1.中國水產科學研究院黃海水產研究所農業農村部海水養殖病害防治重點實驗室青島海洋科學與科技試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室青島市海水養殖流行病學與生物安保重點實驗室青島266071；
2.上海海洋大學水產與生命學院上海201306
收稿日期：2019-04-30；收修改稿日期：2019-05-09
基金項目：農業國際交流與合作項目和中國水產科學研究院中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金（2017HY-ZD0303）共同資助
1. Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences；Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control，Ministry of Agriculture and Rural Affairs；Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes，Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology（Qingdao）；Qingdao Key Laboratory of Mariculture Epidemiology and Biosecurity，Qingdao 266071；
2. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306
Fund: This work was supported by Projects of International Exchange and Cooperation in Agriculture，Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China，and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund，CAFS（2017HY-ZD0303）
斑石鯛（Oplegnathus punctatus）屬溫、熱帶近海魚類，廣泛分佈於中國黃海、東海、南海以及朝鮮半島、日本列島和中國臺灣等周邊海域，具有形態優美、肉質細膩、生長速度快、當年上市等優點。2014年以來，隨著大規模人工繁育和養殖獲得成功，斑石鯛已成為我國名貴海水養殖魚類新品種之一，養殖經濟效益很高（高小强等，2018）。由於規模化養殖的時間較短，斑石鯛病害尚不多見。已報導的斑石鯛疾病主要有上皮囊腫病（Egusaet al，1987；範超等，2017）、黏孢子蟲病（Yanagidaet al，2008）和卵鞭蟲病（付泉潔等，2017）等。有學者曾經從斑石鯛中分離到魚類神經壞死病毒和虹彩病毒，但未見由這些病毒導致斑石鯛大規模死亡的報導（Skliriset al，2001；Donget al，2010）。
虹彩病毒主要感染無脊椎動物和低等脊椎動物，屬大型二十面體狀、細胞質型DNA病毒。虹彩病毒科（Iridoviridae）共分為5個病毒屬，即虹彩病毒屬（Iridovirus）、綠虹彩病毒屬（Chloriridovirus）、淋巴囊腫病毒屬（Lymphocystivirus）、蛙病毒屬（Ranavirus）和腫大細胞病毒屬（Megalocytivirus）（Jancovichet al，2012）。其中，隸屬於腫大細胞病毒屬的真鯛虹彩病毒（Red sea bream iridovirus，RSIV）是魚類的重要病毒性病原之一，可導致真鯛（Pagrus major）、條石鯛（Oplegnathus fasciatus）、雜交石斑魚——褐龍斑（Epinephelus bruneus♀×E. lanceolatus♂）等海水養殖魚類發病並大量死亡，造成巨大的經濟損失（Inouyeet al，1992；李華等，2011；劉冉陽等，2019）。真鯛虹彩病毒病一直被世界動物衛生組織列為必須向其通報的魚類重要疫病，受到嚴格監控（OIE，2018）。
2017年8月，山東省煙臺市某養殖場網箱養殖的斑石鯛幼魚突然發病，並大量死亡，2周內累積死亡率超過90%。本研究通過疾病調查和分子生物學分析等方法，首次證實RSIV可導致斑石鯛大規模死亡，研究結果為防治斑石鯛病毒病提供了重要參攷。
1資料與方法
1.1實驗資料
實驗用斑石鯛取自山東省煙臺市某海水魚養殖場，自然發病的斑石鯛和人工感染用健康斑石鯛全長為14~18 cm，體重為150~200 g。
2216E培養基、弧菌選擇性培養基（TCBS）購自北京陸橋生物製品有限公司；2%多聚甲醛–2.5%戊二醛固定液購自索萊寶科技有限公司；海洋動物組織基因組DNA選取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，高保真ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker購自TaKaRa公司。其他試劑均為國產分析純。
1.2實驗方法
1.2.1流行情况調查及臨床症狀檢查
疾病暴發時，深入現場調查養殖水溫、養殖密度、魚齡、發病率、死亡率等情况，觀察病魚的活動狀態。取症狀典型的病魚，置於解剖盤中，檢查其體表症狀，然後解剖打開腹腔，觀察體腔及各內臟組織器官的病變情况，並做好記錄。
1.2.2寄生蟲和細菌檢查
取病魚的鰓絲、體表黏液、內臟器官和血液進行寄生蟲檢查。鰓絲、體表黏液採取水浸片法，脾、腎和肝採用壓片法，血液用塗片法，製片後分別置於顯微鏡下觀察。使用75%酒精棉球對病魚體表消毒後，無菌條件下取病魚的肝、腎、脾等內臟，在2216E和TCBS平板上劃線接種，28℃培養48 h，觀察細菌生長情况。
1.2.3組織病理觀察
分別取健康魚和病魚的脾、腎組織，切成小塊，置於Davidson′s AFA中固定24 h，常規石蠟切片、蘇木精–伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察、拍照。將腎臟組織切成2 mm×2 mm×2 mm的小塊，在4℃固定於2%多聚甲醛–2.5%戊二醛固定液中，在0.1 mol/L磷酸緩衝液中漂洗，再用1%鋨酸溶液固定，經過一系列濃度的乙醇脫水，樣品塊經環氧樹脂包埋後制備超薄切片，透射電鏡觀察、拍照。
1.2.4人工感染
取病魚的脾組織約1 g，加入9 ml 0.9%的生理鹽水，用玻璃勻漿器在碎冰上勻漿，然後，轉移組織勻漿液到無菌50 ml離心管中。在–40℃和室溫下反復凍融3次後，4℃3000 r/min離心30 min。取上清液，經0.22μm濾膜過濾，收集到新的50 ml離心管中，加入10%體積的100×雙抗，充分混勻、備用。健康斑石鯛隨機分成3組，每組10尾，置於26℃~28℃的海水中養殖。其中，2組作為感染組，腹腔注射上述製備的病魚組織勻漿液，0.2 ml/尾；另外1組作為對照組，腹腔注射無菌生理鹽水，0.2 ml/尾。注射後，每日觀察實驗魚的狀況、並做好記錄，持續觀察14 d以上。取瀕死實驗魚的脾、腎等組織，一部分同1.2.3製作組織切片，另一部分選取DNA、檢測病毒。
1.2.5樣品DNA選取
取脾、腎、肝等樣品選取組織DNA，用微量核酸測定儀（NanoDrop 2000c，Thermo，美國）測定DNA濃度和純度，稀釋至100 ng/μl備用。
1.2.6 PCR檢測
依照行業標準《真鯛虹彩病毒病檢疫技術規範》（SN/T 1675-2014），使用引子1-F（5′-CTCAAACACTCTGGCTCATC-3′）和1-R（5′-G-CACCAACACATCTCCTATC-3′）進行PCR檢測，目標擴增產物大小為570 bp。
25μl PCR反應體系：1μl範本DNA，2.5μl 10×Reaction buffer，2μl Mg2+（2 mmol/L），2μl dNTPs（各2.5 mmol/L），1μl引子1-F（10μmol/L），1μl引子1-R（10μmol/L），0.5μlTaq酶（5 U/μl），15μl超純水。PCR反應程式：95℃預變性2 min；94℃30 s，58℃60 s，72℃60 s，共30個迴圈；最後，72℃延伸5 min，4℃保存。反應結束，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查結果。
1.2.7斑石鯛虹彩病毒主要衣殼蛋白基因的擴增及分析
採用引子MCP-iridoF（5′-GTGCAGGTTTCC AGAAGA-3′）和MCP-iridoR（5′-CATGGTACGTAACG CATAG-3′）對虹彩病毒主要衣殼蛋白基因（Major capsid protein gene，MCP）全長序列進行擴增，目標擴增產物為1.6 Kb（史成銀，2004）。
25μl PCR反應體系：1μl範本DNA，2.5μl 10×Reaction buffer，2μl Mg2+（2 mmol/L），2μl dNTPs（各2.5 mmol/L），1μl引子MCP-iridoF（10μmol/L），1μl引子MCP-iridoR（10μmol/L），0.5μl ExTaq酶（5U/μl），15μl超純水。PCR反應程式：94℃預變性5 min；94℃2 min，57℃1 min，72℃1 min，共35個迴圈；最後，72℃延伸10 min，4℃保存。反應結束後，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查結果。將陽性擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，用Blast比對分析測序結果。從GenBank上下載16種虹彩病毒分離株的MCP基因序列，連同測序得到的斑石鯛虹彩病毒MCP基因序列，採用MEGA 7.0軟件進行多序列比對與同源性分析，構建系統發育樹。
2結果
2.1現場調查及臨床症狀檢查
2017年8月末，養殖海域水溫為26℃~28℃，山東省煙臺市某養殖場近海網箱養殖的斑石鯛突然發病死亡。起初個別網箱的斑石鯛少量死亡，但病情進展迅速。第1天僅發現死魚100餘尾，第2天死魚便高達6000餘尾，1周內3個最早發病網箱中的30000尾魚全部死亡。養殖的80萬尾幼魚發病後，日死亡率為5%~10%，2周內累積死亡率高達90%~ 95%，損失慘重。調查發現，發病斑石鯛為4~5月齡，全長為（16.3±1.6）cm，體重為（156.9±37.0）g，養殖密度為10~15尾/m3水體。病魚體表無明顯損傷，僅表現為體色發黑，遊動緩慢，活力明顯下降（圖1）。解剖可見，多數病魚空胃空腸，脾、腎嚴重腫大、易碎；肝出血，膽囊充盈。其他組織器官無明顯异常。
2.2寄生蟲檢測和細菌分離
經製片和顯微觀察，所檢斑石鯛病魚均未觀察到寄生蟲。將病魚的肝、腎、脾等內臟病料接種於2216E和TCBS平板上，28℃培養48 h，未見細菌生長。
2.3病理切片觀察結果
在石蠟切片中，可以觀察到病魚脾、腎的造血組織中存在大量嗜鹼性的、直徑達20μm的腫大細胞，其細胞核固縮。病魚腎小管上皮細胞崩解、管腔變大；腎小球毛細血管內皮細胞腫大（圖2A和圖2B）。
在病魚腎組織的超薄切片中，也觀察到許多直徑約為20μm的腫大細胞，其內可見大量的病毒粒子（圖3A）。病毒粒子無囊膜、直徑約為（145±5）nm，具有典型的虹彩病毒樣結構：最外層是截面呈六邊形的病毒外殼，最內層為高電子密度的球狀覈心，在病毒外殼和覈心之間為低電子密度的間隔區（圖3B）。
2.4人工感染實驗結果
養殖水溫為26℃~28℃時，用自然發病魚的脾和腎組織勻漿液腹腔注射感染健康斑石鯛。感染後第10天開始死亡，至14 d時，感染組累積死亡率達95%，對照組未發生死亡（圖4）。人工感染病魚體色變黑、游泳無力，表現出與自然發病魚相似的臨床症狀。人工感染病魚的脾和腎組織中也可見大量細胞質嗜鹼性的腫大細胞，且其記憶體在大量典型的類似虹彩病毒的顆粒。人工感染病魚與自然發病魚的病理特徵相似，但人工感染病魚的組織細胞病變更嚴重。
2.5 PCR檢測結果
依照中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準（SN/T 1675-2014），利用合成的真鯛虹彩病毒特异性檢測引子，對所選取的斑石鯛各組織病料DNA進行PCR檢測。4尾病魚的肝、脾、腎組織中均能擴增出約570 bp的單一條帶，與目的片段大小相符（圖5）。上述結果表明，感染斑石鯛的病毒為真鯛虹彩病毒，檢測結果為强陽性。
2.6病毒主要衣殼蛋白基因（MCP）的擴增與分析
使用魚類虹彩病毒特异性引子MCP-iridoF/ MCP-iridoR，從4尾病魚的肝、脾、腎組織中均擴增得到約1.6 Kb的單一條帶，與目的片段大小相符（圖6）。測序結果顯示，各擴增產物的長度均為1581 bp，且序列完全相同。經Blast分析，該序列包含了腫大細胞虹彩病毒1362 bp的MCP基因開放閱讀框（ORF）的全長序列，及其上游57 bp和下游162 bp的序列。
將測定的1362 bp病毒MCP基因ORF序列與GenBank資料庫中16種（株）虹彩病毒的相應序列進行比對，結果發現，感染斑石鯛的虹彩病毒與虹彩病毒科腫大細胞病毒屬的9種（株）病毒序列相似度很高，超過94%；而與虹彩病毒科其他4個病毒屬（蛙病毒屬、淋巴囊腫病毒屬、綠虹彩病毒屬和虹彩病毒屬）的6種（株）病毒的相似度低，低於55%。囙此，可以將感染斑石鯛的虹彩病毒鑒定為腫大細胞病毒屬虹彩病毒。進一步分析發現，在腫大細胞病毒屬內，引起此次斑石鯛大規模死亡的病毒與感染真鯛的RSIV RIE12-1、感染條石鯛的RBIV-C1、感染斜帶石斑魚的OSGIV的MCP基因ORF序列100%相同，與分離自湛江的斑石鯛虹彩病毒的SKIV-ZJ07僅有1個核苷酸不同，相似度為99.93%。囙此，將引起此次斑石鯛大規模死亡的虹彩病毒鑒定為真鯛虹彩病毒RSIV。依據MCP基因ORF序列的多序列比對結果，採用Mega 7軟件構建了虹彩病毒科17種（株）病毒的系統發育樹。結果顯示，引起此次斑石鯛大規模死亡的虹彩病毒與腫大細胞病毒屬各病毒聚在一起，是RSIV的一個分離株（圖7）。
3討論
近年來，腫大細胞虹彩病毒病已成為魚類最主要的病毒病之一。該屬病毒可感染多種海水養殖魚類，如真鯛、大黃魚（Larimichthys crocea）、大菱鮃（Scophthalmus maximus）、條石鯛、褐籃子魚（Siganus fuscescens）、眼斑擬石首魚（Sciaenop socellatus）、尖吻鱸（Lates calcarifer）、褐龍斑等（Inouyeet al，1992；Chenet al，2003；史成銀，2004；李華等，2011；雷燕等，2014；席雲清等，2018；Senapinet al，2019；劉冉陽等，2019），也可感染羅非魚（Oreochromis niloticus）、翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）、斑鱖（Siniperca scherzeri）、斑馬魚（Danio rerio）等淡水魚類（Subramaniamet al，2016；吳淑勤等，1997；Kimet al，2018；Bermúdezet al，2018），危害巨大。本研究通過疾病流行情况調查、臨床症狀觀察、病原檢測、組織病理觀察、人工感染實驗、分子生物學診斷和系統發育分析，確定2017年夏季引起養殖斑石鯛暴發性死亡的疾病為腫大細胞虹彩病毒病，其病原為真鯛虹彩病毒。雖已有從斑石鯛中分離到腫大細胞虹彩病毒的報導（Donget al，2010），但本研究首次證實RSIV可以導致斑石鯛大規模發病死亡。
不同種類的魚感染腫大細胞虹彩病毒病後，臨床症狀存在一定的差异。比如，大黃魚感染該病後體色發白，鰓絲極度貧血、發白且潰爛（Chenet al，2003）。眼斑擬石首魚感染該病後的主要症狀為體色變為銀黑色，鰭基出血，鰓絲貧血並有出血點（席雲清等，2018）。尖吻鱸感染該病後，出現脫鱗、鰭腐爛、腹部損傷、皮膚發紅出血等症狀（Senapinet al，2019）。翹嘴鱖感染腫大細胞虹彩病毒後，鰓、肝蒼白，內臟局部充血（吳淑勤等，1997）。本研究發現，斑石鯛感染該病後，體色變暗、遊動無力，但體表並沒有明顯的出血或者潰爛等症狀，與大菱鮃感染該病後的症狀相似（史成銀，2004）。囙此，僅從外觀症狀上很難診斷斑石鯛虹彩病毒病，必須借助於病原檢測科技才能對斑石鯛虹彩病毒病進行準確診斷。
組織病理學研究表明，魚類腫大細胞虹彩病毒病最重要的特徵是脾和腎等靶器官中存在腫大細胞，腫大細胞內含有大量的虹彩病毒粒子（Inouyeet al，1992；史成銀，2004）。本研究在斑石鯛病魚的脾和腎組織中也發現了大量的細胞質嗜鹼性的腫大細胞，這些腫大細胞內存在大量直徑約為145 nm的虹彩病毒粒子。而且，與自然發病魚相比，人工感染斑石鯛的脾和腎組織中存在更多的腫大細胞，組織病變也更嚴重。疾病調查和人工感染實驗都顯示，斑石鯛是真鯛虹彩病毒的易感宿主，病魚的組織病理變化廣泛且嚴重。
本研究通過病毒MCP基因ORF序列的測定和虹彩病毒系統發育分析，將導致此次斑石鯛暴發性死亡的病毒鑒定為真鯛虹彩病毒。值得注意的是，該養殖場的褐龍斑此前曾暴發過真鯛虹彩病毒病（劉冉陽等，2019）。經序列比對發現，感染斑石鯛和褐龍斑的虹彩病毒MCP基因序列100%相同，表明它們是同一種病毒。囙此，該養殖場不同品種的養殖魚類之間很可能存在病原交叉感染。囙此，在生產中各養殖車間要嚴格執行消毒和隔離制度，通過檢測、檢疫防止病原侵入，採取生物安保措施防範虹彩病毒病的發生和蔓延。
斑石鯛虹彩病毒病一旦暴發就難以控制，幼魚2周內累積死亡率高達90%以上，危害嚴重。在斑石鯛的規模化養殖過程中必須對該病高度重視，採取有效措施控制疾病的發生和蔓延。
