基于抗体的中枢神经系统离子通道药物靶点验证

靶点选择可能是早期药物发现中最关键的一步。这一具有开创性的事件决定了追求的目标、对特定疾病的“验证”水平以及是否使用小分子或大分子、激动剂或拮抗剂等来追求它，触发了许多下游活动，需要大量的时间、人力和财力投资。导致离子通道靶点选择的过程和事件非常复杂，在制药/生物技术行业和学术界差异很大。然而，一旦选择了离子通道靶点，对其进行严格表征的方法就很常见，需要在遗传学、解剖学、生物化学、细胞生物学和电生理学方面进行系统的、多学科的努力。尽管所有候选药物靶点都需要详细描述才能有效地进行研究，但多亚单位离子通道是最具挑战性的，并且由于细胞类型的多样性、通道表型的多样性和高度极化的神经元结构，CNS通道尤其令人畏惧。本观点的目的是根据中枢神经系统药物发现项目中专注于神经元电压门控钾的经验，描述离子通道靶点表征和药物发现选择的一些挑战⁺（千伏）信道。这些项目的基石是开发具有广泛特征的特异性抗体试剂，这些试剂可用于生成有关单个通道复合物的分布、亚细胞定位和分子组成的详细信息，作为靶点选择的基础，并帮助确定亚型选择性通道调制器的潜在治疗应用(Rhodes等人，1996年,1997,2004;Bowlby等人，2005年).

针对CNS中的Kv通道是一项极具挑战性的工作。在理想的范式中，人们可以根据其生物物理和药理学特性、与特定神经递质系统的关联以及中枢神经系统疾病中的失调模式，选择Kv通道进行药物发现。这些信息，再加上对通道亚单位组成的理解，将用于构建表达组成亚单位的细胞系，用于识别和表征调节通道活性的分子。对通道解剖分布的了解将指导体外和体内药理学模型的选择，然后将用于探索通道调节的后果，并进一步阐明潜在的治疗效用。解剖和体内数据也可能揭示与调节靶通道活动相关的潜在不良后果。

然而，这个过程很少这么简单。虽然可以使用传统电生理记录技术来表征许多神经元Kv通道的基本生物物理和药理学特性，但电压敏感和形成孔的Kvα亚基及其相关细胞质Kvβ亚基的组合组装，导致形成了一系列令人难以置信的多样化通道类型(1997年1月和1月). 这种亚单位的异源多聚体组装使得根据可在异源细胞中表达以支持药物筛选的组成亚单位来定义天然Kv电流变得极为困难。更为复杂的是，观察到一些Kv通道以远端树突为靶点，一些沿着有髓轴突聚集，其他则集中在神经末梢(Trimmer和Rhodes，2004年)-传统电生理记录难以访问的所有位置，因此难以在生物物理或药理学水平上进行研究。最后，在本征电流可以表征的情况下，目前不可能重述异源表达系统中本征通道的亚单位组成或化学计量。总之，这些挑战迫使我们在我们对本地频道的了解和我们在细胞文化系统中实际可以实现的目标之间达成妥协。然而，为了筛查、铅鉴定和药物发现的目的，基于解剖观察和共免疫沉淀分析的解剖分布和亚单位共结合知识为开始这一过程提供了良好的场所。

当我们开始研究K的药理学时⁺在20世纪90年代初，人们对天然蛋白质的生理学、生物化学和药理学知之甚少。鉴定cDNA和表征哺乳动物Kv通道的Kv通道α亚基电导特性的初步报告刚刚出现（例如。，Chandy等人，1990年)许多实验室正在努力将编码单个亚单位的mRNA的表达与培养神经元或脑片记录的电流相关联（例如。，Koch等人，1997年). 然而，随着这些数据的出现，很明显，在异源细胞中单独表达的Kv通道α亚基的特性与在天然系统中记录的电流特性之间没有1:1的相关性。此外，由于神经元是高度极化的细胞，人们很快意识到，体细胞上mRNA的表达对于编码蛋白的亚细胞位置没有信息，因此无法深入了解通道在神经元生理学中的潜在作用。由于单个神经元表达了许多不同的Kv亚单位，因此也清楚地表明，mRNA定位作为将亚单位表达与Kv通道电流关联的工具的价值有限。需要使用试剂来确定蛋白质亚单位并确定其丰度和分布。

面对这一挑战，我们决定采用一种综合免疫学和神经解剖学方法，该方法依赖于大量努力来产生和表征针对单个通道亚单位的亚单位特异性鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体（以下分别称为单抗和单抗）。我们使用这些抗体作为工具来阐明Kv通道的亚单位组成，揭示其亚细胞分布，并确定其与哺乳动物大脑中特定神经递质系统的关联。虽然抗体在药物发现的靶点验证的各个方面都起着关键作用，但由于其潜在的特异性和跨一系列分析平台工作的能力，它们特别适合于Kv通道的研究，抗体试剂本身可能作为药理工具来表征通道活性的潜力。然而，使用对靶抗原不具有必要特异性或尚未完全验证可用于预期应用（例如，免疫组织化学、免疫沉淀）的特征不佳的抗体，导致了相互矛盾的信息，有时是错误的信息。尽管我们最近记录了研究人员可以用来验证抗体试剂作为神经科学发现工具的步骤(罗德斯和特里默，2006年)，其中一些观点值得在这里重申。

具有预期疗效和特异性的抗体的产生和验证与药物发现过程有许多相似之处。该过程涉及选择特定免疫原（即用于免疫源动物以产生抗体的分子实体）。在后基因组时代，这些蛋白质通常由合成肽或重组蛋白片段组成，而不是亚细胞组分或从天然组织中纯化的蛋白质。免疫原的设计，无论是合成肽还是重组蛋白，都会极大地影响导致体液免疫反应产生的体内下游事件以及抗体产生细胞和抗体的特性，抗体试剂可用于靶向验证研究之前所需的后续筛选和纯化步骤。虽然免疫原的设计以MHC介导的抗原呈现的复杂性和其他免疫学考虑因素为指导，但首要考虑的是使用的序列是否可能产生针对目标的抗体。对于神经元离子通道亚单位，这可能是一个挑战，因为它们通常是高度相关多肽大家族的成员。目标是找到一个序列，该序列满足一般考虑，即其可能位于目标蛋白质三维结构的可溶剂进入表面上，而其他离子通道家族成员上不存在，如果可能，位于哺乳动物蛋白质组中的任何其他蛋白质上。对于pAb的生产，这通常可以通过合成肽来实现，其免疫原性和易合成性的最佳大小在15到22个氨基酸之间。鉴于生产肽大小的重组蛋白所需的小cDNA片段的实际困难，重组蛋白片段通常较大。较大的重组蛋白通常会产生更强健和多样的体液免疫反应，产生的抗体在许多应用中都能很好地发挥作用，但更难设计针对所选靶点的合成抗体的特异性，而不可能对相关家族成员产生交叉反应。如果在财政和技术上可行，那么同时采取这两种方法是有利的。

对制备单克隆抗体与单克隆抗体的决定也有类似的考虑。无论哪种抗体都是无价之宝，它们的劣质版本都可能会产生问题，甚至会产生令人难以置信的误导。也就是说，有许多因素可以决定一个预期项目是通过pAb还是mAb途径，尽管我们在研究中枢神经系统中的Kv通道时是同时启动这两种途径的，但这大大增加了最终目标的可能性，手头有可靠的试剂用于靶点验证。就考虑因素而言，pAbs存在于从免疫动物获得的抗血清中，通常需要在使用前从血清中纯化。这可能是获得单特异性pAb的一个重大障碍，而单特异性p Ab并不是单抗的一个因素。纯化pAbs的选择方法是针对免疫原的亲和纯化，因为这允许从存在的过量非特异性但生物化学相似的免疫球蛋白分子中分离代表血清中总免疫球蛋白的少数的特异性抗体。对于单克隆抗体，单克隆免疫球蛋白是制备中唯一或主要的免疫球蛋白，可以通过标准蛋白质生物化学程序（例如，硫酸铵沉淀、离子交换或体积排阻色谱）有效纯化。注意，这些步骤通常用作基于亲和力纯化pAbs的初步步骤。在针对重组蛋白免疫原培养的pAb的情况下，亲和纯化本身可能需要不止一个步骤，因为免疫原序列可能具有特定于所需靶点的片段，而其他片段则代表其他家族成员中保守的序列。两步亲和法可以选择性地富集前者，耗尽后者，并产生特定的抗体制剂。另一种方法是使用较大的重组片段进行免疫，使用较小的片段（重组或合成）代表异构体特异区域进行亲和纯化。虽然在为单克隆抗体项目选择免疫原时也涉及到类似的考虑因素，但在免疫原设计/选择方面有更大的灵活性，因为通过战略筛选进行下游选择可以识别和消除非靶向或交叉反应单克隆抗体。

在选择pAb与mAb项目时，另一个考虑因素是在pAb制剂中具有异质性单特异性抗体混合物的潜在优势。具有不同特征的各种单特异性抗体的存在可以产生单一的“通用”试剂，可用于各种免疫组织化学和生物化学程序。虽然可以获得通用mAb，但有许多mAb的实例，其效用仅限于应用的子集（甚至单个），例如用于免疫印迹或免疫沉淀但不用于免疫组织化学的mAb。在pAb制剂中抗体的异质性集合中，可能包括效用有限的抗体，但存在不同的储备可以覆盖所有预期应用。

获得通用单克隆抗体的有效策略是从大量（例如50–100）已被鉴定为与免疫原结合的阳性单克隆抗体开始，例如在ELISA分析中。这增加了该库中出现满足所有需求的单克隆抗体的可能性。产生大量阳性单克隆抗体通常反映了免疫程序的有效性。我们在≈200 mAb项目中的经验是，重组蛋白片段比合成肽产生更强大的免疫反应，这产生了更大的ELISA阳性克隆库，然后可以进入后续验证过程。这对于旨在获得天然组织中生物化学和免疫组织化学可靠单克隆抗体的项目尤为重要。虽然大多数ELISA阳性克隆在识别异源表达系统（例如转染细胞）中过度表达的目标蛋白方面表现良好，但在本地组织中表现出效力和单特异性的数量通常要低得多。在免疫细胞化学和免疫印迹分析中，有效的多步骤筛选策略利用转染细胞中靶蛋白的高水平表达与未转染细胞中低水平或无表达的优势，作为ELISA阳性克隆识别感兴趣的靶蛋白的初步证实。然而，在表达内源性靶点的相关天然组织中，没有什么可以替代严格和全面的检测，因为这是基于抗体的靶点验证的地方。

与转染细胞不同的是，转染细胞的表达可以由研究人员控制，特异性很容易通过比较转染细胞与未转染细胞来确认，在自然组织中验证特异性，尤其是那些具有哺乳动物大脑复杂性的组织中，可能会比较困难。正如我们之前回顾的那样(罗德斯和特里默，2006年)一种有效的方法是比较原位杂交分析得出的mRNA表达模式与抗体制备获得的免疫组织化学染色模式。这可以产生特定靶mRNA的细胞表达模式，用于验证抗体免疫反应的细胞特异性。当应用这种方法时，大脑面临着独特的挑战，因为轴突定位的蛋白质可以在远离含有mRNA的细胞体的位置找到，为了评估mRNA表达模式和免疫染色是否一致，需要了解大脑解剖和神经解剖的联系。最近，基因敲除和转基因动物，尤其是小鼠，已经成为验证天然组织中抗体特异性的一种宝贵工具。如果可用，通过生化和免疫组织化学方法比较敲除组织和野生型组织中的免疫反应性，可以得出关于给定抗体信号特异性的明确结论。此类分析的示例如所示图1，其中野生型和BK通道α亚单位（BKα）敲除小鼠的切片(Meredith等人，2004年)抗BKα染色（L6/60，红色；米索努等人，2006年)和抗Kv1.4（K13/31，绿色；Bekele-Arcuri等人，1996年)单克隆抗体。L6/60染色对海马体中BKα的特异性明显表现为敲除动物切片中缺乏明显的红色信号。图1还显示了使用L6/60对大鼠、敲除小鼠和野生型小鼠制备的粗脑膜进行的代表性免疫印迹染色。这样的实验可以为研究人员提供对天然组织中给定抗体特异性的高度信心。在其他应用中（例如免疫沉淀、免疫电子显微镜），可以使用类似的方法验证抗体特异性。使用siRNA的敲除方法可以提供类似的确认。我们意外发现，多亚单位离子通道复合体中一个亚单位的基因缺失导致复合体中其他亚单位的表达显著下调，这一意外发现突显了对无限制使用敲除动物组织验证抗体特异性的警告。对Kv4.2−/−小鼠脑切片的染色显示，Kv通道相互作用蛋白（KChIP）辅助亚单位的免疫反应性在与Kv4.2相关的区域显著降低，但与Kv4.3相关的区域没有显著降低(Menegola和Trimmer，2006年). 例如，在Kv4.2−/−小鼠的海马中，KChIP2在CA1神经元中显著下调，通常与Kv4.2相关。我们在Kv1.1敲除小鼠中没有发现这种作用(Wenzel等人，2007年). 一般来说，将敲除小鼠纳入抗体验证程序是证明特异性的决定性方法。然而，与药物发现过程的其他方面一样，仍然需要将其作为全面、系统、多管齐下的验证过程中的一个步骤（尽管很有必要）(罗德斯和特里默，2006年).

总之，这种抗体试剂生成和验证的系统方法可以为研究人员在药物发现中进行靶向验证提供坚实的基础。然而，现实情况是，药物发现工作往往由在这些方法方面没有经验和专门知识的团体进行，而建立这种专门知识并不被视为在时间、财政和人力资源方面的合理投资。在这种情况下，商业抗体公司提供了一种针对多种潜在药物靶点的有吸引力的抗体来源。这类公司可能有庞大的抗体目录（最近公布的一种针对31000个不同靶点的抗体！），因此很可能在商业领域存在针对您的预期药物发现靶点的一种抗体。此外，这些试剂可供最终用户使用，无需附加任何知识产权条件，而来自其他来源（例如学术实验室）的抗体可能并非如此。然而，与所有交易一样，“警告自负”一词也适用。虽然供应商有义务尽最大努力验证任何商业抗体，并向最终用户明确所进行的验证，期望抗体公司能够针对少量标准应用程序和制剂验证其产品是不合理的。这就是说，这些应该包括对本地组织中内源性表达靶点的特异性测定，而不是简单地对异源细胞中过度表达的外源性靶点进行检测。在这种情况下，专注于单一目标领域（例如神经科学）的公司可能比专注于更广泛领域的公司更能在特定组织类型或应用方面提供更广泛的验证。

个人最终用户应在多大程度上进行额外验证是一个需要大量讨论的问题。在支付商业抗体供应商典型的高价后，研究人员必须花费额外的资金和精力进行“质量控制”实验，而这些实验本应在抗体生成和验证期间以及分发之前进行，这是不合理的。这就是说，如果需要一种可靠的抗体来进行旨在评估长期药物发现计划目标的关键实验，其财务影响可能是巨大的。在随后的临床前（药理学、药物化学、药代动力学、药物代谢、细胞色素P450相互作用等）和临床（安全性、疗效等）药物发现过程中，对细节的同样关注和关注也适用于基于抗体的靶点验证。我们的观点是，拥有基于抗体的靶点验证方面的内部专业知识，包括生成可靠的抗体试剂，并在免疫组织化学和生物化学分析中有效使用靶离子通道亚单位的表达、定位和共结合，这是一项合理的投资，因为它是整个药物研发过程中至关重要的第一步，整个过程可能持续多年，耗资数百万美元。

这种涉及CNS离子通道药物靶点的方法的一个例子来自我们对Kv通道的研究。手头有经过验证的抗体试剂(Bekele-Arcuri等人，1996年)，我们首先进行了一系列广泛的免疫组织化学研究，旨在将单个Kv通道亚单位定位于哺乳动物大脑中的特定细胞类型和神经解剖回路，目的是为我们的药物发现计划选择特定的通道类型/复合体。最初，我们将注意力集中在Kv1通道亚基上，主要是因为选择性药理学工具（如树状毒素）已经可以用于研究这个离子通道家族。药理证据表明，应用α-树突毒素阻断海马薄片中的Kv1通道有助于动作电位的传播和神经递质的释放(哈里维尔等人，1986年). 这些观察结果表明，Kv1通道的选择性阻断剂可能在以动作电位传播受损为特征的疾病（如多发性硬化症）或神经递质释放减少（如阿尔茨海默病）中有治疗应用。然而，我们也对Kv1通道感兴趣，因为有证据表明，通过单个亚基的遗传突变/缺失，这些亚基的活性显著降低(Smart等人，1998年)或应用高浓度毒素，诱发癫痫发作(Bagetta等人，1992年). 后一结果表明，Kv1通道的“开放剂”或激活剂可能作为抗癫痫药或甚至抗焦虑药有用。然而，在这项工作开始时，我们不知道哪些对树突毒素敏感的Kv1通道是靶向的，或者哪些神经递质系统可能通过其调节而受到影响。

在产生Kv1α和Kvβ亚单位的亚单位特异性抗体后，我们能够使用单标签和多标签免疫组织化学方法来确定这些亚单位主要位于轴突，它们集中在Ranvier的节点和中枢神经系统内谷氨酸能和γ-氨基丁酸能通路的终末前轴突节段和轴突终末(Rhodes等人，1995年,1996,1997). 在这些位置，Kv1通道被精确定位以调节动作电位的传播和神经递质的释放。通过采用免疫组织化学、免疫沉淀和选择性神经毒素损伤相结合的策略，我们证明含有Kv1.1、Kv1.2、Kv1.6和Kvβ2的通道集中在Ranvier的淋巴结处，也存在于无髓鞘轴突和许多脑区的轴突终末。在海马结构中，含有Kv1.1、1.2、Kv1.4和Kvβ1亚基的通道集中在轴突上和穿孔通路、苔藓纤维通路和Schaffer侧支通路的终末区，它们可能调节三突触海马回路中的谷氨酸能传递(Monaghan等人，2001年). 在采用联合免疫沉淀相关通道亚基的生化分析和随后的免疫印迹分析中，我们确定在Kv1α和Kvβ亚基免疫组织化学染色重叠的部位，单个亚基与异多聚通道复合体联合(Rhodes等人，1995年,1996,1997). 尽管这些和其他研究提供了证据证明Kv1通道复合体中Kv1α和Kvβ亚基的1:1关联（例如，通道是α₄β₄这些研究不允许测定通道复合体中单个Kv1α或Kvβ亚基的精确化学计量比。然而，通过比较单个Kv1亚单位在体内的分布和协同作用，以及检测异种细胞中单个亚单位共表达产生的电流的电生理研究结果，我们预测在没有Kv1.4或Kvβ1的情况下，Kv1.1/Kv1.2/Kvβ2亚单位形成的电流，具有延迟整流表型，对包括α-树突毒素在内的肽毒素高度敏感(Trimmer和Rhodes，2004年). 这些通道复合体是通道阻滞剂的有趣靶点，其目的是促进动作电位的传导和神经递质的释放。除其他Kv1-家族α亚单位外，含有Kv1.4和/或Kvβ1的通道对α-树突毒素的敏感性较低，并且具有快速失活的表型。基于兴奋性边缘回路中的高密度，我们推断这些通道的激活物或“开放物”可能会抑制这些通路中的兴奋性，因此在治疗癫痫或焦虑症方面具有潜在的治疗效用。尽管对随后的药物发现策略和结果的全面讨论远远超出了这一观点的范围，但通过在异源细胞（CHO细胞系，爪蟾卵母细胞或酵母），我们能够筛选Kv1通道的小分子调节剂，并成功识别延迟整流型Kv1渠道的阻断剂，以及减缓Kvβ1所赋予失活的化合物(Zhang等人，2004年). 后一类化合物被称为“去激活剂”，显示出有趣的体内药理特性，在啮齿类动物癫痫发作模型中具有抗癫痫活性，在啮齿动物行为冲突模型中具有焦虑活性(Zhang等人，2004年).

在我们实验室的后续研究中，我们采用了类似的方法，但这次的重点是Kv4通道。在我们开始这些研究时，很明显Kv4通道在调节中枢神经系统树突状兴奋性方面起着重要作用，Kv4通路活性的非选择性抑制剂调节海马结构和新皮质内的突触强度(霍夫曼等人，1997年). 我们预测，这些通道的调节剂（抑制剂）可能促进长期突触增强，并为治疗阿尔茨海默病和其他以年龄相关认知障碍为特征的疾病提供新的治疗方法。然而，在我们开始这项工作时，天然Kv4通道的亚细胞分布和亚单位组成还没有很好地确定。使用类似于上述Kv1通道的方法，我们生成了Kv4α亚单位的亚单位特异性抗体，并鉴定和表征了Kv3通道家族的一个附属“β”亚单位家族（KChIPs）(An等人，2000年). 使用相同的免疫组织化学、共免疫沉淀和选择性神经毒素损伤组合，我们确定Kv4.2亚单位集中在许多神经元类型的体脂蛋白结构域，在海马和新皮质锥体细胞的树突顶树突中发现，以及在纹状体投射神经元和小脑颗粒细胞的树突中(Rhodes等人，2004年;Strassle等人，2005年). 在这些位置，Kv4.2主要与KChIP2和/或KChIP3联合。虽然Kv4.3也集中在中枢神经元的体棘区，但其分布仅与Kv4.2部分重叠。相反，Kv4.3免疫反应集中在特定人群的皮层和海马锥体细胞的树突顶乔木，以及皮层、海马和纹状体中间神经元的树突乔木，在那里它与KChIP1共定位和共结合(Rhodes等人，2004年). 由于与开发亚单位特异性Kv通道阻滞剂相关的挑战以及相对缺乏评估Kv4通道的选择性药理学工具，我们寻求一种策略来调节KChIP对Kv4电流的影响。由于KChIP通过增加表面表达、减缓失活和减慢失活恢复速度来增强Kv4通道活性，我们推断KChIP调节剂将有效阻止或抑制Kv4渠道活性。虽然筛选蛋白质与蛋白质相互作用的小分子抑制剂具有挑战性，但该项目导致识别与KChIP1结合并调节其对Kv4通道活性影响的分子(Bowlby等人，2005年). 这些分子的治疗潜力仍在研究中。

总的来说，高质量抗体试剂的可用性和使用为药物发现中的目标验证过程增加了巨大的价值。对于大脑中的多亚单位异聚离子通道靶点，这些试剂是靶点选择、表征和验证过程中不可或缺的工具。多年来，我们对亚单位或亚型特异性通道调节剂的治疗潜力做出了许多假设，这些假设基于免疫组织化学和共免疫沉淀确定的靶亚单位的解剖定位和亚单位共结合，通过筛选和随后的表征鉴定出的药理学工具产生了。基于解剖和免疫学方法的有力结合，这一目标识别和验证过程树立了一个范例，在学术和工业药物发现环境中具有广泛的应用。这些方法在人脑组织样本研究中的进一步应用将有助于开发离子通道药物发现中更有效的翻译策略。

我们感谢我们的前任和现任同事为本文所述工作做出的众多贡献，该工作由美国国立卫生研究院拨款NS34383和NS42225（给J.S.Trimmer）以及惠氏研究公司资助。