沙雷氏蛋白酶是鋅金屬蛋白酶的亞家族蛋白酶，分子量約為50 kDa，活性中心由鋅離子構成，具有降解蛋白的活性（Basuet al，2008；Hooper，1994）。沙雷氏蛋白酶抑制劑穩定性較强，熱處理後大多可恢復抑制活性，分子量約為10 kDa（Arumugamet al，2008）。蛋白酶的酶活可被金屬離子及化學抑制劑等所影響（陳怡炫等，2018），但本研究描述的抑制劑是特指專一性抑制沙雷氏蛋白酶的小分子蛋白質抑制劑，在體外可抑制沙雷氏蛋白酶。專一性沙雷氏蛋白酶抑制劑是在對產沙雷氏蛋白酶的微生物進行基因組分析時發現的，一般在沙雷氏蛋白酶的序列前後會有一段可編碼小分子蛋白質的基因序列，編碼的小分子蛋白質即為沙雷氏蛋白酶抑制劑（Riveraet al，2010）。

沙雷氏蛋白酶在細菌生理學中的功能被認為是水解周圍環境中的蛋白質底物，為細菌細胞提供簡單的營養（Maedaet al，1995；郝貴傑等，2010）。沙雷氏蛋白酶可不同程度地加重炎症、軟組織感染、敗血症等人類疾病，甚至會進一步引起菌血症和各種全身感染，特別是對免疫低下的癌症和愛滋病患者尤為嚴重（Feltzeret al，2000，Kidaet al，2008）。

根據沙雷氏蛋白酶在細菌病原體導致的病症中的關鍵作用，或可將其作為新的抗毒性靶向對象，通過抑制沙雷氏蛋白酶活性而達到抑制細菌的效果，相比於抗生素，可在减弱毒性的同時，不直接作用於細菌細胞，潜在地防止抗性菌株的出現（Carsonet al，2012）。研究沙雷氏蛋白酶抑制劑的抑制原理可進一步研發沙雷氏蛋白酶抑制劑衍生藥物，預防及治療沙雷氏蛋白酶造成的細胞感染等相關疾病。雖然蛋白酶抑制劑具有良好的發展潜力，但現時對其研究較為空白，只有少數報導描述了沙雷氏蛋白酶抑制劑的特徵，對沙雷氏蛋白酶及其抑制劑的複合物晶體研究則僅有2種，分別為APR-APRin（Hegeet al，2001）和SMP-Inh（Baumannet al，1995）。

沙雷氏蛋白酶MP來源於菌株Flavobacteriumsp. YS-80-122，通過懸滴法已經得到了MP晶體（PDB ID 3U1R），對其X-射線繞射及解析，確定晶體的空間群為P21 21 21，參數為a=45.91Å、b=75.2Å、c=115.42Å、α=β=γ=90°，精修至R_work為0.16、R_free為0.21（Zhanget al，2011）。和以往的沙雷氏蛋白酶類似，蛋白酶MP的基因下游有一個抑制劑基因LupI（GenBank No. JN689327.1），編碼的沙雷氏蛋白酶抑制劑LupI耐熱性好，與同源抑制劑APRin的同源性為55%，對靶蛋白酶MP的抑制常數為0.64μmol/L（Lianget al，2017）。本研究通過對沙雷氏蛋白酶與抑制劑複合物MP-LupI純化，結晶初篩，以期獲得完整的晶體供X-射線繞射分析，為瞭解複合物MP-LupI的晶體結構及明確抑制作用中的關鍵位點奠定基礎。

1資料與方法 1.1蛋白酶MP的原核表達

根據基於蛋白酶MP的基因序列（GenBank: GU084389.1）及pET22b（+）載體設計引子，上游引子（F1）為5'-CAGCATATGATGTCGAAACTTAAAGAG-AAAGCAGCGCT-3+'（劃線部分為NdeⅠ位點），下游引子（R1）為5'-ATGCTCGAGCGCGACGATGTCGTAAGTT-3'（劃線部分為XhoⅠ位點）。以全基因組DNA作為範本，通過兩端引子對MP基因進行PCR擴增。用酶切後的pET22b（+）載體和MP基因構建pET22b- MP原核表達質粒。採用添加氨苄青黴素的LB培養基選擇平板挑選陽性重組質粒，轉化至大腸桿菌BL21擴大培養，菌液用原始引子F1和R1進行PCR擴增並測序驗證。

將轉化成功的菌體轉接至2個三角瓶，於37℃、200 r/min條件擴大培養。當培養至菌液OD_{600 nm}為0.6時，一瓶加入0.4 mmol/L的誘導劑IPTG作為實驗組；另一瓶不加誘導劑作為對照組。2瓶菌液均繼續培養6 h，離心收集菌體。按菌液總量的0.1倍加入50 mmol/L的Tris-HCl（pH=8）緩衝液，混合均勻，破碎菌體，分別取上清液進行酶活檢測和電泳檢測。

1.2蛋白酶MP的純化

將大腸桿菌BL21 pET22b-MP基因工程菌接種到50 ml LB培養基中製備種子液，加入20μl 100 mg/ml氨苄青黴素，於37℃、200 r/min培養12 h。將種子液按2%接種量添加到4 L LB培養基中，加入200μl 100 mg/ml氨苄青黴素，於37℃、200 r/min培養。當菌液OD_{600 nm}達到0.6時，加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L誘導表達靶基因。在16℃和200 r/min下再培養6 h即可完成誘導表達。

在4℃以8000 r/min離心20 min沉澱菌體細胞，然後重懸於400 ml（菌液總量的0.1倍）Tris-HCl緩衝液（50 mmol/L，pH=8.0）進行超聲破碎。破碎條件為：200 W，10 s工作，10 s休息，交替共破碎40 min。以8000 r/min離心去除沉澱後，用10 kDa超濾杯濃縮至約50 ml。

選用親和HisTrap HP色譜柱純化MP酶液。上樣緩衝液為50 mmol/L pH=8的Tris-HCl、500 mmol/L NaCl和20 mmol/L咪唑混合液；洗脫緩衝液為50 mmol/L pH=8的Tris-HCl、500 mmol/L NaCl和500 mmol/L咪唑混合液。收集的MP酶液用10 kDa的超濾離心管濃縮並除鹽，測蛋白酶活性、濃度並進行SDS-PAGE電泳。

1.3抑制劑LupI的誘導表達及純化

LupI基因（GenBank: JN689327.1）被構建在pET28a（+）載體上，含有該目的基因的質粒被轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中進行誘導表達（王昆等，2017）。將大腸桿菌BL21 pET28a-lupI基因工程菌接種到50 ml LB培養基中，加入20μl 100 mg/ml卡那黴素，其餘誘導表達和破碎過程與MP類似，不做贅述。

參攷王昆（2017）的方法，選用HiLoad^TM26/600 Superdex 200 prep grade凝膠柱和HiPrep^TMQ-FF 16/10柱純化LupI粗蛋白液。尺寸排阻色譜的緩衝液僅1種，本實驗採用50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0。根據峰型分管收集流出的溶液，先流出的溶液為分子量大的樣品。離子交換色譜的上樣緩衝液（A液）為50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0；洗脫緩衝液（B液）為50 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，pH=8.0。梯度洗脫設定為30 min從0到100% B液，收集洗脫峰，用3 kDa的超濾離心管濃縮並除鹽，測蛋白酶抑制活性、濃度並進行SDS-PAGE電泳。

1.4複合物MP-LupI的製備及純化

按照等摩爾混合計算方法，將上述已純化的MP和LupI按1:1的比例混合。LupI適當過量，充分震盪保證充分結合。將此溶液用0.45μm的濾頭過濾，即得到複合物和過量抑制劑摻雜的混合液樣品。

選擇HiLoad^TM26/600 Superdex 200 prep grade凝膠柱，將混合物用尺寸排阻色譜法分離。複合物的分子量約為60 kDa，抑制劑的分子量為11.5 kDa，利用二者分子量大小的差异進行分離。尺寸排阻色譜的方法和上樣緩衝液與純化LupI時一致。將收集的樣品用10 kDa的超濾離心管濃縮，測濃度，電泳檢測確定條帶是否正確。進一步濃縮至20~40 mg/ml的高純度高濃度蛋白溶液，用於後續結晶實驗。複合物溶液如果不需立即使用，放入液氮中儲存。

1.5複合物MP-LupI晶體的篩選和優化

本實驗採用懸滴蒸發擴散法對MP-LupI複合物進行結晶條件篩選。MP-LupI複合物在MP和LupI單體結晶條件的基礎上，選用Hampton Research公司HR2-110 Crystal Screen^TM、HR2-112 Crystal Screen2^TM和HR2-144 Index^TM試劑盒和Molecular Dimension公司的PEG ION1/2和MD38-1/2試劑盒在24孔板上進行結晶條件初篩。在結晶篩選的過程中，調高清水條件下懸滴的蛋白濃度，降低沉澱條件下懸滴的蛋白濃度。如果出現黑色的沉澱可能是結晶溶液中含有使蛋白變性的成分。如果晶體始終較小，可用晶體撈取專用工具loop挑取晶種，接種到新的溶液中。如果出現簇狀結晶及片狀結晶，可對結晶底液的沉澱劑濃度及pH等影響因素設定梯度進行優化。

1.6複合物MP-LupI晶體挑取驗證

當觀察到類似晶體出現時，首先要區分是蛋白晶體還是鹽晶，其次是分辨是否為目的蛋白晶體。本實驗使用紫外成像拍攝和SDS-PAGE電泳法分別鑒定。在顯微鏡下用loop挑取晶體，洗滌後置於裝有純水的離心管中，加Loading Buffer煮樣，進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.7複合物MP-LupI晶體繞射數據的收集

晶體送至上海同步輻射光源SSRF處用BL17U1 synchrotron進行繞射和數據收集。晶體繞射圖片用HKL2000進行初步處理，綜合分析晶體的空間群，確定晶胞參數（Otwinowskiet al，1997）。

2結果與討論 2.1蛋白酶MP的原核表達結果

通過上述流程構建了pET22b-MP表達載體，菌液PCR的條帶如圖1所示，約與預期的蛋白酶MP基因的長度1443 bp一致。菌液送至青島擎科公司進行測序，結果經NCBI資料庫BLAST驗證，與MP序列相符，確定MP原核表達載體構建成功。

用該pET22b-MP重組質粒誘導表達得到的粗酶液用酪蛋白測活法測得具有蛋白酶活性，凝膠電泳結果如圖2所示，與未加誘導劑的對照組相比，在約48 kDa處有明顯的蛋白電泳條帶，且與蛋白酶MP分子大小一致，符合原始蛋白酶MP特徵。

2.2蛋白酶MP的製備結果

粗分離後的MP粗酶液濃縮至20~30 ml，經過HisTrap HP色譜柱純化、10 kDa超濾離心管濃縮除鹽後，可達到電泳純。每4 L培養基培養的樣品可以純化約10 mg的蛋白酶，濃縮至3.5 ml時，蛋白含量可達1.96 mg/ml，此濃度不固定，但必須量測，在與抑制劑進行複合物結合時用於添加比例的計算。色譜如圖3所示，1號峰為雜蛋白流出峰，2號峰為洗脫峰，是純化的樣品。經濃縮除鹽後的蛋白電泳如圖4所示，約48 kDa，符合MP的分子量大小。

2.3抑制劑LupI的製備結果

LupI經過超濾等分離後，可將溶液中分子量在10~30 kDa範圍外的雜質去除，並濃縮至40 ml。用HiLoad^TM26/600 Superde 200 prep grade凝膠柱進行尺寸排阻色譜純化，色譜如圖5所示。經測活和電泳驗證收集的2號峰為LupI的峰，電泳如圖6所示，在上方仍有一些微弱條帶沒有完全分離。

經過尺寸排阻色譜後收集的樣液約45 ml，用HiPrep^TMQ-FF 16/10柱進行離子交換色譜純化。收集到的LupI樣品用3 kDa的超濾離心管濃縮除鹽，每次發酵的4 L樣品可以純化約8 mg純樣品，濃縮至800μl時，LupI蛋白含量可達10 mg/ml。最後濃縮後的樣液濃度和MP一樣必須量測，用於複合物比例的計算。色譜如圖7所示，20~40 ml處的小峰為流出峰，洗脫峰共2個，經測活和電泳驗證洗脫峰的1號峰即為抑制劑LupI，電泳如圖8所示，獲得單一的抑制劑條帶，約為11 kDa，符合抑制劑LupI的分子量。

2.4 MP-LupI複合物的製備結果

根據蛋白酶MP和抑制劑LupI的含量，換算為等摩爾比進行混合。經換算後，3.5 ml的MP與150μl的LupI混合，LupI稍過量50μl以保證抑制完全，約獲得95μl蛋白含量為20 mg/ml的MP-LupI複合物樣液。

尺寸排阻色譜如圖9所示，1號峰代表MP-LupI複合物，2號峰代表可回收的抑制劑LupI。回收的抑制劑濃縮後可以繼續進行複合物的製備。複合物的電泳結果如圖10所示，達到電泳純，適用於研究結構測定及理化參數（陳旭等，2004），也符合蛋白結晶的要求。

2.5 MP-LupI複合物晶體的篩選和初步優化結果

MP-LupI複合物的濃度開始時為20 mg/ml，用MP和LupI的結晶條件進行篩選，在20 d的持續觀察中，發現大部分液滴中生長的是沉澱、鹽晶和不規則晶體小粒，其餘液滴前後無變化。改變結晶條件並加大複合物濃度至40 mg/ml，設定沉澱劑和pH梯度，於4℃和20℃兩種溫度培養晶體，仍未見有蛋白晶體生長。囙此，擴大篩選範圍，用Hampton Research公司HR2-110 Crystal Screen^TM、HR2-112 Crystal Screen2^TM和HR2-144 Index^TM試劑盒和Molecular Dimension公司的PEG ION1/2和MD38-1/2試劑盒，同時對MP-LupI複合物篩選，濃度仍保持為40 mg/ml。

擴大篩選範圍後，在2種條件下獲得晶體：PEG ION1/2試劑盒的0.1 mol/L DL-Malic acid、pH 7.0和12%（w/v）PEG 3350條件，得到MP-LupI複合物的菱形晶體；MD38-1/2試劑盒的0.2 mol/L NaCl、0.1 mol/L MES、pH 6.5和10%（w/v）PEG 4000，得到MP-LupI複合物的棱形晶體。晶體生長時間約為7 d。MP-LupI複合物晶體採用Minstrel HT UV拍照系統及Nikon SMZ800倒置顯微鏡拍照系統進行晶體圖片採集，如圖11所示，經紫外成像拍攝可以確定該結晶為蛋白結晶。經蛋白電泳驗證，符合複合物條帶（圖12）。

通過X-射線繞射進行數據收集，並對收集的數據進行處理。在0.1 mol/L DL-Malic acid、pH 7.0和12%（w/v）PEG 3350條件下得到的MP-LupI複合物的菱形晶體，分辯率在1.5Å左右，由於繞射時晶體裂開，未能進行數據收集。在0.2 mol/L NaCl、0.1 mol/L MES、pH 6.5和10%（w/v）PEG 4000條件下得到的MP-LupI複合物晶體，收集到分辯率為2Å的高品質繞射數據（圖13），初步確定其晶胞空間為P1 21 1，晶胞參數為a=51.66Å、b=51.85Å、c=102.14Å、α=γ=90°、β=97.68°。其餘繞射數據如錶1所示。

3結語

本研究通過對MP和LupI的單獨純化，再以等摩爾比混合得到MP-LupI複合物，用尺寸排阻色譜對MP-LupI複合物進行純化，達到可供結晶的電泳純級樣液。通過懸滴蒸發擴散法，在2種條件下成功獲得MP-LupI複合物晶體，並在上海光源進行X-射線繞射數據收集，得到分辯率達2Å的高品質繞射數據，其晶胞空間為P1 21 1，晶胞參數為a=51.66Å、b=51.85Å、c=102.14Å、α=γ=90°、β=97.68°。

MP-LupI複合物晶體繞射數據還需進一步精修及分析，構建完整的三維結構圖，在結構上確定沙雷氏蛋白酶與抑制劑的結合區域，從而明確沙雷氏蛋白酶抑制劑的抑制原理，為以後生產抑制劑藥物等提供理論依據。