炸薯条 掌握握畏畏畏畏畏畏畏畏畏畏畏畏畏畏畏畏畏畏 炸薯条 技术方面还不成熟,您可以考虑使用一种试剂盒,例如 炸薯条 试剂盒 大约500英镑 。
交联
距离您的目标相互作用 DNA 越远,无交联的 炸薯条 效率就越低。
用于组蛋白修饰的 炸薯条 不太可能需要交联,但 DNA 结合复合物中包含的转录因子和蛋白质等非组蛋白可能需要交联。
甲醛是一种非常好的 DNA- 蛋白质交联剂,但由于尺寸小 (2 Å), 它并不是一种非常有效的蛋白质-蛋白质交联剂。因此,通常很难对不直接与 DNA 质量 炸薯条 分析。
始终执行时间进程实验,以优化交联条件。我们建议将样本交联
2-30 分钟。加入甘氨酸淬灭甲醛,终止交联反应。
无论您使用什么方法,每次设置实验时,一定要运行片段化时间过程。
酶切不会产生染色质的随机切片。微球菌核酸酶对基因组序列的某些区域有利,但对 DNA 的消化不均匀或不相同。结果可能不完全准确,因为某些位点可能被过度表达,而且一些数据可能会被遗漏。
做 N-ChIP 时,应进行 X-ChIP、 工作
尽管超声处理最适合 X-ChIP、 酶消化对完全交联的样本无效,但需要温和或不完全交联时,微球菌核酸酶消化是有用的,它可以结合超声处理,提高分辨率。
避免起泡,因为起泡会导致溶液内的能量转移减少,并降低超声效率。
超声处理的染色质可在液氮中速冻,并在 - 80℃ 条件下保存长达 2 个月。避免多次 冻融。
即使充分表征,也无法说明一个抗体是否会在 X-ChIP公司 中发挥作用,因为交联的影响可以达到戏剧性的程度,以至产生不同的表位,特定表位可能会丢失。如需检测一个未表征的抗体是否可以进行 炸薯条, 可以先用抗体进行炸薯条, 然后用同样的抗体进行 western印迹
请记住,这些抗体本身并不是阳性和阴性对照,因为对照取决于您正在研究的位点:如果在特定的目标位点没有 H3K4me3 那么全球最好的抗 H3K4me3氯化钾 级抗体将不会免疫沉淀来自该区域的任何东西,因此不是一个合适的阳性对照。
作为阴性对照,使用识别非染色质表位的抗 体,如抗 GFP公司 抗体。
染色质重塑可能移动或移除特定位点的组蛋白,例如活性启动子,因此使用针对非修饰组蛋白 ( 如组蛋白 H3) 的对照抗体来检查特定基因组位点的核小体的保存。
分析组蛋白修饰时,需要标准化到组蛋白内容物。这一操作可以用抗 人3 抗体 ( 公元1791年 ) 完成。
即使抗体能够将目的蛋白免疫沉淀在甲醛固定的染色质中,也并不意味着 炸薯条 实验已经奏效,因为有可能您的目的蛋白没有与 DNA 交联。
如果观察到高背景,可能需要额外清洗。另外,在免疫沉淀前,还可以用蛋白 A/G公司 微珠孵育 1 小时,从而预清除超声处理的染色质。在该附加步骤中去除与微珠的任何非特异性结合。
测量起始物料的数量 ( 和质量)是有效解释结果的关键。
还有哪些处理可能会影响我的
请勿在高 每分钟转数( 不超过 6000转/分) 下离心琼脂糖凝胶微珠,否则会压缩微珠并损坏微珠。
一些抗体会受到浓度相对较低的 SDS公司 的 影响。