中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）是中國近海特有種，主要分佈在黃海、渤海海區的山東、河北、遼寧、天津及江蘇近海和朝鮮半島西海岸（王清印，2014）。其適應能力强、生長快、耐低溫、品質好、營養價值高，是我國重要的海水養殖經濟物種之一。20世紀80年代，中國明對蝦養殖技術得到突破，中國明對蝦的養殖產量迅速新增，1991年總產量達20萬t，成為當時我國最重要的對蝦養殖品種（李健等，2015）。1993年開始暴發的白斑併發症病毒（White spot syndrome virus，WSSV）對中國明對蝦產業造成了沉重的打擊。隨之而來的養殖環境惡化，種質資源衰退等問題，均嚴重影響了整個養殖業的發展。為了保護中國明對蝦的種質資源，開展優良群體的選育工作，培育高產、抗逆的中國明對蝦新品種已成為必然。

利用傳統數量遺傳學方法在對蝦選擇育種中進行遺傳參數評估和遺傳解析已經取得了很大的進展（欒生等，2013；何玉英等，2011）。隨著現代生物技術的發展，相繼湧現出RFLP、AFLP、SSR和SNP等多種分子標記技術，這些分子標記技術為群體的遺傳結構評估提供新的途徑。SNP標記作為遺傳學研究中最為流行的分子標記，與傳統分子標記相比，具有在基因組中分佈廣泛、密度高、穩定遺傳等優勢，是現時水產動物高密度遺傳圖譜構建、群體遺傳學研究和種質資源保護利用等領域的理想標記（徐安畢等，2007；Liet al，2003；黃映萍，2010；劉安然等，2019）。然而，水產物種的基因組研究背景相對滯後，基因組的雜合度和高複雜性也限制了高通量測序的應用。近年來，簡化基因組測序的發展為水產物種提供了新的手段。2b-RAD（Wanget al，2012）科技是近年來在非模式生物中進行SNP開發最為有效、經濟的簡化基因組測序方法之一。該科技由於具有酶切DNA片段大小一致、文庫構建簡單快速、標籤密度易於調節、成本低廉、準確性高等優點得到廣泛的應用。

本研究的實驗對象中國明對蝦“黃海2號”是採用群體、家系與多性狀複合育種科技，經連續選育13代獲得的新品種。該品種生長速度快、具有明顯的抗病性（李旭鵬等，2018）。根據多性狀複合育種科技製定的配種方案，該群體獲得了可觀的遺傳進展（Suiet al，2018）。但累代人工選育是否會降低該選育群體的遺傳多樣性、影響中國明對蝦的選育效果，尚缺少實際檢測數據的支撐。現時，雖然已有學者通過RAPD分析（石拓等，2001）、線粒體DNA序列分析（張輝等，2010）、AFLP分析（安麗等，2008）和SSR分析（張天時等，2005）對中國明對蝦養殖群體進行了遺傳多樣性研究，吳瑩瑩等（2013）利用非探針HRM開發的39個SNP，分析了中國明對蝦群體的遺傳多樣性。但這些研究的標記數目較低，且尚缺少中國明對蝦人工選育群體的分析報導。本研究利用2b-RAD簡化基因組科技，對中國明對蝦“黃海2號”G₉~G₁₁3個連續選育世代的親本群體進行高通量SNP開發，並基於這些標記分析了遺傳多樣性參數、群體間遺傳分化和遺傳距離，從分子水准揭示不同世代的群體遺傳結構，瞭解人工選育方案對其遺傳結構和遺傳多樣性的影響，從而為選育工作提供可靠的理論基礎，確保選育工作順利進行。

1資料與方法 1.1實驗資料

實驗所用中國明對蝦“黃海2號”取自中國水產科學研究院黃海水產研究所水產遺傳育種中心。2015~ 2017年（G₉~G₁₁）該育種群體按照多性狀複合育種的配種方案進行家系構建、選育。選取在傳代過程中用於構建覈心家系的親本，置於–80℃超低溫冰櫃內保存備用。該親本群體包括2015年137尾、2016年244尾和2017年268尾，共計649尾。

1.2實驗方法 1.2.1 DNA選取和檢測

採用TIANamp Marine Animals DNA Kit（天根生化科技有限公司，北京）選取中國明對蝦肌肉組織基因組DNA，通過瓊脂糖檢測和NanoDrop 2000紫外分光光度計（Thermo Fisher Scientific）對抽提的DNA質量和濃度進行檢測。DNA產物置於–20℃保存備用。

1.2.2 2b-RAD文庫構建和測序品質分析

利用2b-RAD標籤串聯科技進行文庫構建，文庫的構建過程參攷Wang等（2012）。選用的IIB型限制性內切酶為BsaXI，為了得到盡可能多的標記，所有樣品均採用標準型5′-NNN-3′接頭建庫。文庫質控合格後在Illumina Hiseq X Ten平臺進行Paired-end測序（由青島歐易生物科技有限公司完成）。原始數據下機後，按照以下條件進行過濾：剔除不含有BsaXI酶切識別位點的序列；剔除低質量序列（即大於10個堿基的品質分數小於20的序列）；剔除有10個以上連續相同堿基的序列。由此獲得可用於後續標記篩查、分型的高品質序列。

1.2.3全基因組SNP篩查和分型

由於中國明對蝦尚未有發表的全基因組序列作為參攷，本研究借用課題組前期構建的中國明對蝦高密度遺傳連鎖圖譜數據（標記密度為0.41 cM，尚未發表），利用該作圖群體2個親本構建的已有Reference（命名為Family- Reference，該參攷標籤庫可靠性已在圖譜構建中得到驗證）進行後續的標記篩查、分型。該Reference是在覈心群體中選取2個性狀差异大的雌雄代表性個體進行測序標籤（Tag）聚類，構建的RAD分型參攷標籤庫。全基因組標記分型參照RAD-typing分型策略（Fuet al，2013）。分型過程是將本研究所有測序個體（作圖群體的2個親本）的高品質reads，利用SOAP軟件（Liet al，2009）（參數設置為：–M4–v2–r0）比對到該Reference上，篩查標記位點及分型資訊。對於共顯性的SNP標記，利用最大似然法ML得到每個個體在每個位點的基因型。為了保證SNP位點分型的準確性和嚴謹性，進行以下條件的過濾：在個體內標籤深度500以上的不進行分型。只留取標籤內最多有3個SNP的標籤位點；標記在80%的個體中可以分型；最小等位基因頻率MAF≥0.01。

1.3資料統計與分析

利用Genepop軟件（Version 1.0.5）（Roussetet al，2008）對SNP位點的分型結果進行處理，計算其有效等位基因數（N_e）、期望雜合度（H_e）、觀測雜合度（H_o）、多型資訊含量（PIC）、最小等位基因頻率（MAF）和等位基因頻率等遺傳參數，並計算世代間的遺傳分化係數（F_st）、近交係數（F_is）、群體間的遺傳距離（DR）和基因流（N_m）。利用vcftools軟件（Version 0.1.14）（Daneceket al，2011）計算核苷酸多樣性（P_i）和轉換/顛換（T_s/T_v）的比值。使用Admixture軟件（Version 1.3.0）（Alexanderet al，2009）分析中國明對蝦的群體結構。

2結果 2.1基因組DNA的選取及文庫的構建

選取的基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖1為部分基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，選取的基因組DNA無明顯拖帶現象，完整性較好。用NanoDrop 2000紫外分光光度計檢測顯示，OD_{260 nm}/OD_{280 nm}在1.8~2.0之間，表明選取的基因組DNA質量較高，可用於後續的建庫和測序。

DNA質檢合格後，為了保證每個文庫的質量，對構建的每個文庫進行聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，可直觀的顯示文庫構建是否成功。圖2為聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測文庫質量。

2.2 2b-RAD測序及SNP分型結果

本研究基於2b-RAD測序科技構建中國明對蝦649個樣品的標籤測序文庫，測序獲得1217161378條原始Reads，平均每個樣本測序Reads數為28938658。品質控制後，平均每個樣本中獲得含BsaXI酶切位點的高品質Reads占測序原始Reads的74.86%。引用的高品質參攷（Reference）共包含286345條共顯性標籤序列。在對相同的Reads聚類得到特异性標籤後，平均每個樣本獲得特异性標籤數目為343262，樣本的平均測序深度為43.08×。3個選育世代獲得66985個高品質的SNP位點，用於後續群體遺傳分析。

2.3中國明對蝦SNP突變類型分析

統計SNP分型結果中各位點的突變類型特點。如圖2所示，C/T轉換類型最多，占所有堿基突變類型的39%，A/G轉換類型占14%。G/C顛換類型最少，占所有堿基突變類型的6%，A/C與A/T顛換類型均占14%，G/T顛換類型占8%。轉換與顛換（T_s/T_v）之比為1.402。

2.4不同世代的SNP遺傳多樣性分析

由於本次分型只統計了二等位基因型，囙此，每個SNP位點觀測等位基因數目（N_a）均為2。位點的平均分型率為92.47%。結果顯示（錶1），G₉~G₁₁世代有效等位基因（N_e）平均分別為1.2069、1.2324和1.2475；平均期望雜合度（H_e）分別為0.1434、0.1584和0.1671；測得平均觀測雜合度（H_o）分別為0.1388、0.1515和0.1609；核苷酸多樣性（P_i）分別為0.1439、0.1587和0.1674。G₉~G₁₁選育世代多型資訊含量（PIC）的平均值分別為0.1241、0.1360和0.1430；最小等位基因頻率（MAF）分別為0.1074、0.1038和0.1146。近交係數分別為0.1141、0.0701和0.0532。

2.5世代間等位基因頻率變化

G₉~G₁₁所有位點的平均等位基因頻率分別為86.92%、86.31%和85.87%。3個世代選育群體野生型等位基因頻率整體呈現一定的下滑趨勢，但差异並不顯著。從每個位點統計3代等位基因的變化規律，其中，逐代下降的SNP數量為20348，占30.38%；逐代上升的SNP數量為8558，占12.78%（錶2），逐代下降的比特點數是逐代上升位點的2.4倍。從逐代下降的位點中，篩選出50個變化程度高的位點，變化程度在24.43%~29.76%之間，平均值為27.56%，從逐代上升的位點中，篩選了50個變化程度高的位點，變化程度在27.16%~30.45%之間，平均值為28.79%，二者之間也無顯著性差异（P=0.552），圖3和圖4表示選取的50個具有代表性的等位基因頻率變化情况。

2.6世代間遺傳變異及分化

群體間總的遺傳分化係數為0.0061。隨著選育世代的新增，遺傳分化係數在相鄰世代之間相繼减小，G₉與G₁₀間F_st值為0.0029，G₁₀與G₁₁間F_st值為0.0026，兩兩比較所得F_st值均小於0.05，3個選育世代群體間遺傳分化較弱。從圖6可看出，3個亞群的波形一致性很高，這再次說明3個選育世代遺傳分化很弱，遺傳結構基本穩定。選育世代間的遺傳距離（DR）範圍為0.0026~0.0040，G₉與G₁₀間的遺傳距離為0.0029，G₁₀與G₁₁間的遺傳距離為0.0026，相鄰世代的遺傳距離也逐步减小。G₉與G₁₀間的基因流（N_m）為86.83，G₁₀與G₁₁間的基因流（N_m）為94.63。

3討論 3.1高通量測序及SNP突變類型分析

由於中國明對蝦沒有已發表的參攷基因組序列，依據RAD-typing的分型策略（Fuet al，2013），需要從測序數據中選取含有酶切識別位點的Reads，使用ustacks（version 1.34）軟件進行聚類，從頭構建一個供分型使用的參攷標籤庫（Reference）。本研究在選擇參攷標籤庫的過程中，比較了使用2種參攷序列（Reference）對開發SNP標記的影響，即分別利用中國明對蝦高密度連鎖圖譜作圖群體2個親本構建的family-Reference以及從選育群體中隨機選取4個測序良好的個體構建的progeny-Reference，使用相同的分型標準對3代選育群體進行分型。對於2種Reference分型得到的標記進行比對，在允許2個錯配的條件下，共比對到60176個標記，即標記共有率為92.45%，2種Reference的基因組覆蓋度和代表性均良好。分型後，分別得到66304和66985個SNP，2次分型得到的標記數均無顯著差异。考慮到遺傳圖譜的前期工作基礎，最終確定了family-Reference作為參攷序列（待發表數據）。經過2b-RAD測序後，每個樣本得到的原始Reads從29119715~89664272不等。質量過濾後，平均每個樣本中獲得含有BsaXI酶切位點的高品質Reads占測序原始Reads的74.86%，平均每個個體的測序深度為43.08×。說明了本次構建的文庫質量較高，測序深度達到了高準確度下的分型標準（Jiaoet al，2014）。

本研究中選取的每個世代的測序樣本數都不一致（G₉選取137尾、G₁₀選取244尾、G₁₁選取268尾），是由於當年需要構建的家系數目不同。理論上，不同的樣本數會造成統計上嚴謹度的不同，另外，個體數量少的G₉世代，也有137個樣本提供分型，囙此認為，雖然樣品數量不同但並不會對實驗結果造成影響。不同世代樣本數不同，在遺傳多樣性分析中也有報導，如Zhang等（2018）曾經利用類似的方法對3個世代連續選擇的櫛孔扇貝（Chlamys farreri）進行分析，從G₁世代抽取76只，G₂世代抽取107只，G₃世代356只，2b-RAD分型得到的18450個標記進行群體遺傳學分析，也發現樣本量不同對結果幾乎無影響。

SNP堿基替換類型分為轉換（T_s）與顛換（T_v）兩類，轉換發生在A與G或C與T之間，顛換有4種，發生在A與C、A與T、G與C和G與T之間。理論上發生轉換的概率與發生顛換概率（T_s/T_v）比值為0.5，但實際上T_s/T_v值往往大於0.5，這種差异性被稱為“轉換性偏差”（Gojoboriet al，1982；Liet al，1984；Collinset al，1994）。本研究驗證的SNP多態性類型存在明顯的轉換型偏差現象，T_s/T_v=1.402 > 0.5。不同物種間轉換/顛換比值存在很大的差距。馬氏珠母貝（Pinctada fucata）血細胞轉錄組中，轉換與顛換的比值為0.5，與理論比率相符（王忠良等，2018）。凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）轉錄組中，轉換和顛換的比率為2.0（於洋，2014），而鮑中堿基的轉換大大多於堿基的顛換，轉換與顛換比為2.33（王鷺驍等，2006）。產生這種差异的原因可能與不同物種在進化中承受的選擇壓力有關（Zhaoet al，2002）。

3.2群體遺傳多樣性

人工定向選育是一個複雜的過程，累代的人工選擇壓力及選擇環境勢必會造成群體遺傳水准的波動，而遺傳多樣性是生物多樣性的基礎，對物種的生存、繁衍和進化至關重要（張榮良等，2016）。人工選擇育種的目的是在保持選育群體具有一定遺傳多樣性的基礎上，篩選獲得具有目標性狀的選育新品種或新品系（張榮良等，2016）。囙此，在水產良種培育過程中維持群體的遺傳多樣性，是種質資源利用的前提條件。本研究中的3個選育世代SNP標記從整體水準上，野生型的平均等位基因頻率呈現一定的下降趨勢，但並不顯著，分別為86.92%、86.31%和85.87%。在人工選育的背景下，本研究顯示群體遺傳多樣性沒有明顯變化，推測原因為人工選擇只定向改變少數位點的基因頻率。本研究進一步從每個SNP位點角度統計等位基因變化規律，並從其中選取50個變化程度大的連續下降和連續上升的位點（圖4和圖5），二者等位基因頻率變化程度分別為27.56%和28.79%，無顯著性差异（P=0.552）。這些位點的變化是否與性狀存在遺傳上的相關性還需進一步驗證。

多型資訊含量（PIC）和雜合度是2個較好的衡量基因多態性的名額。當PIC < 0.25時，為低度多型位點；0.25 < PIC < 0.5時，為中度多態性位點；PIC > 0.5時，表示該位點為高度多態性位點（Botsteinet al，1980）。從本研究統計結果來看，3個連續世代的PIC值逐漸升高，PIC分別為0.1241、0.1360和0.1430（錶1），與吳瑩瑩等（2013）利用非探針HRM法對中國明對蝦39個EST-SNP位點進行了遺傳多態性分析，PIC為0.0476~0.375，平均值為0.272的結果相似。但均比Botstein等（1980）提出的衡量群體基因變異程度低等的標準值低很多。3代選育群體的平均雜合度（H_o）逐漸上升，分別為0.1388、0.1515和0.1609（錶1），比利用微衛星標記進行研究所報導的數值低（劉萍等，2004；張天時等，2005），產生這樣的結果應該是所用分子標記的不同造成的。由於SNP是二等位基因分子標記，多型資訊含量比SSR低，但大量位點的應用能够彌補多樣性的不足。隨著選育世代的進行，3個人工選育群體的多型資訊含量和雜合度逐漸增大，該結果與趙廣泰等（2010）利用微衛星分析大黃魚（Larimichthys crocea）連續4代選育群體遺傳多樣性與遺傳結構時，發現的F₁~F₄代13個微衛星位點的PIC從0.638下降到0.524，H_o從0.779下降到0.532的結果不同，也與馬冬梅等（2018）分析華南鯉（Cyprinus carpio rubrofuscus）4個連續選育世代（F₁、F₂、F₃和F₄）的遺傳多樣性和遺傳結構，PIC從0.6577下降到0.5834，H_o從0.7943下降到0.7135的結果有差別。

本研究發現，3個世代親本的遺傳參數有上升的趨勢（但不顯著）。分析原因可能是與本研究所選取實驗樣品有關。本研究所用的樣品並不是在選育群體中隨機抽選的個體，而是用於構建G₉~G₁₁代覈心家系的親本作為樣品，即這些個體是依據育種方案挑選出的性狀優良個體，代表的是下一代群體的遺傳多樣性。選育世代親本遺傳多樣性高低，是下一代遺傳多樣性維持的重要基礎，而本研究親本的遺傳多樣性沒有下降，進一步說明我們的育種方案是科學的，在保證遺傳進展的同時，遺傳多樣性不會降低。

3.3世代間的遺傳變化

種群的遺傳分化指數（F_st）是衡量群體間遺傳分化程度的重要參數，根據Wright（1978）對遺傳分化指數的界定，F_st值介於0~0.05之間，表示群體遺傳分化較弱。在本研究中，群體總遺傳分化指數為0.0061以及世代間F_st值均小於0.05（錶2），說明3年選育世代遺傳分化程度較弱，群體間的遺傳結構差异不顯著。隨著選育世代的新增，相鄰世代間遺傳距離呈减小趨勢，說明隨著選育時間的推進，選育群體的遺傳背景趨於一致，遺傳結構趨向穩定，也體現了人工定向選擇的效應。基因流强弱對種群遺傳分化也具有重要影響，基因流N_m< 1，表明由於遺傳漂變發生了分化；N_m> 1，表明遺傳分化較小；N_m> 4，表明群體間的基因交流更充分，遺傳分化更小。3個選育世代親本的基因流值為62.91~94.63，3個選育世代間基因交流非常充分，群體間的遺傳分化很小。由於中國明對蝦是一年生物種，遺傳變異程度低，對固定性狀的人工選擇並沒有在整個基因組上產生明顯的影響，囙此遺傳分化程度低。

本研究採用2b-RAD科技對連續選育的中國明對蝦“黃海2號”G₉~G₁₁3個世代共計649個親本進行了簡化基因組測序，共獲得66985個SNP用於群體遺傳多樣性和遺傳結構變化的評估，研究表明，隨著人工定向選育工作的推進，對中國明對蝦選育群體遺傳多樣性和遺傳結構產生了一定的影響，但中國明對蝦選育群體遺傳分化相當小，遺傳結構趨向穩定，親本的遺傳多樣性並無降低的趨勢。研究結果為下一步製定中國明對蝦選育計畫提供基礎數據和參攷。