牙鮃<i>JNK2</i>基因的表達分析及免疫功能探究
  漁業科學進展  2020，Vol. 41 Issue（4）：12-22  DOI:10.19663/j.issn2095-9869.20190327001
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引用本文 

司瑜，王宣剛，王夢婭，王欣桐，於海洋，張全啟，王志剛.牙鮃JNK2基因的表達分析及免疫功能探究[J].漁業科學進展，2020，41（4）：12-22.DOI:10.19663/j.issn2095-9869.20190327001.
SI Yu，WANG Xuangang，WANG Mengya，WANG Xintong，YU Haiyang，ZHANG Quanqi，WANG Zhigang.Expression Analysis and Functional Characterization ofJNK2in Japanese Flounder（Paralichthys olivaceus）[J].Progress in Fishery Sciences，2020，41（4）：12-22.DOI:10.19663/j.issn2095-9869.20190327001.

基金項目

國家高技術研究發展計畫（863）項目（2012AA10A408）資助

作者簡介

司瑜，E-mail:sy03siyu@163.com；
王志剛，實驗師，E-mail:zgwang@ouc.edu.cn

通訊作者

王志剛，實驗師，E-mail:zgwang@ouc.edu.cn

文章歷史

收稿日期：2019-03-27
收修改稿日期：2019-04-25
Contents            Abstract            Full text            Figures/Tables            PDF
牙鮃JNK2基因的表達分析及免疫功能探究
司瑜 ，王宣剛，王夢婭，王欣桐，於海洋，張全啟，王志剛     
中國海洋大學海洋生命學院海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室青島266003
收稿日期：2019-03-27；收修改稿日期：2019-04-25
基金項目：國家高技術研究發展計畫（863）項目（2012AA10A408）資助
作者簡介：司瑜，E-mail:sy03siyu@163.com；
王志剛，實驗師，E-mail:zgwang@ouc.edu.cn.
通訊作者：王志剛，實驗師，E-mail:zgwang@ouc.edu.cn.
摘要：本研究利用實驗室已建牙鮃（Paralichthys olivaceus）轉錄組資料庫，得到牙鮃JNK2基因（PoJNK2）並利用PCR科技進行序列驗證。PoJNK2的開放閱讀框長度為1263 bp，編碼420個胺基酸；通過SMART服務器對PoJNK2的結構域進行預測，顯示PoJNK2具有典型的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶催化結構域S_TKc。利用qRT-PCR分析PoJNK2在牙鮃成體不同組織中的表達水准，發現其在牙鮃免疫組織中均有表達，囙此，初步推測PoJNK2在牙鮃免疫應答方面可能發揮作用。本研究設計了體內遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）侵染實驗和體外免疫刺激細胞實驗以探究PoJNK2在牙鮃免疫反應中的作用。在遲緩愛德華氏菌體內注射牙鮃成體後，PoJNK2在脾臟、頭腎和鰓中有不同程度的表達上調。同時，使用遲緩愛德華氏菌、PolyⅠ：C和腫瘤壞死因數-α（TNF-α）刺激牙鮃鰓細胞系後，發現PoJNK2在不同時間點表達上調。除此之外，通過細胞轉染實驗在牙鮃鰓細胞系中過表達PoJNK2，發現其對下游炎症細胞因數的表達及啟動蛋白Activator protein-1（AP-1）的轉錄活性具有顯著的上調作用，進一步闡明了PoJNK2在調節牙鮃免疫應答方面的作用。
關鍵字：牙鮃    JNK2    遲緩愛德華氏菌    先天免疫    
Expression Analysis and Functional Characterization ofJNK2in Japanese Flounder（Paralichthys olivaceus）
SI Yu ，WANG Xuangang，WANG Mengya，WANG Xintong，YU Haiyang，ZHANG Quanqi，WANG Zhigang     
Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding，Ministry of Education，College of Marine Life Sciences，Ocean University of China，Qingdao 266003
Corresponding author:WANG Zhigang，E-mail:zgwang@ouc.edu.cn.
Fund: This work was supported by National High Technology Development Program of China（863）（2012AA10A408）
Abstract：The immune system of teleost，similar to mammals，is divided into two subsystems: Innate immune system and acquired immune system.Acting as the first line of defense against invading pathogens and pathogenicity factors，the innate immune system can be activated by the pattern recognition receptor（PRRs）which can recognize the pathogen-associated molecular pattern（PAMPs）and activate the downstream inflammatory response accordingly.MAPK（mitogen-activated protein kinase）signaling pathway is an important signal transduction system in eukaryote cells，which can mediate extracellular signaling into the cell and participate in various cellular processes such as cell proliferation，apoptosis，and immune response.JNK（c-Jun N-terminal kinase）signal pathway is an important branch of MAPK signal pathway.JNKhave been extensively studied in mammals，but not adequately in the teleost.In this research，we designed experiments to study the role ofJNK2genes in the antimicrobial reaction of Japanese flounder and their effects on the downstream of the pathway in order to provide a theoretical basis for the study of JNK signaling pathway in fish.In this study，theJNK2gene sequences of Japanese flounder were obtained from the transcription database of flounder and named afterPoJNK2. ThePoJNK2ORF region encodes is 1263 bp and encodes 420 amino acids.The domains ofPoJNK2genes were predicted by SMART server.The results showed that theJNK2gene had a typical serine-threonine protein kinase domain S_TKc.The expression levels ofPoJNK2genes in different tissues of flounder were analyzed by the qRT-PCR technique.It was found thatPoJNK2were widely expressed in the immune tissue of Japanese flounder.Therefore，it was preliminarily speculated thatPoJNK2played a major role in the immune response of Japanese flounder.We designed an infection experiment ofEdwardsiella tarda in vivoand immune stimulatory cell experimentsin vitroto investigate the role ofPoJNK2in the immune response of Japanese flounder.The expression ofPoJNK2was up-regulated in the spleen，kidney，and gill of Japanese flounder after injectingE. tarda in vivo. At the same time，the gill cells of flounder（FG）were stimulated byE. tarda，PolyⅠ：C and TNF-α.The expression ofPoJNK2was up-regulated at different time points.In addition，we overexpressedPoJNK2in FG by cell transfection and it was found thatPoJNK2had significant regulatory effects on the regulation of downstream pro-inflammatory cytokines and transcription factor AP-1.The role ofPoJNK2in regulating the immune response of Japanese flounder was further clarified.
Key words：Japanese flounder    JNK2    Edwardsiella tarda    Innate immunity    

魚類是最古老的脊椎動物，在生物進化史中具有十分重要的地位。與哺乳類動物類似，魚類也具有完善的免疫器官、組織和多種免疫細胞，這些是魚類進行免疫預防各種疾病的免疫基礎（Litmanet al，2005）。先天免疫系統是最早以非特异性的管道保護宿主免受其他有機體感染的免疫機制，是無脊椎動物和低等脊椎動物免疫防禦的基礎。發揮先天免疫作用的細胞以一種通用的管道識別病原體並做出免疫應答（Marchaloniset al，1998）。

c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族的重要亞基（Sluss，1996）。最早發現並鑒定出的哺乳動物JNK基因包括3種，它們分別被認定為JNK1、JNK2和JNK3（也分別稱為應激啟動蛋白激酶SAPK-γ、SAPK-α和SAPK-β）（Dérijardet al，1994）。JNK1和JNK2基因廣泛表達。相比之下，JNK3基因的表達模式相對有限，主要局限於大腦、心臟和睾丸（Guptaet al，1996）。JNK蛋白激酶在TNF訊號通路中由腫瘤壞死因數受體相關蛋白（TRAF2）啟動，在IL-1啟動後由TRAF6進一步啟動（Lomagaet al，1999）。之後，JNK又通過絲列原活化蛋白激酶激酶4（MKK4）（也稱為SEK1）和MKK7在Thr和Tyr上的磷酸化而啟動。MAPKK正是通過對Thr和Tyr上的T環發生磷酸化反應來啟動JNK，絲氨酸磷酸酶、酪氨酸磷酸酶和雙重特异性磷酸酶在介導JNK發生去磷酸化失活時必不可少（Keyse，2000）。JNK通路在先天免疫反應中具有進化保守性。在果蠅細胞中，JNK通路在脂多糖（LPS）作用下被啟動（Sluss，1996）。在哺乳動物中，LPS或腫瘤壞死因數（TNF）、白細胞介素（IL）-1等炎性細胞因數可强烈誘導啟動多種細胞類型的JNK（Changet al，2001）。在成纖維細胞中，JNK2的缺乏導致多種細胞因數嚴重减少，包括Ⅰ型干擾素（IFN）和IL-6（Chuet al，1999）。

硬骨魚是一種研究早期脊椎動物天然免疫應答功能的良好模型（Whyte，2007）。牙鮃（Paralichthys olivaceus）是一種名貴的海產魚類，其肉質鮮美，營養豐富，經濟價值高，是重要的海水增養殖魚類之一，市場十分廣闊（李澤宇等，2018）。瞭解牙鮃的先天防禦機制，可以幫助我們控制魚類疾病，保持魚類養殖業的長期可持續性。遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）是一種常見的胞內致病菌，會引起宿主感染愛德華氏菌病並導致死亡（Abaynehet al，2013）。遲緩愛德華氏菌通過侵染吸附在細胞表面，向宿主細胞內注入毒力因數從而使宿主感染病菌（Raoet al，2001）。它會引起魚類的敗血症，並伴有廣泛的皮膚損害，影響肝臟、腎臟、脾臟和肌肉等內臟。這種細菌能够避免宿主的防禦機制，從而在宿主體內迅速繁殖並導致死亡（Raoet al，2001）。大部分魚類都會受到遲緩愛德華氏菌的影響，包括鯉魚、羅非魚、鯰魚和牙鮃（Psetta maxima）等（Castroet al，2010；Linget al，2000）。本研究從牙鮃中尅隆獲得了免疫相關基因JNK2，並對其進行了鑒定。採用體內和體外2種方法對PoJNK2基因的表達模式以及對下游炎症細胞因數和轉錄因數AP-1的調節作用進行了探究。本研究可為魚類抗病育種的研究提供理論參攷，同時揭示了PoJNK2的促炎作用，可為魚類疾病的治療和預防提供理論支持。

1資料與方法 1.1資料 1.1.1牙鮃

在本實驗中，所用牙鮃來自山東海陽黃海水產有限公司。隨機選取3條雄魚和3條雌魚（1.5年齡，體長320~420 mm，體重500~700 g），經尾靜脈抽血處死後進行解剖，每條魚取心臟、肝臟、脾臟、頭腎、腦、鰓、肌肉和腸8個組織，經液氮冷凍後保存於-80℃冰箱。

1.1.2牙鮃鰓細胞系（FG9307）

來自中國海洋大學細胞工程技術實驗室饋贈。該細胞用DMEM/F12培養基[向其中加入10%（v/v）FBS（胎牛血清）、1%（v/v）NEAA和100 U/ml青黴素），24℃培養。

1.1.3遲緩愛德華氏菌

實驗所用遲緩愛德華氏菌菌株為本實驗室保存菌株。待使用時將該菌株劃線接種於LB固體培養基中，28℃活化培養12 h。活化後，將單尅隆菌落接種於LB液體培養基中，28℃搖晃培養12 h。用PBS緩衝液稀釋使其終濃度為107CFU/ml。

1.1.4牙鮃遲緩愛德華氏菌攻毒實驗及免疫相關器官的RNA選取

來自本實驗室學生製作，具體實驗操作步驟詳見本實驗室已發表論文（曹丹丹等，2018），選取RNA後，使用反轉錄試劑盒反轉錄成濃度為100 ng/μl cDNA範本，保存於-80℃，待使用時稀釋至10 ng/μl。

1.2方法 1.2.1PoJNK2基因序列分析

本研究分別通過分析比對胺基酸與核酸序列、脊椎動物JNK基因所編碼胺基酸序列和系統進化對PoJNK2基因進行序列分析。DNAman程式用於分析胺基酸與核酸序列比對，MEGALIGN和DNAstar程式用於分析脊椎動物JNK基因結構域保守性，ClustalW和MEGA 6程式用於分析系統進化。該分析過程中所用到的脊椎動物JNK基因序號詳見錶1。

錶1實驗所用JNK2基因編號 Tab.1 JNK2sequences used in this study
1.2.2獲得PoJNK2基因的覈心片段

在NCBI資料庫中蒐索到斑馬魚和半滑舌鰨JNK2序列，並在實驗室已建立的牙鮃基因組和轉錄組資料庫中進行比對，得到PoJNK2基因的cDNA序列，根據比對結果設計擴增PoJNK2基因覈心序列的特异性引子PoJNK2-FW1/ RV1，詳見錶2，利用PCR科技尅隆驗證。

錶2實驗所用引子 Tab.2The primers used in this study
1.2.3PoJNK2基因的組織表達分析

根據定量引子設計原則，設計PoJNK2的qRT-PCR引子PoJNK2- qFw/qRv。選定牙鮃β-actin基因作為內參基因，通過qRT-PCR（SYBR qPCR SuperMix，Novoprotein，上海）分析在牙鮃成魚的不同組織中PoJNK2基因的表達情况。qRT-PCR所用範本為資料1.1.1中cDNA範本。

1.2.4遲緩愛德華氏菌、polyⅠ：C、TNF-α刺激牙鮃鰓細胞系

將生長狀態良好的牙鮃鰓細胞系傳代接板至12孔板，生長至細胞覆蓋度達80%以上。向每孔中加入Polyinosinic: polycytidylic acid（PolyⅠ：C，Sigma）、TNF-α（科昕生物公司）和遲緩愛德華氏菌，使終濃度分別為50μg/ml、20 ng/ml和5×106CFU/ml。對照組分別加入相同濃度的PBS。

分別在刺激0、3、6、9和12 h時收集細胞樣品（遲緩愛德華氏菌刺激組，取刺激後0、3、9、12 h的細胞樣品），存於Trizol中待用。

1.2.5PoJNK2過表達載體構建

為更深入地探究牙鮃JNK2的基因功能，構建了PoJNK2的2種不同表達載體，分別以p-EGFP-N1和p-cDNA3.1-A為載體，其中，以p-EGFP-N1為載體所構建的表達載體帶綠色螢光。在PoJNK2基因的ORF兩端，即ATG處和TAG處利用引子PoJNK2-Fw2/Rv2設計XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點。通過雙酶切得到PoJNK2的ORF尅隆片段，連接到p-EGFP-N1質粒中，得到p-JNK2- EGFP重組質粒。使用同樣的方法，在PoJNK2基因的ORF兩端利用引子PoJNK2-Fw3/Rv3設計HindⅢ和BamHⅠ酶切位點，與p-cDNA3.1質粒連接，得到p-cDNA3.1-JNK2重組質粒。

1.2.6PoJNK2基因在牙鮃鰓細胞系中的過表達

將生長狀態良好的牙鮃鰓細胞系接板到12孔板，培養至細胞單層均勻覆蓋密度達80%以上。使用LipofectamineTM2000（US Everbright，Inc.，蘇州）進行p-JNK2-EGFP質粒轉染，同時轉染p-EGFP-N1質粒作為對照；轉染p-cDNA3.1-JNK2質粒，對照組使用p-cDNA3.1-A質粒，具體步驟詳見說明書。轉染48 h以後，將p-JNK2-EGFP組細胞用DAPI染色後在雷射共聚焦顯微鏡下觀察拍照。p-cDNA3.1-JNK2組細胞在轉染24 h後，使用20 ng/ml TNF-α進行刺激，24 h後選取細胞總RNA待用。

1.2.7免疫調節檢測實驗

將轉染p-cDNA3.1- JNK2質粒48 h後的牙鮃鰓細胞，用20 ng/ml的TNF-α進行刺激，對照組用PBS處理。在刺激24 h以後，收集細胞樣品，選取RNA，用qRT-PCR檢測下游IL-6、IL-8和TNF-α的表達變化情况。

1.2.8雙螢光報告實驗

為了探究PoJNK2基因的表達變化對MAPK訊號通路下游AP-1的轉錄調控作用，設計了雙螢光素酶報告實驗，檢測JNK2基因在HEK-293T細胞中過表達後對AP-1轉錄因數的表達影響。使用LipofectamineTM2000將p-cDNA3.1-JNK2質粒轉染至HEK-293T細胞中，同時轉染p-AP-1-luc螢光素酶報告質粒（碧雲天生物公司），設定陰性對照組和空載質粒組，陰性對照組即在HEK-293T細胞中只轉染p-AP-1-luc螢光素酶報告質粒，空載質粒組即轉染空載質粒p-cDNA3.1和p-AP-1-luc螢光素酶報告質粒。根據雙螢光素酶報告系統實驗要求，按照p-AP-1-luc螢光素酶報告質粒：海腎螢光素酶報告質粒（pRL-TK）=50:1的比例，再在每個孔中共轉染pRL-TK，轉染24 h後進行雙螢光素酶活性檢測。

1.2.9資料分析

本實驗所涉及數據差异性分析，均利用SPSS 20.0軟件，使用單因素方差（One-way ANOVA）T檢驗進行比較。所有數據以平均值±標準誤（Mean±SE）（n=3）表示，各個組之間的差异性用*表示（*P< 0.05；**P< 0.01）。

2結果 2.1PoJNK2基因的序列分析

首先通過蒐索本實驗室的牙鮃轉錄組庫，與NCBI資料庫中的序列進行比對，獲得了PoJNK2基因序列，PoJNK2ORF序列長1263 bp，編碼420個胺基酸。

為探究JNK2在脊椎動物中的進化關係，本研究利用MEGA 6構建了由不同脊椎動物的JNK2基因組成的系統進化樹（圖2），牙鮃與大菱鮃（Scophthalmus maximus）在親緣關係上最為接近。通過線上蛋白結構預測軟件SMART對JNK2基因的結構域進行預測，結果顯示，JNK2基因具有典型的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶催化結構域S_TKc。利用GENEDOC服務器對牙鮃JNK2的胺基酸序列與其他硬骨魚胺基酸序列進行比對分析（圖3），結果顯示，PoJNK2的S_TKc結構域與其他硬骨魚的S_TKc結構域高度保守。

圖1 PoJNK2基因的核苷酸序列與胺基酸序列對應圖 Fig.1The nucleotide and deduced amino acid sequences ofPoJNK2
圖2 JNK2的系統進化分析 Fig.2The phylogenetic analysis diagram ofJNK2
圖3PoJNK2與其他已知JNK蛋白的MUSCLE的多重序列比對 Fig.3Multiple sequence alignment of PoJNK2 with MUSCLE of other known JNK proteins 黑色區域表示每個胺基酸位點的同源性至少為70%。S_TKc結構域標注在上方的灰色條中 The black region indicates that the homology of each amino acid locus is at least the 70%.S_TKc domain is indicated as gray bars above the alignment
2.2PoJNK2基因的組織表達分析

通過qRT-PCR分析牙鮃PoJNK2基因在不同組織中的表達模式（圖4），在牙鮃心臟、肝臟、脾臟、頭腎、腦、鰓、肌肉、腸8個組織中均有表達。其中，PoJNK2在鰓中表達最高，在腦和腸中表達也較高。

圖4 PoJNK2基因在牙鮃各個組織中的表達模式 Fig.4Expression ofPoJNK2genes in different tissues of Japanese flounder β-actin基因是定量分析的內參對照，誤差線代表平均值±標準誤（n=3） β-actingene expression was used as internal control，vertical bars represent the Mean±SE（n=3）
2.3遲緩愛德華氏菌刺激成年牙鮃後PoJNK2基因的差异表達分析

在遲緩愛德華氏菌侵染牙鮃成魚後，分別取了不同時間點的注菌組和對照組的脾臟、頭腎、鰓3個組織，探究PoJNK2在遲緩愛德華氏菌刺激下的表達模式，qRT-PCR結果顯示，在脾臟、頭腎、鰓3個組織中，遲緩愛德華氏菌的刺激引起了PoJNK2的不同程度的變化（圖5）。

圖5 PoJNK2在遲緩愛德華菌刺激牙鮃組織中的表達模式 Fig.5The expression pattern ofPoJNK2in Japanese flounder stimulated byE.tarda β-actin基因是定量分析的內參對照，時間點0 h表達量用作參照樣品。誤差線代表平均值±標準誤（n=3）。實驗組與空白對照（0 h）之間的顯著差异由星號表示（*P< 0.05；**P< 0.01）。下同 β-actingene was used as reference sample.The error line represents Mean±SE（n=3）.The significant difference between the experimental group and the blank control（0 hours）was indicated by the asterisk（*P< 0.05；**P< 0.01）.The same as below

分析PoJNK2的表達變化：在脾臟中（圖5A），遲緩愛德華氏菌刺激後，PoJNK2的表達沒有太大的變化，直到刺激48 h時，實驗組PoJNK2的表達量上升至對照組的1.8倍。在頭腎中（圖5B），隨著遲緩愛德華氏菌刺激作用的延長，PoJNK2的表達呈現出先升高後降低的趨勢，在12 h時實驗組表達量上升至對照組的2.2倍，隨後開始下降，到48 h時降至對照組的1.3倍。在鰓中（圖5C），PoJNK2的表達趨勢是先升高再降低又升高，在3 h時實驗組表達量是對照組的1.7倍，在24 h時下降至0.6倍，而後又在48 h時上升至1.4倍。

2.4免疫刺激牙鮃鰓細胞系後PoJNK2基因的差异表達分析

為研究PoJNK2在抗病原菌感染方面發揮的重要作用，分別使用1.2.4中處理得到的cDNA範本，通過qRT-PCR分析PoJNK2的表達變化。結果如圖6所示，遲緩愛德華氏菌、polyⅠ：C、TNF-α刺激均能使PoJNK2的表達上調。觀察PoJNK2在不同情况刺激下表達量的變化：在使用PBS刺激的對照組中（圖6A），PoJNK2的表達基本沒有變化。在PolyⅠ：C刺激時（圖6B），PoJNK2在刺激前12 h裏表達量沒有明顯變化，到24 h時，表達量突然升高至0 h的2.2倍。在TNF-α刺激時（圖6C），PoJNK2的表達是在12 h時開始新增，到24 h時，升高至0 h的2.6倍。遲緩愛德華氏菌刺激時（圖4D），PoJNK2的表達逐漸升高，到24 h時表達量達到0 h的3.4倍。

圖6 PoJNK2在免疫刺激牙鮃鰓細胞中的表達模式 Fig.6Expression pattern ofJNK2in gill cells of immune stimulated Japanese flounder A~D：PoJNK2的mRNA水准在不同刺激下的FG細胞的定量表達模式，包括PBS、PolyⅠ：C、TNF-α和E.tarda。 A~D: Quantitative expression patterns ofJNK2mRNA in FG cells stimulated by different stimuli，including PBS，PolyⅠ：C，TNF-αandEdwardiella tarda
2.5 PoJNK2的亞細胞定位

通過雷射共聚焦顯微鏡觀察細胞轉染P-JNK2- EGFP重組質粒後的狀態，結果顯示（圖7），與其他脊椎動物蛋白相似，PoJNK2在細胞質和細胞核中都有表達。

圖7PoJNK2蛋白的亞細胞定位 Fig.7Subcellular localization of JNK2 proteins in Japanese flounder 雷射共聚焦掃描顯微鏡下，PoJNK2（綠色螢光）在細胞中的分佈。核DNA用DAPI染色，為藍色螢光，pEGFP-N1用作陰性對照。Bar = 10μm Under laser confocal scanning microscope（LSCM），PoJNK2 in the whole cell，mainly in the cytoplasm.Nuclear DNA was stained with DAPI，blue fluorescence，pEGFP-N1 was used as negative control.Bar = 10μm
2.6PoJNK2基因過表達對通路下游IL-6、IL-8和TNF-α等細胞因數的調節作用

本實驗深入研究了PoJNK2在抵抗病原菌侵害方面發揮的作用，通過qRT-PCR分析顯示，相比空白對照組和轉染空載質粒p-cDNA3.1組，過表達PoJNK2以後（圖8），牙鮃鰓細胞內的JNK2的表達量明顯升高至空白對照組的6.4倍。

圖8 PoJNK2過表達對TNF-α刺激的FG細胞中通路下游細胞因數的表達的影響 Fig.8Effect ofPoJNK2overexpression on the expression of cytokines downstream of pathway in FG cells stimulated by TNF-α A: qRT-PCR顯示PoJNK2過表達後，mRNA表達量升高；B、C、D:轉染24 h後，細胞用TNF-α刺激（20 ng/ml）刺激24 h，通過qRT-PCR分析IL-6和IL-8、TNF-α的表達水准 A: The expression of mRNA increased after overexpression ofJNK2by qRT-PCR.B，C，and D: The expression levels of IL-6，IL-8 and TNF-αwere analyzed by qRT-PCR.The cells were stimulated with TNF-α（20 ng/ml）for 24 hours after transfection

同時，還發現PoJNK2的過表達會使得通路下游的各個細胞因數均有不同程度的表達上調。PoJNK2過表達後，IL-6的表達量與p-cDNA3.1組和空白對照組相比分別升高了8.5和15.8倍；IL-8的表達量與p-cDNA3.1組和空白對照組相比分別升高了7.8和17.9倍；TNF-α的表達量與p-cDNA3.1組和空白對照組相比分別升高了24.7倍和35.9倍。

2.7PoJNK2基因過表達對下游AP-1的轉錄調控作用

為確定PoJNK2基因過表達後是否會對MAPK訊號通路下游的轉錄因數AP-1有啟動作用，設計雙螢光素酶報告實驗，結果如圖9所示，與空白對照組和轉染p-cDNA3.1組相比，JNK2的過表達顯著增强MAPK訊號通路下游轉錄因數AP-1的轉錄活性。

圖9 PoJNK2過表達對AP-1報告基因活性的影響 Fig.9The effect of overexpression ofPoJNK2on the activity of AP-1 reporter gene in Japanese flounder 轉染24 h後檢測螢光素酶活性。未轉染質粒和轉染p-cDNA3.1作為對照，顯著差异由星號表示（*P< 0.05；**P< 0.01） The results showed that AP-1 luciferase reported the change of fluorescence intensity of plasmids.Luciferase activity was detected 24 hours after transfection.The difference between untransfected plasmid and transfected p-cDNA3.1 was indicated by asterisk（*P< 0.05；*P< 0.01）
3討論

在以往研究中，從節肢動物到哺乳動物，JNK作為保守的應激啟動蛋白激酶，可被多種免疫刺激物啟動，並在宿主防禦和免疫反應方面發揮重要作用（Delaneyet al，2006）。然而，對於硬骨魚類，特別是牙鮃JNK功能的瞭解還十分有限。本研究對牙鮃JNK基因進行了序列鑒定和功能探究。

本研究發現，牙鮃JNK2具有典型的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶催化結構域S_TKc，且通過胺基酸序列分析顯示，牙鮃JNK2的S_TKc結構域與其他硬骨魚的S_TKc結構域高度保守，說明牙鮃JNK2與大部分硬骨魚的JNK的同源性較高。

根據Zapata等（2006）研究發現，魚類的免疫器官主要包括腎臟、脾臟、胸腺和腸道相關淋巴組織。同時，也有報導證實魚類的鰓在抗病毒免疫方面發揮著重要作用（Liet al，2014）。本研究發現，PoJNK2在腦、鰓和腸中表達較高，囙此，推測PoJNK2在牙鮃對抗外來病原體的免疫防禦中可能起著重要作用。為了探究這種免疫防禦機制，使用遲緩愛德華氏菌侵染牙鮃的脾臟、頭腎和鰓，定量檢測PoJNK2的表達變化。結果發現，經遲緩愛德華氏菌刺激後，這3個組織中的PoJNK2的表達水准顯著增加，基本呈現先升高後降低或者先升高後降低又升高的趨勢。該結果進一步闡明了PoJNK2在牙鮃免疫防禦中發揮的保護作用。然而，還需要進一步的研究來揭示這種免疫防禦機制。

PolyI:C是一種病毒dsRNA類似物，在體內可以作為干擾素抑制劑（Liuet al，2017）。TNF-α是一種由巨噬細胞衍生的具有抗腫瘤活性的細胞因數，與炎症、免疫調節、抗病毒防禦、內毒素休克和有絲分裂等多種生物學過程有關（Hattoriet al，1996）。PolyI:C和TNF-α經常在實驗中被用來類比病毒對細胞進行刺激。Nishitoh等（1998）向293T細胞中轉染含HA標記的JNK（HA-JNK）後，再使用TNF-α刺激，用免疫複合物激酶法檢測JNK活性發現，TNF-α可誘導JNK活化，並推測TNF-α對JNK的啟動可能是依賴於硫醇/二硫鍵的交換反應。本研究免疫刺激實驗結果表明，PolyI:C、TNF-α和遲緩愛德華氏菌均能使PoJNK2的表達上調，但上調幅度有所不同。這說明PoJNK2在面對不同的免疫刺激其產生的免疫應答效果是不同的，其原因可能是細胞對於特定的免疫刺激物和活細菌的反應機制不一樣。通過本研究結果可以確認細菌和病毒類似物均可刺激PoJNK2表達新增，說明PoJNK2在牙鮃抗菌抗病毒反應中可能發揮一定的作用。

炎症細胞因數是一類控制炎症細胞反應的免疫調節分子，主要包括IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-18和TNF-α等。細胞因數可與特定的細胞因數抑制劑和可溶性細胞因數受體協同作用，調節人體的免疫應答（Giorgoset al，2014）。已有研究證實，哺乳動物中一些胞內類型的細菌感染可强烈啟動JNK通路，而且在免疫刺激下，JNK啟動是產生多種炎症細胞因數所必需的（Chuet al，1999）。本研究證實了以上結論，PoJNK2過表達後能顯著上調IL-6、IL-8和TNF-α的表達。這些結果表明，PoJNK2在牙鮃體內發揮免疫作用的機制可能是通過調節細胞因數從而產生促炎反應。

據研究，MAPK訊號通路能够介導從細胞外到細胞質或細胞核的信號轉導，從而調節多種細胞過程（Yanget al，2012）。與其他MAPK成員相似，JNK蛋白主要分佈在胞漿中，沒有外部訊號。在適當的環境刺激下，特异性上游MKK4或MKK7激酶通過雙重磷酸化啟動JNK。然後，磷酸化的JNK轉移到細胞核，啟動轉錄因數以改變靶基因的表達（Davis，2000）。在Dunn等（2002）的研究中，證實JNK可以啟動下游轉錄因數AP-1，然後調控著對病原體的反應起重要作用的各種炎症細胞因數的產生。Qu等（2015）研究表明，JNK通路可以調節AP-1在軟體動物中對藻溶弧菌感染的反應。同樣，在本研究中，PoJNK2的過表達顯著啟動了AP-1螢光素酶報告質粒的活性。這些發現表明，在牙鮃的感染過程中，PoJNK2可能是通過啟動轉錄因數AP-1改變靶基因的表達，進而參與免疫反應。

綜上所述，本研究首次在牙鮃中尅隆驗證了PoJNK2基因，核酸、胺基酸序列比對及系統進化分析都顯示出JNK2基因與大多數硬骨魚具有較高的保守性。組織表達表明，PoJNK2主要在牙鮃的免疫組織中表達。體內注射遲緩愛德華氏菌和體外免疫刺激（包括PolyI:C、TNF-α和遲緩愛德華氏菌）均能够增强PoJNK2的表達；作為胞內蛋白，PoJNK2在細胞內過表達會啟動MAPK通路下游AP-1的轉錄，並顯著上調炎症細胞因數IL-6、IL-8和TNF-α的表達。本研究為海水魚類抗病育種和疾病防治提供了理論參攷。

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