褐石斑魚（Epinephelus bruneus）、雲紋石斑魚（Epinephelus moara）和鞍帶石斑魚（Epinephelus lanceolatus）均隸屬於鱸形目（Perciformes）、科（Serranidae）、石斑魚亞科（Epinephelinae）、石斑魚屬（Epinephelus）。褐石斑魚俗稱土溝龍、假油斑，通體褐色，體側6條條帶，通常不明顯，條帶內有細小白色斑點，最大體重可達33 kg，主要分佈於西北太平洋區，北至韓國、日本，南至中國（香港、海南島以及臺灣沿岸），其味道鮮美，生長快，適應能力强，飼養成活率高，便於鮮活魚暫養運輸，經濟價值較高。但其人工繁育尚未取得成功，現時，主要來源於野生捕撈，產量不高（王波等，2006）。雲紋石斑魚俗稱草斑、真油斑，體褐色，體側有6條深棕色條帶，條帶內有雲狀白色斑塊，分佈於中國的南海、東海、臺灣海峽、香港和日本海域等（郭明蘭，2009），其肉質鮮美，是我國重要的石斑魚養殖種類，但生長速度慢，養殖成本較高。褐石斑與雲紋石斑魚形態特徵相似，相關研究開展前，二者曾被認為是同一種魚（Liuet al，2013）。鞍帶石斑魚是石斑魚類群中體型最大的魚類，有巨石斑之稱，廣泛分佈於東南亞、澳大利亞海域，在中國的南海海域亦有分佈（周玲等，2010），生長速度快，肉質好，食用價值高，是具有良好養殖前景的優質石斑魚類，但其存活率低，無法大規模養殖。

雜交育種可將雙親的優良性狀結合，現時，已經廣泛用於石斑魚新品種的培育。本研究利用鞍帶石斑魚冷凍精子分別與褐石斑魚、雲紋石斑魚進行雜交實驗，並對2個雜交後代的胚胎發育、仔稚幼魚的生長發育情况進行觀察記錄，同時對其變態原因進行分析，比較同一父本與2個相近母本雜交後代的發育生物學特點及雜交優勢，旨在為石斑魚雜交育種和新品種培育及規模化繁育提供基礎數據。

1資料與方法 1.1鞍帶石斑魚與褐石斑魚、雲紋石斑魚雜交受精及仔稚幼魚培育

實驗於2018年5月25日在山東省煙臺市萊州明波水產有限公司進行。實驗所用褐石斑魚親魚和雲紋石斑魚親魚均為野生馴養群體，雄魚採用精子冷凍庫中鞍帶石斑魚精子，褐石斑魚（♀）×鞍帶石斑魚（♂）雜交後代為實驗組（簡稱褐龍石斑魚）、雲紋石斑魚（♀）×鞍帶石斑魚（♂）雜交後代為對照組（簡稱雲龍石斑魚）。在親魚成熟期，分別選取發育良好的雌魚，利用MS-222進行麻醉，胸鰭基部注射絨毛膜促性腺激素（HCG）500~800 IU/kg進行催產。48 h後，輕壓雌魚腹部將卵擠出至盆中，同時，將同一鞍帶石斑魚冷凍精子在37℃水浴中解凍，分別加到盛有褐石斑魚和雲紋石斑魚卵的盆中，精液：卵體積比=1:500，充分攪拌，使精液和卵混勻，後加入2倍體積海水啟動精子進行受精，靜置10 min後，篩絹過濾上浮卵，洗去黏液，放入孵化缸中孵化。孵化缸中水溫為24℃，鹽度為30，微充氣。24 h後，將孵化缸中的受精卵投放到育苗池中，培育溫度為24℃~26℃，鹽度為29~31，DO≥10 mg/L。前期仔魚採取靜水培育，後期逐漸增大換水量。3 d後，向池中添加小球藻（Chlorella），開口餌料為牡蠣（Crassostrea gigas）受精卵，後期按生長需求投喂S型輪蟲（Brachionus plicatilis）、L型輪蟲、鹵蟲（Artemia salina）無節幼體、大鹵蟲及配合飼料等。

1.2仔稚幼魚變態發育觀測

胚胎發育及仔魚前期利用DSY2000X倒置生物顯微鏡進行觀察，詳細記錄各個發育時間及相應特徵，並用OPTPro2012軟件進行拍照，同時，量測卵徑和油球徑。卵黃囊消失後，利用Olympus解剖鏡（日本）觀察魚苗形態特徵及發育情况，發育至36 d時，改用數位相機進行拍照，同時，利用AJ-VERT軟件對全長、第2背鰭棘長、腹鰭棘長和肛前距等生長性狀進行量測記錄。

1.3雜交後代生長比較

褐龍石斑魚與雲龍石斑魚仔魚生長前期形態每天變化較大，幼魚期形態變化放緩，囙此，孵化後1~13 d，每天取樣1次；13 d後，每隔4~6 d取樣1次。取樣時，觀察魚的形態變化、運動及生活習性，並對每尾魚的卵黃囊長徑、短徑、油球直徑、魚苗全長、肛前距、第2背鰭棘長和腹鰭棘長進行量測記錄並拍照。

1.4資料處理與分析

受精卵發育至囊胚期時，每次從孵化缸中隨機抽取100~200顆受精卵統計受精率，統計3次；發育至尾芽期、孵化期時，採用相同辦法對畸形率、孵化率進行觀察統計。

受精率（%）=發育至囊胚期卵數/總卵數

畸形率（%）=發育至尾芽期畸形卵數/受精卵數

孵化率（%）=孵化出膜仔魚數/受精卵數

胚胎和仔稚幼魚的可量性狀數據採用Excel和SPSS 18.0統計軟體進行分析，數據以平均值±標準差（Mean±SD）表示。

全長日增長率、肛前距日增長率按如下公式計算：

全長日增長率（%）=（lgL₂-lgL₁）/[0.4343（t₂-t₁）]

肛前距日增長率（%）=（lgP₂-lgP₁）/[0.4343（t₂-t₁）]

式中，L為全長，P為肛前距，t為日齡。

2結果與分析 2.1仔稚幼魚形態發育 2.1.1受精率、畸形率和孵化率

褐龍石斑魚受精率、畸形率和孵化率分別為（87.38±0.03）%、（47.71±0.05）%、（43.58±0.04）%。雲龍石斑魚受精率、畸形率和孵化率分別為（86.19±0.06）%、（37.34±0.14）%和（52.51±0.05）%。2個雜交後代受精率相差無幾，褐龍石斑魚畸形率高於雲龍石斑魚，孵化率低於雲龍石斑魚。

2.1.2仔魚期

從胚體出膜至第2背鰭棘和腹鰭棘絕對長度達到最長為仔魚期。

剛出膜的仔魚通體透明，尾部彎曲，無色素細胞。脊索細長、清晰可見，消化管細長，肛門未開口於體外。腹部下方有一橢圓形卵黃囊，較寬的一側起始於頭部1/2處，較窄的一側終止於肛門前方，油球位於卵黃囊下方靠近肛門處，背部、尾部及腹部下方有透明鰭膜（圖1-1）。

1日齡仔魚：頭部變大，體表出現色素點，肌節進一步加深。消化管變粗，末端垂直，整體呈“L”型。卵黃囊顯著縮小，油球變化微小，鰭褶變高，此時，仔魚均勻分佈於池中，懸浮於海水上層，偶爾遊動或進行旋轉運動（圖1-2）

2日齡仔魚：口裂出現，尚不能攝食，中腦隆起明顯，靠近尾部腹側、背部及體表出現色素塊，眼部開始出現色素點，肌節形狀呈“<”型，胸鰭芽出現。脊索加粗，直腸膨大，肛門尚未開口於體外，下方出現一個半圓形膀胱。卵黃囊進一步縮小，背、腹、尾部鰭膜連成一片，不運動時，頭朝下、尾朝上倒掛於海水中，偶爾進行間歇運動（圖1-3）。

3日齡仔魚：尾部、消化道前半部分散佈色素點，眼部色素點增多。消化道前端彎曲，管壁增厚，偶爾可見胃蠕動，但尚未開口攝食，仍以內源性營養為主。卵黃囊急劇縮小，運動能力明顯增强（圖1-4）。

4日齡仔魚：吻端突出，上位口，視囊色素點密集，呈黑色，魚體1/3及2/3處脊索下方分佈有長條狀黑色素，尾部脊索下方出現2~3條輻射狀黑色素。開口攝食，消化道進一步彎曲，管壁變粗，肛門開口於體外。卵黃囊幾乎消失，油球變小，此時，由內源性營養向外源性營養過渡。胸鰭變長，仔魚開始有集羣趨勢（圖1-5）。

雲龍石斑魚1日齡時體表開始出現色素點，3日齡口裂明顯，軀幹末端1/3處出現色素塊，4日齡仔魚開口攝食，肛門開口於體外，魚體1/3處脊索下方出現長條狀黑色素。褐龍石斑魚與雲龍石斑魚的卵黃囊均在第5天時完全消失。

5日齡仔魚：第2背鰭棘、腹鰭棘出現，腹腔靠近脊索一邊被黑色素包裹。鰓耙出現，可見胃部蠕動，腸開始分化。卵黃囊和油球徹底消失，轉變成外源性營養。仔魚開始有集羣行為，通常聚集於池邊或池角處（圖1-6）。

10日齡仔魚：第2背鰭棘、腹鰭棘顯著增長，腹鰭棘長度長於第2背鰭棘，末端均出現黑色素，尾鰭鰭條出現。腹腔幾乎被黑色素包圍，體表色素點增多（圖1-7）。

15日齡仔魚：第1背鰭棘長出。第2背鰭棘長於腹鰭棘，鰭棘上黑色素占鰭棘總長度的1/2，黃色素呈塊狀分佈，腹腔上黑色素减少，黃色素新增，尾鰭鰭條上黑色素點增多。可見心臟內血液流動，鰓蓋骨分化顯著，最後1枚尾椎骨上翹，尾鰭從外形看仍是對稱狀態（圖1-8）。

19日齡仔魚：第3背鰭棘長出，臀鰭長出2根鰭棘。黑色素和黃色素向頭部上方擴伸，腦顱骨加厚，透明度降低（圖1-9）。

23日齡仔魚：背鰭鰭條數增多，第2背鰭棘、腹鰭棘上倒鉤狀小刺數目新增，膀胱膨大呈橢圓形（圖1-10）。

27日齡仔魚：上枕骨位置星狀黑色素新增，腹鰭棘前半部分覆蓋黃色素，後半部分覆蓋黑色素，尾椎骨處出現黃色素。此時，大部分仔魚開始攝食配合飼料，配合投喂鹵蟲無節幼體（圖1-11）。

32日齡仔魚：背鰭棘數目新增，鰭棘末端黑色素開始消退。顱骨更加發達，眼眶上緣出現鋸齒狀突起，脊椎分節明顯，下方可見2條清晰血管（圖1-12）。

41日齡仔魚：第2背鰭棘長（9.74±0.42）mm，腹鰭棘長（7.79±0.39）mm，絕對長度均達到仔、稚、幼魚階段最大值。各鰭鰭條基本形成，大部分器官發育已定型（圖1-13）。

褐龍石斑魚與雲龍石斑魚第2背鰭棘、腹鰭棘絕對長度均在41日齡時達到最大，此後進入稚魚期。

2.1.3稚魚期

第2背鰭棘和腹鰭棘絕對長度開始縮減，身體出現鱗片為稚魚期。

46日齡稚魚：第2背鰭棘、腹鰭棘相對長度開始縮減，鰭棘上小刺數目同樣開始减少。背部可見白色點狀凸起，鱗片開始生長。側線、頭部後方、體中部、尾鰭基部前方出現帶狀黑色素，逐漸向全身擴展。此時，稚魚喜歡棲息在底部或有遮蔽物的陰暗處（圖1-14）。

51日齡稚魚：第2背鰭棘、腹鰭棘長度較之前大幅縮小，第2背鰭棘長度長於腹鰭棘。頭背部中間下凹。體表背側黑色素下方開始出現鱗片（圖1-15）。

褐龍石斑魚51日齡時進入幼魚期。雲龍石斑魚在56日齡時，腹鰭棘絕對長度縮減至最小，體表鱗片開始出現，進入幼魚期稍晚於褐龍石斑魚。

2.1.4幼魚期

第2背鰭棘和腹鰭棘絕對長度縮減至最小，進入幼魚期。

56日齡稚魚：第2背鰭棘、腹鰭棘收縮完成，鰭棘上小刺完全消失。背鰭基部黑色素迅速向身體兩側伸展，形成4條斑帶。全身被鱗，形態與幼魚基本一致（圖1-16）。

62日齡幼魚：幼魚體色加深，腹鰭棘長度長於第2背鰭棘，眼睛向外凸出。此時，幼魚喜歡棲息於底部，出現互相殘食現象（圖2-1）。

褐龍石斑魚體表出現4條褐色斑帶，第2條中部、第3條下部出現白色斑塊，雲龍石斑魚體表出現6條褐色斑帶（圖2-2），尚未出現與成魚相似的斑塊。

2.2褐龍石斑魚與雲龍石斑魚發育及生長名額對比 2.2.1卵黃囊的吸收

褐龍石斑魚初孵仔魚卵黃囊容積為（0.1948±0.0240）mm³，雲龍石斑魚卵黃囊容積為（0.1871±0.0130）mm³。1日齡開始，卵黃囊容積不斷縮小，至5日齡時，褐龍石斑魚與雲龍石斑魚的卵黃囊均完全消失（錶1）。

2.2.2全長和肛前距

褐龍石斑魚和雲龍石斑魚2個雜交後代仔、稚、幼魚全長生長情况見圖3。從圖3可以看出，褐龍石斑魚初孵仔魚全長為（1.71±0.01）mm，雲龍石斑魚初孵仔魚全長為（1.77±0.03）mm，發育至62 d時，褐龍石斑魚幼魚全長達到（34.20±2.40）mm，雲龍石斑魚全長達到（33.86±3.13）mm。仔魚期雲龍石斑魚生長稍快於褐龍石斑魚，36 d時，褐龍石斑魚日平均全長開始大於雲龍石斑魚。2組的日增長率無明顯規律，褐龍石斑魚和雲龍石斑魚日增長率最高值均出現在1 d，分別為27.89%和30.03%；其次，12 d時，雲龍石斑魚日增長率達到次高（25.64%），13 d時，褐龍石斑魚日增長率達到次高（26.73%）（錶2）。對褐龍石斑魚全長生長曲線進行多項式回歸分析，平均全長（L）與日齡（x）的關係式為L=2.6208e^0.0465x，相關係數R²=0.9603，平均全長與日齡顯著相關。雲龍石斑魚平均全長（L）與日齡（x）的關係式為L= 2.7158e^0.0453x，相關係數R²=0.9451。

褐龍石斑魚與雲龍石斑魚肛前距變化趨勢相似，總體呈上升趨勢（圖3）。褐龍石斑魚初始肛前距為（1.15±0.04）mm，雲龍石斑魚稍短於褐龍石斑魚，肛前距為（1.13±0.01）mm。褐龍石斑魚肛前距日增長率波動範圍為0.43%~25.21%，13 d日增長率達到仔、稚、幼魚階段最高（25.21%），雲龍石斑魚日增長率波動範圍為0.36%~27.01%，12 d日增長率最高，二者與全長日增長率最高值出現時間相同（錶2）。肛前距/全長在發育過程中無明顯變化規律（圖4）。對褐龍石斑魚肛前距的生長曲線進行多項式回歸分析，肛前距（P）與日齡（x）的方程式為P=1.3371e^0.0483x，相關係數R²=0.9643，肛前距與日齡顯著相關。雲龍石斑魚肛前距（P）與日齡（x）的方程式為P=1.4017e^0.0467x，相關係數R²=0.944。

2.2.3第2背鰭棘和腹鰭棘

第2背鰭棘和腹鰭棘的伸長與縮回是雜交子一代最明顯的特徵，也是石斑魚仔、稚、幼魚生長過程中所特有的。褐龍石斑魚與雲龍石斑魚的第2背鰭棘和腹鰭棘絕對長度生長趨勢相似，均呈先新增後縮短的趨勢（圖5）。41 d時，褐龍石斑魚第2背鰭棘絕對長度達到最大，為（9.74±0.42）mm，隨後開始縮回變短；腹鰭棘絕對長度同樣在41 d時達到最長，為（7.79±0.39）mm，可達全長的1/2；至51 d時，縮短至（4.21±0.29）mm，此時，外形特徵與成魚相似，第2背鰭棘和腹鰭棘開始正常生長，即將進入幼魚期。雲龍石斑魚第2背鰭棘絕對長度在41 d時達到仔、稚魚期最長，為（9.59±0.46）mm；此時腹鰭棘絕對長度達到最大，為（5.81±0.09）mm，進入幼魚期恢復正常生長。褐龍石斑魚和雲龍石斑魚的第2背鰭棘、腹鰭棘相對長度總體呈先上升後下降趨勢（圖6）。褐龍石斑魚在23 d時，其第2背鰭棘和腹鰭棘相對長度均達到最大，分別為56.70%和42.06%。雲龍石斑魚第2背鰭棘和腹鰭棘相對長度在19 d時，分別達到最大59.29%和43.24%。

3討論 3.1石斑魚遠緣雜交

早年石斑魚市場主要依賴於野生捕撈，但近年來隨著石斑魚養殖業的不斷發展，育苗技術也日益成熟。現時，養殖品種主要有雲紋石斑魚、鞍帶石斑魚、棕點石斑魚（E. fuscoguttatus）、赤點石斑魚（E. akaara）、七帶石斑魚（E. septemfasciatus）、駝背鱸（C. altivelis）等。但在養殖過程中發現，石斑魚純種魚苗病害多、畸形率高、活率低、生長週期長。為促進石斑魚種質改良，獲得生長速度快、抗病害能力强、肉質好的石斑魚優質新品種，雜交育種科技在石斑魚養殖新品種培育中發揮了重要的作用（李炎璐等，2012）。現時，國內外已報導的石斑魚雜交組合有雲紋石斑魚（♀）×鞍帶石斑魚（♂）（田永勝等，2017）、斜帶石斑魚（E. coioides）（♀）×赤點石斑魚（♂）（劉付永忠等，2007）、棕點石斑魚（♀）×鞍帶石斑魚（♂）（陳超等，2014）、雲紋石斑魚（♀）×七帶石斑魚（♂）（李炎璐等，2012）、地中海石斑魚（E. costae）（♀）×東大西洋石斑魚（E. marginatus）（♂）（Glamuzinaet al，2001）、棕點石斑魚（♀）×藍身大斑石斑魚（E. tukula）（♂）（田永勝等，2019）、鞍帶石斑魚（♀）×藍身大斑石斑魚（E.tukula）（♂）（成美玲等，2019）、等。其中，大多數雜交後代由於成活率低、畸形率高或無明顯生長優勢，無法在生產中大量應用，現時，虎龍雜交斑（張海發等，2014）和雲龍石斑魚（田永勝等，2017）2種雜交石斑魚得到廣泛推廣。

染色體數量及核型是進行魚類雜交育種的遺傳學基礎，褐石斑魚染色體核型為2n=48、2m+4sm+42t（NF=54）（郭明蘭，2009），雲紋石斑魚的染色體核型為2n=48、2st+46t（NF=50）（郭豐等，2006），鞍帶石斑魚的核型為2n=48、2sm+6st+40t（NF=50）（舒琥等，2012），褐石斑魚與鞍帶石斑魚的核型更相近，3種魚染色體核型雖有差异，但染色體數量相同，3種魚的染色體數量相同，具備雜交的細胞學基礎。褐石斑魚卵與鞍帶石斑魚精子可正常受精且受精卵發育正常，孵化後仔、稚、幼魚正常生長，表明褐石斑魚（♀）×鞍帶石斑魚（♂）雜交是可行的。褐石斑魚、雲紋石斑魚與鞍帶石斑魚線粒體基因組序列長度分別為16686、16696和16714 bp，均編碼37個基因（黃小林等，2013）。黃小林等（2013）構建了基於6種石斑魚線粒體基因組全序列、13種蛋白質編碼基因合併序列的分子系統樹，表明褐石斑魚與雲紋石斑魚親緣關係較近，與鞍帶石斑魚親緣關係相對較遠，但二者中雲紋石斑魚與鞍帶石斑魚的親緣關係較褐龍石斑魚近（黃小林等，2013；Ohet al，2012）。這可能是導致褐龍石斑魚畸形率高於雲龍石斑魚的遺傳因素。

3.2變態發育

第2背鰭棘和腹鰭棘的伸長與收回是石斑魚變態過程中最顯著的特徵。第2背鰭棘和腹鰭棘的變化與石斑魚的生活習性轉變有密切的聯系。呂雪嬌等（2018）利用骨骼染色科技和顯微量測的方法對鞍帶石斑魚仔、稚、幼魚的骨骼發育及生長特性進行連續觀察和量測，表明骨骼發育過程中與攝食、呼吸及游泳功能相關的骨骼優先發育，如顱骨（頜骨、鰓）和鰭元件，且骨化順序與發育順序基本一致。鮃鰈魚類擁有極不對稱的體型，在變態發育過程中，一隻眼睛遷移到顱骨的對側，這種遷移伴隨著廣泛的顱面轉變和身體色素沉著不對稱現象同時發展（Shaoet al，2016）。Miwa等（1987）研究表明，牙鮃仔魚的變態與T4（Thyroxine，甲狀腺激素）濃度有關。Shao等（2016）通過對變態發育不同時期褐牙鮃進行比較基因組學和轉錄組學分析表明，褐牙鮃眼睛的移動受到甲狀腺激素和視黃酸訊號通路的拮抗調控。唐嘯塵等（2006）用T4處理斜帶石斑魚仔魚，表明T4能够促進仔魚變態；Jesus等（1998）利用不同濃度的T4對點帶石斑魚仔魚進行處理，表明T4能够促進點帶石斑魚色素出現及第2背鰭棘收縮，但存在劑量依賴，高濃度T4會導致仔魚存活率下降；Buchholz（2017）研究認為，甲狀腺激素受體在脊椎動物變態過程中起到了重要作用。囙此，內分泌干擾因素對石斑魚等脊椎動物變態發育格外重要（Opitzet al，2010），現時，對於調控第2背鰭棘和腹鰭棘伸長與收回的生物學機制的相關研究還未見報導，通過全基因組和網絡分析方法及錶觀遺傳現象研究，會更好地闡述石斑魚變態的遺傳機制（Sachset al，2017）。

3.3石斑魚體色變化

體色是石斑魚仔、稚、幼魚生長階段最明顯的變化之一，研究過程中發現，雜交子一代離開水體後出現應激反應，即體色變暗、花紋消失。硬骨魚類生理學體色變化主要是由內分泌和交感神經系統調控的皮膚色素細胞聚集或發散引起的，而軟骨魚類體色變化主要由激素調節控制（Fujii，2000；Fujiiet al，1986）。現時，在神經調節方面研究較多的是腎上腺素和乙醯膽鹼對色素細胞的作用。腎上腺素能够引起色素顆粒的聚集，而乙醯膽鹼作用正好相反（李歡等，2014）。遺傳因素和環境因素相互作用，對魚類體色產生了一定的影響。黑素皮質激素受體（Mc1r，melanocortin-1 receptor）基因在魚類皮膚中高度表達，其啟動可刺激黑色素的產生和魚類黑色素團的分散，Mc1r的功能調控被認為是脊椎動物色素錶型的關鍵機制（Grosset al，2009；Calet al，2017）。Greenwood等（2011）研究發現，三刺魚（Gasterosteus aculeatus）幼魚在不同水域（淡水和海水）中所呈現的色素帶不同，淡水中的幼魚出現豎狀條紋，通過對2個水域的三刺魚雜交F₂代幼體進行QTL定位，闡明了該色素沉積模式下潜在的遺傳架構差异，表明LG1和LG6兩個QTL與條帶變化顯著相關。石斑魚幼魚體色的變化機制還需進一步研究。