa时观察到ab32572。红色-抗GAPDH抗体[6C5]-负载控制(ab8245)在37 kDa下观察。

westernblot显示ab32572与野生型HeLa细胞中的β连环蛋白反应。敲除细胞系时出现信号丢失阿布255352（敲除细胞裂解物ab263756)被利用了。用helna基因敲除helna-b1型细胞。在0.1%TBST和3%脱脂奶粉中室温下封膜1h。ab32572和抗GAPDH抗体[6C5]-负荷控制(ab8245)分别在1:500稀释度和1:20000稀释度下在4°C下过夜。用山羊抗兔IgG H&L（IRDye）制备印迹^®800CW）预吸收(ab216773号)山羊抗鼠IgG H&L（IRDye^®680RD）预吸收(ab216776号)二级抗体在成像前在室温下稀释1小时。

Western blot假彩色图像：抗β连环蛋白抗体[E247]-1/5000稀释度切片级染色，绿色显示；小鼠抗GAPDH抗体[6C5](ab8245)在1/20000稀释度下加载控制染色，以红色显示。在Western blot中，ab32572与β连环蛋白特异结合。在野生型HCT 116细胞裂解物中，在95 kDa处观察到一条带，而在CTNNB1 CRISPR-Cas9编辑的细胞株中没有观察到这种大小的信号阿布273712（CRISPR-Cas9编辑细胞裂解液ab275247型).在CRISPR-Cas9编辑的裂解产物通道中观察到的低于95 kDa的条带可能代表β-连环蛋白的截短形式。这还没有进一步的研究，基因产物的功能特性也没有确定。为了生成这张图像，我们分析了野生型和CTNNB1 CRISPR-Cas9编辑的HCT 116细胞裂解物。首先，样品在SDS-PAGE凝胶上运行，然后转移到硝酸纤维素膜上。在5%的牛奶中，在TBS-0.1%吐温中，膜被阻塞^®20（TBS-T），然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。在TBS-T中洗涤印迹四次，在室温下与二级抗体一起培养1小时，再次洗涤四次，然后成像。使用的次级抗体是山羊抗兔IgG H&L（IRDye^®800CW）预吸收(ab216773号)山羊抗鼠IgG H&L（IRDye^®680RD）预吸收(ab216776号)稀释1/20000。

β-连环蛋白从0.35mg小鼠脑裂解液中以1/30稀释度ab32572（0.35mg裂解液中2μg）免疫沉淀。免疫沉淀用ab325721/1000稀释液（1.962μg/ml）进行Western印迹。IP检测试剂（HRP）的VeriBlot(ab131366号)以1/1000稀释度作为二级抗体。

第一道：小鼠脑组织裂解液10μg

第二道：小鼠脑组织裂解物

通道3：兔单克隆抗体(ab172730)而不是ab32572在小鼠脑中的裂解物。

封闭稀释缓冲液和浓度：5%NFDM/TBST。

曝光时间：1秒

石蜡包埋大鼠肝脏组织的免疫组化分析，在1/1000稀释度下用ab32572标记β-连环蛋白，然后使用兔特异性IHC聚合物检测试剂盒HRP/DAB(ab209101号)大鼠肝脏膜染色。在室温下用ab32572孵育30分钟。免疫染色在Leica Biosystems BOND®RX仪器上进行。苏木精复染。用Tris-EDTA缓冲液（ph9.0，表位检索溶液2）进行热介导抗原检索20分钟

二级抗体对照：用PBS代替一级抗体，二级抗体是一种现成的兔特异性IHC聚合物检测试剂盒HRP/DAB(ab209101号).

石蜡包埋小鼠胰腺组织的免疫组化分析，在1/1000稀释度下用ab32572标记β连环蛋白，然后使用兔特异性IHC聚合物检测试剂盒HRP/DAB(ab209101号)小鼠胰腺膜染色。在室温下用ab32572孵育30分钟。免疫染色在Leica Biosystems BOND®RX仪器上进行。苏木精复染。用Tris-EDTA缓冲液（ph9.0，表位检索溶液2）进行热介导抗原检索20分钟

二级抗体对照：用PBS代替一级抗体，二级抗体是一种现成的兔特异性IHC聚合物检测试剂盒HRP/DAB(ab209101号).

石蜡包埋小鼠肝组织的免疫组化分析，用1/1000稀释度的ab32572标记β-连环蛋白，然后使用兔特异性IHC聚合物检测试剂盒HRP/DAB(ab209101号).小鼠肝脏膜染色。在室温下用ab32572孵育30分钟。免疫染色在Leica Biosystems BOND®RX仪器上进行。苏木精复染。用Tris-EDTA缓冲液（ph9.0，表位检索溶液2）进行热介导抗原检索20分钟

二级抗体对照：用PBS代替一级抗体，二级抗体是一种现成的兔特异性IHC聚合物检测试剂盒HRP/DAB(ab209101号).

石蜡包埋人乳腺癌组织的免疫组化分析ab32572标记β连环蛋白，然后用山羊抗兔IgG H&L（HRP）。乳腺癌膜染色。用AB229002号室温下30分钟。免疫染色是在莱卡生物系统键上进行的^®接收仪器。苏木精复染。热介导抗原检索阿布93684（Tris/EDTA缓冲液，pH值9.0）。

二级抗体对照：用PBS代替一级抗体，二级抗体是一种现成的山羊抗兔IgG-H&L（HRP）。

封闭/稀释缓冲液和浓度：5%NFDM/TBST。

曝光时间：180秒

人乳头状癌组织β-连环蛋白在1/500稀释度下的免疫组化分析。用柠檬酸缓冲液（ph6）进行热介导抗原回收。

β-连环蛋白从0.35mg A431（人表皮样癌上皮细胞）全细胞裂解液中以1/50稀释度ab32572（0.35mg裂解液中2μg）免疫沉淀。免疫沉淀用ab325721/500稀释液（2μg/ml）进行Western印迹。IP检测试剂（HRP）的VeriBlot(ab131366号)以1/1000稀释度作为二级抗体。

Lane 1:A431（人表皮样癌上皮细胞）全细胞裂解液10μg

通道2:A431全细胞裂解液中的ab32572 IP

通道3：兔单克隆抗体(ab172730)而不是A431全细胞裂解液中的ab32572。

封闭稀释缓冲液和浓度：5%NFDM/TBST。

曝光时间：3秒

人肺腺癌组织β-连环蛋白在1/500稀释液中的免疫组化分析。用柠檬酸缓冲液（ph6）进行热介导抗原回收。

ab32572对BIO处理的SW480细胞的β-连环蛋白染色(ab120891号)国际商会/国际单项体育联合会。如文献所述，β连环蛋白表达增加与生物浓度增加相关。
细胞在37°C下在含有不同浓度ab120891号（BIO）在DMSO中，室温下用4%甲醛固定10min，室温下用含10%山羊血清、0.3m甘氨酸、1%牛血清白蛋白和0.1%吐温的PBS封闭2h。在含有1%BSA和0.1%吐温的PBS中，在4℃下用ab32572（1/200）稀释液对处理过的细胞进行染色。A山羊抗兔IgG H&L（DyLight®488）预吸附（ab96899）二级抗体以1/250稀释度作为次级抗体。细胞核用DAPI复染，呈蓝色。

用ab32572在1/5000稀释度下结合抗肌动蛋白抗体对WT和基因破坏细胞的总细胞提取物进行WB分析。给出了β-连环蛋白、截短β-连环蛋白和肌动蛋白带的位置和全长。对于野生型细胞，每个车道使用5µg TP和基因中断克隆30µg TP。

细胞在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂片的RIPA缓冲液中裂解。通过离心法清除细胞裂解物，并将蛋白质浓度为5–30µg的总蛋白装入SDS样品缓冲液中，并将其分离。

次级抗体为驴抗兔IgG-HRP，稀释1:5000。

ab32572在人肾癌组织中呈阳性染色。

人肾癌组织β-连环蛋白在1/500稀释度下的免疫组化分析。用柠檬酸缓冲液（ph6）进行热介导抗原回收。

ab32572在奥氮平处理的人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH中的β-连环蛋白染色(ab120736号)国际商会/国际单项体育联合会。

如文献所述，β连环素表达增加与奥氮平浓度增加相关。
细胞在37°C下在含有不同浓度的培养基中培养24小时ab120736号（奥氮平）在二甲基亚砜中，室温下用4%甲醛固定10分钟，室温下用含10%山羊血清、0.3 M甘氨酸、1%牛血清白蛋白和0.1%吐温的PBS封闭2小时。在含有1%BSA和0.1%吐温的PBS中，在4°C下用ab32572（1/200稀释度）对处理过的细胞进行染色。A山羊抗兔IgG H&L（DyLight®488）预吸附（ab96899）二级抗体以1/250稀释度作为次级抗体。细胞核用DAPI复染，呈蓝色。

ab32572免疫印迹法检测U-2os细胞全细胞裂解物。在21℃下用5%的牛奶封闭凝胶1小时。将一级抗体稀释1/5000，在4℃下孵育12小时。将HRP结合的猪抗兔抗体用作次要抗体。

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β-连环蛋白在肝细胞癌组织和癌旁肝组织中的不同表达水平。

将hct、plt石蜡包埋，切取5μm厚切片进行苏木精-伊红染色和免疫组化（IHC）分析。ab32572以1:400的稀释度使用。第二种抗体是生物素化的IgG，在37℃下孵育40分钟。最后，用3，3-二氨基联苯胺溶液观察组织切片并用苏木精复染。用磷酸盐缓冲液代替原抗体作为IHC的对照。

hct（E-H）和PLTs（M-P）分别检测到β-连环蛋白呈阴性、弱、中、强染色活性。上图E部分，完整图像请参阅原稿。

大脑（老鼠）。

用5%牛奶阻塞。在22°C时，阻塞时间为1小时。

ECL检测。曝光时间：5秒。

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周细胞。

封闭稀释缓冲液及浓度：5%牛奶。堵塞时间为1小时，温度为22℃

曝光时间：10秒

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