硬骨魚類作為較低等的脊椎動物，其免疫系統分為非特异性免疫（Innate）和特异性免疫（Adaptive）兩種（Sasimanaset al，2015）。魚類受外界抗原刺激後會進入應激狀態，非特异免疫系統被啟動以抵禦病原菌感染。免疫應答過程中，產生大量的活性氧自由基（ROS），刺激機體新增抗氧化酶的分泌，如過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等來清除過量的ROS。而免疫相關組織受損後導致ROS清除能力下降，過剩的ROS會對機體造成生物損傷及免疫力下降，繼而表現出發病症狀，如發炎、腫瘤等（Sifaet al，2002）。囙此，可以通過檢測病原菌脅迫後魚體內血液和相關組織的生化名額來評估魚體的健康狀態。

羅非魚是聯合國糧農組織（FAO）向全世界推廣養殖的優良品種（Zhuet al，2017），也是中國水產養殖的重要品種（Zhuet al，2015）。近幾年，受羅非魚養殖規模的盲目擴大和養殖環境惡化等因素的影響，中國南方地區90%的羅非魚養殖場均不同程度暴發過無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）病，感染死亡率最高可達90%（Yeet al，2011；Chenet al，2012），給養殖從業者造成了巨大的經濟損失，現時，尚未找到有效根治的措施。為從種源上提高羅非魚抵抗無乳鏈球菌侵染的能力，開展抗無乳鏈球菌病品種選育已刻不容緩，而篩選出羅非魚抗病效能評估名額是開展抗病育種的關鍵。現時，對羅非魚感染細菌性疾病後機體內血清生化名額的研究已有相關報導，如Chen等（2012）等研究了羅非魚在海豚鏈球菌菌（Streptoccus iniae）和創傷弧菌（Vibrio vulnificus）脅迫下血清生化名額的變化，Benli等（2004）研究了尼祿羅非魚（Oreochromis niloticus）感染遲鈍愛德華菌（Edwardsiella tarda）後的免疫相關酶的活性變化，韋現色等（2014）檢測了吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）感染無乳鏈球菌後尿素氮、肌酐含量以及肝胰腺溶菌酶、穀丙轉氨酶和黃嘌呤氧化酶的活性變化。以上研究僅針對病原菌脅迫感染後對羅非魚機體內免疫相關酶活性的影響，並沒有開展抗病效能評估免疫酶名額篩選的報導。

本研究對抗病力較强的奧尼羅非魚（Oreochromis aureus×O. niloticus）、較易發病的吉富羅非魚“百桂”品系及經5個世代選育後的吉富羅非魚抗病品系進行人工感染無乳鏈球菌，比較3個品系感染後的存活率、肝胰腺組織和血清中的免疫相關酶的活性變化，旨在篩選出羅非魚抗無乳鏈球菌感染能力的評估名額，為羅非魚抗病新品種選育提供參攷依據。

1資料與方法 1.1實驗資料

實驗資料為吉富羅非魚抗病選育系F₅代（以下簡稱抗病品系）、奧尼羅非魚（以下簡稱奧尼品系）和吉富羅非魚“百桂”品系（以下簡稱“百桂”品系），均來源於國家級廣西南寧羅非魚良種場。選取健康有活力、規格統一[平均重為（56.48±0.70）g]的3個羅非魚品系各125尾，常規暫養8~10 d，水溫為30℃~31℃。實驗前，先用雞血平板對3個羅非魚品系（每個品系3尾魚）進行接種分離，檢測是否攜帶鏈球菌病原。

1.2菌株來源與復蘇

實驗所用的菌株（無乳鏈球菌HN016）由本院魚病防治研究室饋贈。菌株的復蘇與培養參攷朱佳傑等（2012）的方法，培養的菌液經革蘭氏染色無雜菌後用PBS溶液將菌液稀釋至半數致死濃度1×10⁷CFU/ml。

1.3無乳鏈球菌感染實驗

人工腹腔注射管道感染無乳鏈球菌，每個品系注射90尾魚（30尾魚為1個重複，養殖容器為1 m³水桶），每尾魚注射0.2 ml菌液。每個品系均設對照組（30尾），注射等量PBS溶液。感染後每隔3 h觀察1次實驗魚的情况，實时記錄死魚數量，保持水質新鮮。

1.4樣品採集、處理與測定

無乳鏈球菌感染後，每個實驗組分別於0 h（感染實驗前）、感染後24 h取3尾魚進行尾靜脈采血，分離血清，保存於–20℃；同時，採集0 h、感染後5 h和24 h的肝胰腺組織，保存於-80℃。分別測定血清和肝胰腺組織中SOD、CAT、酸性磷酸酶（ACP）、鹼性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）、總抗氧化能力（T-AOC）的活性。酶活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5資料處理

使用SPSS 18.0統計軟體進行統計學處理，計算所得數據以平均值±標準差（Mean±SD）表示。各組間差异使用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行多重比較。

2結果與分析 2.1無乳鏈球菌脅迫下不同羅非魚品系的死亡率統計

3個羅非魚品系感染後都出現了典型的無乳鏈球菌病症狀，其表現為魚體失去平衡上下翻滾、打圈圈、鰓充血、眼球渾濁紅腫等，解剖後發現，肝胰腺、腎、脾明顯腫大出血、腸排空等症狀。採用黎炯等（2010）的無乳鏈球菌PCR鑒定方法確診感染了無乳鏈球菌病。3個品系感染無乳鏈球菌後的累積死亡率如圖1所示，感染後24 h開始出現死魚，24~72 h為死亡高峰期，72 h後死亡魚數量逐漸趨向平穩。抗病品系、“百桂”品系和奧尼品系的平均累積死亡率分別為60.5%、78.6%和55.4%（圖1）。

2.2 3個羅非魚品系感染無乳鏈球菌後肝胰腺組織中免疫相關酶活性的變化

由圖2A可見，感染前（0 h），3個羅非魚品系肝胰腺組織中ACP活力的大小依次為“百桂”品系>奧尼品系>抗病品系，三者之間差异顯著（P< 0.05）。感染後5 h，抗病品系和奧尼品系的ACP活力顯著上升，而“百桂”品系的ACP活力顯著下降（P< 0.05）。感染後24 h，抗病品系和奧尼品系的ACP活力顯著下降，其中奧尼品系的ACP活力顯著低於其他品系（P< 0.05）。

由圖2B可見，感染前（0 h），奧尼品系肝胰腺中AKP活力顯著低於其他2個品系（P< 0.05）。感染後5 h，抗病品系和奧尼品系的AKP活力顯著上升（P< 0.05），而“百桂”品系與感染前相比差异不顯著（P>0.05）。感染後24 h，和奧尼“百桂”品系肝胰腺組織的AKP活力均顯著下降。

由圖2C可見，感染前（0 h）3個品系肝胰腺中的CAT活力以奧尼品系的活力最高，各組間比較差异顯著（P< 0.05）。感染後5 h，3個品系的CAT活力均顯著下降，各組間差异顯著（P< 0.05）。感染後24 h，CAT的活力逐漸上升，但仍低於感染前的水准，其中，以奧尼品系的活力最高。

由圖2D可見，感染前（0 h），抗病品系和奧尼品系肝胰腺中SOD活力顯著低於“百桂”品系（P< 0.05）。感染後5 h，抗病品系和奧尼品系的SOD活力顯著上升，而“百桂”品系則顯著下降（P< 0.05），抗病品系和奧尼品系的SOD活力均高於“百桂”品系。感染後24 h，3個品系的SOD活力均低於感染前的水准，其中，抗病品系的活力最高。

由圖2E可見，感染前（0 h），3個品系肝胰腺組織中T-AOC活力大小依次為抗病品系>“百桂”品系>奧尼品系，三者間差异顯著（P< 0.05）。感染後5 h，奧尼品系中T-AOC活力顯著上升，“百桂”品系中T-AOC活力顯著下降（P< 0.05）。感染後24 h，抗病和奧尼品系的T-AOC活力均顯著下降（P< 0.05），其中，抗病品系的活力最高。由圖2F可見，感染前（0 h），3個品系肝胰腺中LZM的活力大小依次為奧尼品系>抗病品系>“百桂”品系。感染後5 h，抗病選育品系的活力顯著上升（P< 0.05），奧尼品系的活力則顯著下降（P< 0.005），感染後24 h，抗病品系和奧尼品系均顯著下降，其LZM活力均低於感染前的水准，而“百桂”品系在感染前後均無顯著變化（P>0.05）。

2.3 3個羅非魚品系感染無乳鏈球菌後血清中免疫相關酶活性的變化

3個羅非魚品系感染無乳鏈球菌後血清中免疫相關酶活性的變化見圖3。在無乳鏈球菌感染24 h後，抗病和奧尼品系的ACP和T-AOC活性均顯著上升（P< 0.05），而“百桂”品系變化不顯著（P>0.05）；AKP、CAT和LZM在3個品系感染24 h後均顯著上調（P< 0.05），其中，AKP和CAT以奧尼品系的活性最高，LZM則以抗病品系活性最高；SOD在感染24 h後活性呈下降趨勢，抗病選育品系和奧尼羅非魚下降最明顯，這2個品系與“百桂”品系相比差异顯著（P< 0.05）。

對3個品系感染無乳鏈球菌前後肝胰腺組織和血清中6個免疫相關酶活性進行關聯分析發現，在感染後24 h，AKP和CAT在奧尼品系的表達量顯著高於抗病品系和奧尼品系（P< 0.05），結合奧尼品系感染無乳鏈球菌後的存活率最高得出，可以通過檢測不同羅非魚個體或群體感染無乳鏈球菌後24 h AKP和CAT的表達量高低來判斷個體或群體抗病力的强弱。

3討論

魚類屬於較低等的生物，在受到外界環境脅迫應激時，非特异性免疫系統作為魚類抵抗病原的第一道屏障率先發揮作用，免疫過程會誘發魚體免疫器官釋放大量的活性氧自由基（ROS）到血液中，經血液迴圈後到達各個組織，過量的ROS會對機體各個組織器官的機能造成損傷（Ardóet al，2010），從而表現出症狀。無乳鏈球菌屬於革蘭氏陽性菌，是現時中國羅非魚養殖的首要致病菌（黎源等，2017），感染後的羅非魚體內典型的病變就是肝胰腺組織腫大壞死，而肝胰腺是羅非魚機體物質代謝的中樞器官和解毒器官（Chenet al，2011；强俊等，2012）。血液的生理生化是評估魚體的健康狀態的一個重要參數，可作為實时反映魚類的生理狀態變化和機體抵禦抗原的有力名額（Chenet al，2013；Clausset al，2008）。囙此，研究羅非魚感染無乳鏈球菌後肝胰腺組織及血液中免疫相關酶活性的變化，對研製防治藥物及篩選抗病評估名額均具有重要意義。

ACP和AKP廣泛分佈於動物體內，是2種參與磷酸基團轉移和代謝的調控酶。ACP是巨噬細胞溶菌酶的特徵性酶，直接參與吞噬作用，能協助殺死及吞噬病原體，還能形成水解酶體系消除异物，主要存在於魚類的肝胰腺、脾臟和血液中（Grindeet al，1998）。AKP是機體解毒系統中的重要組成之一，在鹼性環境下能水解磷酸單酯起到解毒的作用，發揮免疫防禦功能（劉石林等，2016）。高溫脅迫刺參（Apostichopus japonicus）（劉石林等，2016）和亞硝酸鹽脅迫草魚（Ctenopharyngodon idellus）（葉俊等，2016）均顯著影響到ACP和AKP酶活力的變化。馮寧寧等（2014）研究發現，ACP和AKP可作為評估脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）抗WSSV能力的名額。本研究發現，在感染前抗病品系和奧尼品系肝胰腺組織的ACP和AKP酶活力均低於“百桂”品系，而感染後抗病和奧尼品系均呈先上升後下降的趨勢，這可能是感染後體內病原菌的增殖使得肝胰腺組織通過去磷酸化應激反應來適應病原菌的侵染有關，而“百桂”品系由於抵抗感染能力較弱，則處於下降趨勢。此外，3個品系感染後24 h的血清中AKP活力均呈現上升趨勢，這是由於肝胰腺及其他免疫器官組織因病原菌入侵釋放了大量的活性氧自由基（ROS），這些ROS通過新陳代謝進入血液迴圈系統中，從而導致血清中的AKP酶活力在處於上升狀態，其中，奧尼羅非魚感染後，肝胰腺和血清中的AKP酶活性均顯著高於其他2個品系。由此暗示，通過檢測無乳鏈球菌感染後AKP酶活性高低，可作為評估羅非魚抗感染能力强弱的一個名額。

SOD是機體抗氧化的關鍵酶之一（羅勝玉等，2017），在清除機體活性氧自由基、輔助吞噬細胞增强殺菌功能及提高機體的免疫功能等方面起著重要作用，可作為反映機體自由基代謝和氧化損傷的重要依據，為判斷魚體的健康水准及免疫能力提供參考（徐增輝等，2008；Zenteno-Savinet al，2006）。唐保軍等（2017）研究發現，高鹽度脅迫黃邊糙鳥蛤（Trachycardium flavum）後，SOD活性呈先升高後下降的趨勢。本研究發現，感染後5 h，抗病品系和奧尼品系肝胰腺的SOD活力顯著上升，這說明由於病原菌的侵入引起的免疫應答和炎症反應很可能引起魚體內ROS積聚，從而引發肝胰腺組織合成SOD酶的能力增强，減輕ROS對機體損傷。而感染後24 h，肝胰腺組織和血清中SOD活力均明顯下降，說明病原菌已引發相關組織損傷，導致機體新陳代謝和能量代謝合成各種酶的能力下降。

CAT作為機體重要的抗氧化功能酶，能够催化過氧化氫分解，補償機體清除自由基的能力。T-AOC能反映機體抗自由基的能力（Elvitigalaet al，2013）。趙靜等（2015）研究發現，齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti）感染嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）後，血清中的CAT和T-AOC呈現短暫上升後再下降的趨勢。本研究發現，3個羅非魚品系感染後，血清中CAT和T-AOC活性明顯升高，表明病原菌脅迫魚後啟動了機體的抗氧化系統，通過提高相關酶的活性來清除機體產生的ROS，其中，奧尼品系的活性顯著高於其他2個品系。而感染後在肝胰腺組織和血清中CAT的活性以奧尼品系最高，“百桂”品系最低。綜合比較CAT在3個品系的肝胰腺和血清中的變化，再結合它們的感染存活率，可將CAT作為評估羅非魚抗無乳鏈球菌感染能力强弱的一個生化名額。

LZM作為魚類的非特异性免疫物質之一，主要在肝胰腺內合成通過裂解外源性病原菌的細胞壁、糖苷鍵或醯基葡萄糖鍵來達到清除病原菌的目的，尤其對革蘭氏陽性菌有良好的殺菌作用，本研究所用無乳鏈球菌屬於革蘭氏陽性菌（Fujimotoet al，2001）。本研究發現，抗病品系的肝胰腺組織在感染無乳鏈球菌後5~24 h，肝胰腺體組織的LZM活力呈先升高後降低的趨勢，這與溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）感染三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）（謝建軍等，2011）和鰻弧菌（Vibrio anguillarum）感染中國明對蝦（Penaeus monodon）（Yinet al，2014）的結果相近，說明無乳鏈球菌進入羅非魚體內後，機體提高了肝胰腺LZM的合成量並釋放到血清中。而LZM活力的提高，可增强LZM清除無乳鏈球菌的能力，提高機體的免疫抵抗力。而“百桂”品系的LZM活力在感染前後變化不明顯，這可能是該品系對無乳鏈球菌刺激在LZM的分泌上反應不敏感，導致LZM活力的變化不大。

本研究分析了3個羅非魚品系感染無乳鏈球菌後肝胰腺組織和血清中SOD、CAT、ACP、AKP、LZM和T-AOC酶活性的變化，結合3個品系感染後的存活率進行關聯分析，篩選出AKP和CAT可作為評估羅非魚抗無乳鏈球菌病能力的生化名額。研究結果可為羅非魚抗無乳鏈球菌新品種選育提供參攷依據。