對蝦養殖業是我國漁業經濟的重要支柱產業，現時，國內對蝦養殖年產量已突破100萬t，產值超過600億元（農業農村部科技教育司等，2018），但經過10餘年的快速發展，現已進入疾病高發期，因各類疾病導致的養殖對蝦年損失已超過百億元（農業農村部漁業漁政管理局等，2018）。對蝦疾病的暴發與養殖環境關係極為密切，良好的養殖環境能减少疾病發生。然而，近年來由於養殖用地縮減，市場需求增大，對蝦養殖密度普遍提高，養殖中後期水體殘餌、糞便積累增多，導致水體氨氮、亞硝基氮濃度過高，給養殖對蝦帶來了潜在的危害。研究發現，過高濃度的氨氮不僅對對蝦具有直接的生物毒性（Barbieriet al，2010），而且會降低對蝦的免疫力（Liuet al，2004），影響其正常的生理代謝（Racottaet al，2000）。

採用益生菌改善養殖環境、提高養殖動物抗病力，是近年來水產養殖領域中的研究熱點之一。自然環境中存在大量的功能性微生物，具有殺菌（Luis-Villaseñoret al，2011；Liuet al，2015）、提高對蝦免疫力（Ochoa-Solanoet al，2006）、降解氨氮、亞硝基氮（Songet al，2011；胡修貴等，2013；王越等，2019）等功能。其中，具有脫氮功能的微生物種類較多，廣泛分佈於土壤、海水和淡水水域及水產養殖系統中（沈李東等，2011；王磊等，2016），在促進生態系統氮迴圈中發揮重要作用。

本研究從山東省濰坊市一家對蝦養殖場分離到1株具有較高脫氮能力的細菌，研究了該菌在不同鹽度、pH、碳源及C/N條件下對氨氮及亞硝基氮的去除能力，採用16S rRNA序列比對方法對該菌進行了初步的分類鑒定，同時，對該細菌進行了生物安全性評價，以期為該菌的開發利用提供技術支援。

1資料與方法 1.1實驗用對蝦及飼養管理

菌株安全性評價所用凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）購於山東省濰坊市一家對蝦養殖場，其平均體長為（4.0±0.4）cm，實驗前，於養殖池中暫養2周，水溫為27.0℃，鹽度為28.0，pH為7.4，溶解氧（DO）> 5.0 mg/L。

1.2脫氮培養基

硝化培養基的配方參照孫振（2013），經預實驗篩選確定碳源為蔗糖，硝化培養基配方（g/L）：蔗糖6.21，NH₄Cl l0.5，MgSO₄·7H₂O 0.2，CaCl₂0.01，KH₂PO₄0.5，EDTA（0.5 mol/L）0.5 ml，Na₂HPO₄0.5，FeSO₄0.01，NaCl l20，微量元素溶液為5 ml，pH為7.0~7.5。

微量元素溶液配製（g/L）:EDTA 50，ZnSO₄2.2，MnCl₂·4H₂O 5.06，FeSO₄·7H₂O 5.0，CuSO₄·5H₂O 1.57，CaCl₂5.5，（NH₄）₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1，CoCl₂·6H₂O 1.61，pH 7.0，培養基中的C/N接近20。115℃高壓蒸汽滅菌20 min（在其他成分滅菌完成後，NH₄Cl經0.22μm微孔濾膜過濾除菌後再加入），固體培養基在未滅菌之前加入20%的瓊脂粉。

1.3菌株的採集與分離

從山東省濰坊市的室外凡納濱對蝦養殖池中採集水樣，裝入無菌採樣管中低溫保存，帶回實驗室後採用Zobell 2216E（蛋白腖5 g/L、酵母膏1 g/L、FePO₄0.01 g/L、瓊脂20 g/L、陳海水1 L，pH 7.8）平板劃線法分離純化，對所有菌株進行編號，–70℃保存備用。

1.4脫氮菌株的篩選

將分離純化後的菌株採用劃線方法接種到硝化固體培養基上，28℃培養箱培養48 h，根據菌株的生長情况進行篩選。將篩選出的菌株接種至硝化液體培養基中，置於28℃150 r/min的搖床，培養48 h後測定培養基中氨氮濃度，計算各菌株脫氮效率，篩選脫氮效率最高者用於後續研究。

氨氮的測定採用次溴酸鹽氧化法，亞硝基氮測定採用萘乙二胺分光光度法（海洋監測規範第4部分）（GB 17378.4-2007）。氨氮去除率的計算按照公式：

$氨氮去除率（\%）=（初始氨氮濃度-剩餘氨氮濃度）/初始氨氮濃度\times100\%$

1.5菌株脫氮能力測定及其與菌株生長相關性分析

以蔗糖為碳源，配製C/N為20、鹽度為15，pH為7.0~7.5，氨氮濃度分別為10、20、30、40和50 mg/L的硝化培養基。平板計數法測定細菌濃度，製定菌液OD值與細菌濃度的工作曲線，根據工作曲線配製濃度為10⁷CFU/ml的菌液，以3%的接種量接入硝化液體培養基中，在28℃，150 r/min的恒溫搖床中振盪培養，每隔4 h取樣1次，部分樣品用於測定OD_{600 nm}值，剩餘樣品經3000×g離心10 min後，測定培養基上清液中的氨氮含量和各組菌液中氨氮濃度，每組設定3個平行。

菌株OD_{600 nm}與脫氮效率相關性分析：依據5個氨氮濃度組在每個取樣時間點的平均OD值及平均脫氮效率，進行相關性分析，確定相關係數。

1.6不同碳源對實驗菌脫氮效果的影響

為優化脫氮菌碳源，分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、α-乳糖和可溶性澱粉為碳源，配製氨氮濃度為20 mg/L，C/N為20的硝化液體培養基。將濃度為1.0×10⁷CFU/ml菌液以3%的接種量接種於含不同碳源的液體硝化培養基中，28℃150 r/min的恒溫搖床培養，每隔4 h取樣1次，每組設3個平行。

1.7不同鹽度對實驗菌株脫氮效果的影響

以蔗糖為碳源，配製氨氮濃度為20 mg/L、C/N為20的硝化液體培養基，用NaCl調節培養基的鹽度分別為5、15、25、35和45。參照1.5的培養及分析方法，量測各鹽度組菌株的脫氮效果，每組設3個平行。

1.8不同pH對實驗菌株脫氮效果的影響

以蔗糖為碳源，配製氨氮濃度為20 mg/L、C/N為20、鹽度為15的液體硝化培養基，分別用0.1 mol/L的HCl和NaOH溶液調節液體培養基的初始pH，使其初始值分別為5、6、7、8和9。參照1.5的培養及分析方法，量測各pH組菌株的脫氮效果，每組設3個平行。

1.9不同C/N對實驗菌株脫氮效果的影響

以蔗糖為碳源，配製氨氮濃度為20 mg/L、鹽度為15的液體硝化培養基5組，通過調節蔗糖濃度，使各組的C/N分別為5、10、15、20和25。參照1.5的培養及分析方法，量測各組菌株的脫氮效果，每組設3個平行。

1.10菌株生物安全性評價

待測菌株用Zobell2216E液體培養基發酵24 h後，3000×g 4℃離心10 min，弃上清液，用PBS重懸稀釋成菌懸液，然後在5個10 L的塑膠桶內，用過濾海水將菌液分別稀釋成濃度分別為1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷和1×10⁸CFU/ml感染用菌液各5 L。在每桶中放入10尾凡納濱對蝦浸泡感染，12 h後換水50%，之後每24 h換水30%，正常投喂養殖管理，全程充氣，記錄對蝦的攝食、脫皮、活力及存活情况，至對蝦穩定1周後，停止記錄。

1.11菌株初步鑒定

採用16S rRNA序列分析比對和系統發育分析確定菌株的分類：菌株16S rRNA PCR序列擴增所用引子及程式參照Wan等（2013），PCR擴增產物測序委託上海桑尼生物科技有限公司，所得序列經NCBI Blast比對分析，選取同源性較高的序列，利用MEGA 6.0構建系統發育樹，確定篩選菌株的分類地位。

1.12資料分析

採用Excel 2013軟件對實驗數據進行統計及相關性分析。採用SPSS16.0軟件計算細菌感染半致死濃度。

2結果 2.1脫氮菌株的篩選

從對蝦養殖池中共分離出32株菌株，經脫氮效果檢測，菌株2906脫氨氮效率達（92.1±2.4）%，為所選菌株中最高者。該菌株在2216E培養基上培養24 h，菌落直徑為1~2 mm，邊緣整齊、表面扁平，菌株淡綠色、半透明，選該菌為目標菌株用於後續研究。

2.2菌株脫氨氮能力測定、菌株生長與脫氨氮率的相關性

接種菌株2906於不同氨氮濃度的硝化培養基中，其脫氮效率見圖1。從圖1可以看出，在測試的氨氮濃度範圍內，該菌株均表現出一定的脫氮能力，32 h時對濃度為10 mg/L的氨氮去除率達（98.9±0.8）%，對濃度為50 mg/L的氨氮去除率達（52.4±0.6）%。

菌株氨氮去除率與OD值的關係見錶1，相關性分析顯示，其二者的相關係數為0.94，具有强相關性，表明菌株增殖的過程也是代謝氨氮的過程。

2.3不同碳源對實驗菌株脫氮效果的影響及發酵液中亞硝酸鹽檢測

菌株2906在7種不同碳源硝化培養基中的脫氮效率見圖2。從圖2可以看出，以檸檬酸鈉為碳源的培養基在20 h時脫氮效率達100%；以蔗糖和葡萄糖為碳源的培養基在32 h時其脫氮效率接近100%；可溶性澱粉為碳源時，菌株2906的脫氮效果最差，32 h時僅為（8.3±1.2）%，其他3種碳源組的32 h脫氮效率均低於（61.1±2.3）%。檢測各實驗組不同發酵時間段培養基中亞硝酸鹽濃度，結果顯示，測試的發酵液中均未有亞硝酸鹽檢出，即氨氧化不產生亞硝酸鹽。

2.4鹽度對實驗菌株生長及脫氮效果的影響

菌株2906在不同鹽度的硝化培養基中脫氮效率見圖3。從圖3可以看出，該菌株在鹽度為5的培養基中脫氮效率最高，在28 h到達最高脫氮效率，為（94.1±2.0）%；在鹽度為15的培養基中，32 h脫氮效率達（91.3±4.3）%；在鹽度為25的培養基中，32 h時的脫氮效率僅為（45.4±3.3）%；而在鹽度為35和45的培養基中，32 h時的脫氮效率分別為（2.06±1.8）%和（1.9±0.4）%，基本不具備脫氮能力。

2.5初始pH對實驗菌株生長及脫氮效果的影響

菌株2906在不同初始pH硝化培養基中的脫氮效率見圖4。從圖4可以看出，實驗菌株在初始pH為8和7的培養基中32 h時具有最高的脫氮效率，分別為（88.9±6.0）%和（76.8±3.2）%；在初始pH為5和6的培養基中脫氮效率較低，在32 h時分別為（12.7±0.7）%和（24.6±2.8）%；在初始pH為9的培養基中脫氮效率僅為（25.1±2.4）%。

2.6 C/N對實驗菌株脫氮效果的影響

菌株2906在不同C/N硝化培養基中的脫氮效率如圖5所示，在C/N為20的硝化培養基中，菌株的脫氮效率最高，發酵28 h脫氮效率即可達100%；C/N為15時，菌株脫氮效率次之，在32 h時脫氮效率均達100%；C/N為5時最差，發酵32 h脫氮效率僅為（53.6±3.5）%。

2.7實驗菌株安全性實驗評估

使用菌株2906浸泡感染對蝦，結果顯示，高濃度菌液（10⁸CFU/ml）組的對蝦在第3天全部死亡，其他4個濃度組到實驗第10天均存活，且在實驗期間攝食、脫皮正常，反應靈敏。根據死亡率計算可知，該菌株的LC₅₀為2.8×10⁷CFU/ml。

2.8菌株鑒定

對菌株2906進行PCR擴增測序，得到長為1440 bp序列，將擴增產物序列進行BLAST序列比對（1https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），結果顯示，該菌與多株假交替單胞菌屬細菌（Pseudoalteromonasspp.）親緣關係最近，且與菌株P. tetraodonis在一個分支上，同源性達99.5%以上，選取與該菌株相近的11株菌的核酸序列構建系統發育樹，判定該菌為1株假交替單胞菌（圖6）。

3討論

假交替單胞菌屬為1995年確立的1個新的細菌屬（Gauthieret al，1995），該屬的細菌因具有分泌生物活性物質及多共生於海洋動植物體上的特性，引起了研究者的廣泛關注。現時，已發現的該屬細菌中有20餘種能產生活性物質，其功效包括降解瓊膠、抗細菌、抗真菌、殺菌、促進水生動物幼體附著等（Holmströmet al，1999，張歡歡等，2016）。王磊等（2016）從對蝦腸道中分離出的1株假交替單胞菌，具有抗弧菌及脫氮功能，應用於對蝦養殖中，能够顯著降低水體中的氨氮濃度。本研究從對蝦養殖水體中分離出的菌株2906為適應低鹽度（5~15）的菌株，在pH為7~8時，具有較强的脫氨氮能力，而該環境條件為對蝦養殖的適宜條件，且該菌對對蝦表現出良好的生物安全性，因此，可將該菌株應用於對蝦養殖系統中，發揮其脫氮功能。

氨氧化細菌多為自養細菌，廣泛存在於土壤、湖泊及其底泥、海洋等環境中，但該類細菌極難培養（董蓮華等，2008）。近年來，關於厭氧氨氧化細菌的報導較多，厭氧氨氧化細菌能够在厭氧環境中，同時以NH₄⁺作為電子供體，NO₂^–作為電子受體，將氨氮和亞硝酸氮轉化為N₂（Mulderet al，1995）。現時，在海洋中發現的該類細菌均屬於浮黴菌綱，各種之間分類學距離較遠，發現海洋中主要種類為Candidatus scalindua（魏海峰等，2014）。本研究篩選的菌株2906為異養硝化細菌，能够利用檸檬酸鈉、蔗糖、葡萄糖等有機碳源。迄今為止，已報導的異養硝化細菌主要在假單胞菌屬（Pseudoalteromonas）（Koschorrecket al，1996）、鹽單胞菌屬（Halomonas）（張歡歡，2015）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（Yanget al，2015）、產堿杆菌屬（Alcaligenes）（van Neilet al，1992）、副球菌屬（Paracoccus）（Shiet al，2013）及克雷伯氏菌屬（Klebsiella）（Padhiet al，2013）等屬中，假交替單胞菌屬細菌具有脫氮功能的相關報導較少，該屬細菌的脫氮機理仍需後續研究。

異養硝化細菌脫氮過程與其所處的環境理化因數及營養物質有密切的關係，不同的菌株在不同的環境和營養條件下生長存在差异，適宜的碳源與鹽度（Reddyet al，2014）、pH（Fajardoet al，2014）、C/N（Karanasioset al，2016）、溶解氧（Menget al，2008）和溫度（Capuaet al，2017）等能顯著提高脫氮效果。本研究對所篩選的菌株進行脫氨氮條件比較顯示，菌株2906能够有效利用檸檬酸鈉、蔗糖及葡萄糖等有機碳，高效去除氨氮，且在氨氧化過程中，不產生亞硝酸鹽，表明該菌為異養硝化菌。異養硝化菌在氨代謝過程中，由氨單氧酶（Ammonia monooxygenase）催化氨形成羥胺後，經非血紅素鐵羥胺氧化酶（Non-haem iron hydroxylamine oxidase）的催化，直接形成N₂O和N₂（Richardsonet al，1998）。與自養細菌的代謝機制存在差別。