TOX3是一种神经元生存因子，它依赖于转录活性复合物中CITED1或磷酸化CREB的存在而诱导转录

TOX3，也称为TNRC9（三核苷酸重复序列9），首次在含有三核苷酸（CAG）重复扩增的转录物的筛选中发现(Margolis等人，1997年). 许多神经退行性疾病都是由翻译的CAG重复序列的扩增引起的，许多涉及的蛋白质在转录调控中起作用(莱利和奥尔，2006年)TOX3也是如此，因为它包含一个核定位信号（NLS）和一个高迁移率基团（HMG）盒域，然后是一个C末端聚谷氨酰胺拉伸。HMG-box蛋白可以通过弯曲和解开DNA来修改染色质结构，这主要是通过HMG-box和小沟的接触介导的。这可能允许其他转录调控因子与DNA同时结合。HMG-box蛋白可分为以序列依赖或序列依赖方式识别DNA的亚家族，以前的生物信息学分析表明，TOX是参与T细胞分化的TOX3的密切同源物，是一种序列依赖的HMG-box DNA结合蛋白(O'Flaherty和Kaye，2003年). 最近，TOX3被鉴定为一种新的钙²⁺-依赖性神经元转录因子，它有助于钙²⁺-诱导活化c-fos公司与由cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和CBP（CREB-结合蛋白）组成的转录活性复合物直接相互作用表达(袁等，2009). 关于TOX3的进一步数据很少，但已知其5′端附近的单核苷酸多态性似乎与乳腺癌易感性密切相关(Easton等人，2007年；Huijts等人，2007年；Stacey等人，2007年).

我们最近发现，TOX3与CITED1（对于“CBP/p300与富含谷氨酸和天冬氨酸的C末端结构域1相互作用的反式激活剂”）在过表达组成型活性孤儿G蛋白偶联受体GPR39的人胚胎肾HEK-293细胞中协同表达(Dittmer等人，2008年). GPR39过表达通过诱导血清反应元件（SRE）介导的转录来保护机体免受多种细胞应激源的影响(Dittmer等人，2008年). CITED1是一种转录调节因子，它本身缺乏DNA结合特性，但可以增强由多种转录因子（如雌激素受体）介导的转录(Yahata等人，2001年)、SMAD(Shioda等人，1998年)或早期生长反应（EGR）2（也称为Krox20）(Dillon等人，2007年). CITED1在大脑中的作用尚不清楚，但其表达与雌激素受体ERα和ERβ类似(郭士纳和兰德里，2007年).

在本研究中，我们研究了TOX3在人体组织中的表达，TOX3和CITED1对细胞死亡的影响，以及这是否包括转录激活以及如何包括转录激活。

TOX3包含三个可分离的结构域：带有NLS的N末端结构域、HMG盒和C末端聚谷氨酰胺延伸(图1A). TOX3尚未被广泛表征；因此，我们首先使用定量实时PCR研究了其在多种人类原代细胞系和正常组织中的表达。在正常人体组织中，TOX3的表达在中枢神经系统（CNS）、回肠以及额叶和枕叶的大脑中最为显著(图1B). 在原始人类细胞系中，TOX3主要在上皮细胞中表达，但在内皮细胞或间充质细胞系中不表达(补充材料图S1A). 我们的结论是，尽管最近发表了TOX3在乳腺癌易感性中的作用及其在五分之三已确定的乳腺癌亚型中的表达(Nordgard等人，2007年)TOX3在正常乳腺组织中不表达（即在原代细胞系或成人组织中不表示）。相反，我们的结果表明TOX3在大脑中起作用，这与最近的报告一致，即TOX3是一种钙²⁺-依赖性神经元转录因子(袁等，2009).

当我们发现TOX3与HEK-293细胞中稳定过度表达组成活性受体GPR39的细胞保护信号转导级联下游的CITED1协同诱导时，我们对TOX3产生了兴趣(Dittmer等人，2008年). 我们的目的是在神经元细胞的蛋白质水平上复制这种诱导，并在Neuro2a细胞（表达TOX3，参见补充材料图S1B)24小时后，使用抗TOX3和抗CITED1抗血清对细胞裂解物进行免疫印迹。虽然这两种蛋白的基础表达都很低，但GPR39的过度表达明显诱导了TOX3和CITED1蛋白的表达(图2A).

基于TOX3和CITED1在转录调控及其协同表达中的功能，我们假设TOX3与CITED1.可能相互作用，协同诱导细胞保护性转录物的表达，从而介导GPR39的保护作用。我们将编码Myc–TOX3和血凝素（HA）–CITED1或类似HA标记的控制蛋白（前凋亡蛋白Puma的非功能突变体，也称为BCL-2结合成分3）的载体转染到中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中，并评估这两种蛋白是否可以共同免疫沉淀。用抗Myc抗体进行免疫沉淀，然后进行抗HA抗体免疫印迹，结果表明这两种蛋白确实位于同一复合物中。反向实验、抗HA抗体的免疫沉淀和抗Myc抗体的免疫印迹得到了相同的结果(图2B). 过度表达的TOX3迁移较慢，可能是由于Myc标签；预测的质量约为65kDa，如天然TOX3所示(图2A). 去除天然TOX3不成功，可能是因为这些细胞中的TOX3含量低，抗TOX3抗血清的敏感性很低。然而，当我们用Myc–TOX3转染神经元Neuro2a细胞时，我们能够共同免疫沉淀内源性CITED1(图2C). 为了重现这种相互作用，为了研究TOX3的同二聚体化，并测试相互作用的强度，我们在TOX3 N末端用雷尼利亚荧光素酶，并使用IgG包被的磁珠拉下蛋白A标记的CITED1和TOX3。这项被称为LUMIER（用于“基于发光的哺乳动物相互作用组映射”）的测试，适用于自动化和无偏见的相互作用研究(Barrios-Rodiles等人，2005年)并确认TOX3与CITED1和自身的绑定z（z）CITED1的得分为1.39，与平均值不同的标准偏差为1.75n个=80个对照蛋白(图2D). 总之，这些实验表明，这两种蛋白质不仅是协同调节的，而且也存在于复合物中。由于同源蛋白CITED2、CITED3和CITED4不能与TOX3共同免疫沉淀，因此这种相互作用对CITED1是特异的(补充材料图S2). 这一点以及有可能降低内源性CITED1的事实强烈表明，由过度表达引起的巧合相互作用是不可能的。

然后，我们使用缺少SMAD4相互作用域（ΔSID，氨基酸30-60）或酸性C末端反式激活域（△CR2）的CITED1突变体(Shioda等人，1998年)用于用全长TOX3进行免疫沉淀以固定相互作用结构域。TOX3与全长CITED1和ΔSID突变体一起沉淀，但仅与ΔCR2突变体弱沉淀(图2E). 使用TOX3突变体进行的反向实验表明，CITED1仅与含有HMG结构域的突变体结合，其中，最显著地绑定到也包含N末端的结构(图2F). 因此，我们得出结论，TOX3和CITED1存在于蛋白质复合体中，通过TOX3的HMG结构域和CITED1的CR2结构域连接，并且这种相互作用通过TOX3N末端或与N末端结合的蛋白质增强。

接下来，我们研究了TOX3、CITED1或这两种蛋白对两种不同应激刺激引起的细胞死亡的影响。衣霉素抑制所有N-连接糖蛋白的合成，并通过内质网应激导致细胞死亡。相反，促凋亡蛋白BAX的过度表达导致细胞色素的释放c（c）线粒体和caspase级联的直接激活。GPR39位于TOX3和CITED1的上游，可以抵御这两种压力源(Dittmer等人，2008年). 通过对早期和晚期凋亡细胞[膜联蛋白V和7-氨基放线菌素D（7-AAD）双阳性细胞]进行门控，流式细胞术定量细胞死亡。这两种蛋白质都能防止细胞死亡；TOX3似乎对膜霉素更有效（TOX3提供了约16.5%的保护，而CITED1提供了约14.1%的保护），而CITED1被证明对BAX诱导的细胞死亡更有效（TOX3提供了约14.2%的保护，而CITED1提供了约19.9%的保护）。TOX3和CITED1的共表达一起增加了任一种对BAX-和膜霉素介导的细胞死亡的保护作用（对膜霉素的约28.6%和对BAX-的约27.7%，图3A). 这种作用与我们用作阳性对照的抗凋亡蛋白BCL-2所赋予的保护作用具有相似的程度。

为了在转录水平上证实这些发现，我们随后在Neuro2a细胞中瞬时过度表达TOX3 24小时，并检测了几种抗凋亡药物（Xiap、Mcl-1、BCL-2L12、BCL-XL和BCL-2）和促凋亡药物（Puma、Diablo、几种caspase、Bok、Bnip31、Bnip 3、Bim、Bid、BAX、Bak、Bad和Apaf1）的表达水平转录本使用定量实时PCR。与TOX3的促生存作用一致，过度表达主要诱导抗凋亡转录物的表达（除Xiap外），并抑制促凋亡转录物（除Diablo外）的表达(图3B).

作为DNA相互作用蛋白，我们假设TOX3和CITED1可能介导GPR39在Neuro2a细胞中过度表达引起的SRE介导的转录激活(Dittmer等人，2008年). 我们还研究了cAMP反应元件（CRE）的激活，因为TOX3与CREB和CBP相互作用(袁等，2009). 作为第三种可能性，我们研究了雌激素反应元件（ERE）依赖性转录的激活，因为CITED1与ERα结合(Yahata等人，2001年)这两种蛋白质都在大脑的类似区域表达(郭士纳和兰德里，2007年). 我们使用荧光素酶报告基因构建物在Neuro2a细胞中过度表达TOX3、CITED1或这两种蛋白，以实现SRE、CRE和ERE依赖性转录。在这些细胞中，TOX3仅增加ERE依赖性转录，具有约3.5倍的统计学显著效应。我们观察到对SRE和CRE依赖性转录没有影响，尽管所有这些实验都是并行进行的，并且转染效率得到了控制。TOX3和CITED1的结合导致ERE依赖性转录的统计显著增加约15倍，但对SRE或CRE依赖性的转录没有影响(图4A). 为了评估内源性TOX3对ERE基础转录活性的贡献，我们随后使用了三个针对TOX3不同区域的小发夹RNA（shRNA）构建物。所有三种结构都能有效抑制内源性TOX3蛋白的表达(图4B)和mRNA(补充材料图S3). 当与ERE报告质粒共同转染到Neuro2a细胞时，所有TOX3 shRNA构建物，而非对照shRNA，显著降低了该启动子的基础转录活性(图4C).

为了证明TOX3在雌激素应答启动子上的转录活性，我们随后使用了三种雌激素应答结构，这三种结构以前用于研究CITED1介导的雌激素应答转录诱导(Yahata等人，2001年). 即，ERE-tk在单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk）启动子ERE-E1B前含有一个单一ERE，其中三个ERE后接腺病毒E1B TATA盒，一个报告子由一个ERE和编码β-珠蛋白基因的启动子组成。我们还使用了补体3（C3）的内源性启动子，它以前被用作研究雌激素依赖性转录的工具(Fan等人，1996年；Yoon等人，2000年). 我们用这四个启动子瞬时转染TOX3或空载体，以驱动萤火虫荧光素酶编码基因和雷尼利亚荧光素酶控制构建到Neuro2a细胞中，并通过双重荧光素酶分析量化转录激活。TOX3显著诱导所有四个启动子的转录；β-珠蛋白、胸苷激酶和E1B启动子被诱导了两倍，C3启动子被激活了八倍(图4D). 与ERE报告人的结果类似，转染靶向TOX3的shRNA结构有效地降低了C3启动子的基础转录活性(图4E)证明内源性TOX3对C3-马达依赖性转录的贡献。然后我们对C3启动子中的ERE元件进行突变，以证明TOX3诱导的特异性。具体来说，先前确定的C3启动子的ERE元件发生突变(Fan等人，1996年)，从−235到−223，GGTGcccTGACC到GGTGCCcTtACt，从−149到−137，GGACATGTCC到tGAtTagtGGCt（小写代表介入的非绑定序列）。这些突变确实显著减弱了TOX3的诱导作用，而我们用作阳性对照的ERα诱导作用几乎被取消(图4E，右侧面板）。这些观察结果表明，内源性TOX3对神经元细胞补体C3的表达起着重要作用。结合ERE报告人的结果，我们得出结论，这种诱导部分是通过C3启动子中的ERE元件介导的。

为了显示TOX3与C3启动子区的结合，我们对转染Myc-tagged TOX3或空Myc载体的HEK-293细胞进行了染色质免疫沉淀（ChIP）检测。染色质与抗Myc抗体或作为对照的抗IgG抗体孵育。免疫沉淀后，C3启动子的两个区域和一个参考序列被实时PCR扩增和定量，这表明扩增起始于-10的区域（相对于转录起始点）的引物相对富集了6.8倍于IgG对照以及12.5倍富集引物，用于扩增起始于−500的区域(图4F). 这表明TOX3与基因组C3启动子区结合。

为了研究TOX3和CITED1的作用是否可以被抗雌激素药物抑制，我们用编码促凋亡蛋白BAX和空载体的载体，或TOX3加CITED1瞬时转染Neuro2a细胞，并用抗雌激素富尔维斯特（ICI-182780）处理一半的细胞另一半只带车辆。然后，我们通过流式细胞术对早期和晚期凋亡细胞（膜联蛋白V和7-AAD双阳性）进行门控，从而量化死亡细胞的数量。尽管TOX3和CITED1的组合再次对这种损伤具有保护作用，但我们没有观察到氟维司琼的统计学显著作用(图5A)，在我们的模型系统中是有效的，因为它抑制了ERα过表达Neuro2a细胞中ERE报告子和C3启动子的转录激活(图5B). 与上述细胞死亡的结果类似，我们也观察到fulvestrant对TOX3介导的ERE依赖性转录增加或C3启动子的诱导没有影响(图5C). 共同转染CITED1引起的ERE依赖性转录的增加似乎略有减弱，但这在统计学上并不显著(图5C). 因此，我们得出结论，TOX3对ERE介导的转录的影响是配体和/或受体无关的。

上述结果表明TOX3与CITED1相互作用(图2)此外，已知CITED1与ERα相互作用(Yahata等人，2001年). 我们还发现TOX3增加了雌激素应答启动子的转录，并与雌激素应答人类C3启动子相互作用(图4). 因此，我们旨在研究TOX3是否存在于带有ER受体的复合物中，以及这种复合物是否介导ERE依赖性转录的诱导，尽管fulvestrant处理的细胞获得了这些结果。然而，在TOX3反应的Neuro2a细胞中，免疫印迹法无法检测到已知的雌激素受体ERα和ERβ(补充材料图S4). 因此，我们转向已发表的与CREB的相互作用，并研究了TOX3与CREB或转录活性较低的S133A突变体的相互作用（有关综述，请参阅Johannessen等人，2004年)在S133被Ca磷酸化后抑制CBP与CREB的结合²⁺/钙调素依赖性蛋白激酶(Lee等人，1995年). 我们将编码Myc–TOX3的载体与CREB或S133A-CREB共同转染到CHO细胞中。用抗Myc抗体进行免疫沉淀，然后用抗CREB抗体进行免疫印迹，结果表明TOX3和CREB确实处于同一复合物中，而S133A突变体没有与TOX3相互作用，甚至降低了与天然CREB的结合，表明该突变体在TOX3功能上具有显性负功能(图6A注意，与空载体对照相比，S133A突变体存在时天然CREB免疫沉淀量减少）。从这些实验中，我们得出结论，TOX3与磷酸化CREB相互作用。

为了研究与磷酸化CREB的相互作用是否通过TOX3介导内源性雌激素反应C3启动子的转录诱导，我们将TOX3与CREB（或非相互作用和无功能的S133A或ACREB突变体）联合转染并使用荧光素酶分析定量C3启动子的转录激活。野生型（wt）对照和两个CREB突变体完全消除了TOX3的显著作用，表明TOX3诱导C3启动子不依赖于其与磷酸化CREB的相互作用，甚至被这些蛋白抑制(图6B). 然后，我们使用Bcl-2型启动子，（1）可由TOX3过度表达诱导(图3B和图6C)，（2）CREB响应(Wilson等人，1996年)（3）可能参与TOX3对细胞存活的积极作用。我们将TOX3单独或与CREB、S133A-CREB或CITED1联合转染到Neuro2a细胞中，并量化来自细胞的转录激活BCL-2型启动子使用荧光素酶分析。TOX3确实从该启动子诱导转录约12倍。CREB的联合转染甚至使其增加了两倍，但TOX3和S133A-CREB联合转染没有诱导转录，这表明磷酸化CREB介导的作用符合联合免疫沉淀研究，其中S133A-CREB减弱了TOX3与内源性CREB结合(图6A). 更为显著的是联合转染的CITED1的作用，它完全消除了TOX3对CREB介导转录的转录作用BCL-2型发起人(图6D). 这些结果表明TOX3可以介导细胞保护性转录BCL-2型启动子或补体C3启动子，这取决于磷酸化CREB或CITED1在转录活性复合物中的优势。

我们的结果提出了一个模型，即TOX3与磷酸化CREB或CITED1组装转录活性复合物，以增加不同启动子的转录（见图6E). CBP可能也参与了这种复合物，因为它可以与CITED1结合(Yahata等人，2001年)和/或至TOX3的C端(袁等，2009). 我们观察到，TOX3对细胞存活和ERE依赖性转录激活的影响不能被抗雌激素富尔维斯坦抑制，这导致蛋白酶体降解受体并抑制配体结合。这一点，再加上Neuro2a细胞只含有微量的两种经典雌激素受体，表明这些细胞中TOX3的活性与受体无关。值得注意的是，我们观察到与CHO细胞中过度表达的ERα有微弱的相互作用，这在MCF7细胞中无法与天然ERα复制。此外，C3启动子中ER元件的突变减弱但没有消除TOX3的转录激活。TOX3可能与其他雌激素受体α样蛋白相互作用，如雌激素相关受体（ERR）α或ERRγ，这些蛋白与雌激素受体高度相似，但与配体无关(谢等人，1999年)在DNA序列识别要求方面更加混乱(Razzaque等人，2004年). 或者，TOX3可以以序列依赖的方式直接与DNA相互作用，如其他HMG-box域转录因子所示(O'Flaherty和Kaye，2003年).

我们应该强调的是，尽管我们的实验支持TOX3与CREB或CITED1的关联，但我们还不知道相互作用是否是直接的。这方面的最终解决方案需要纯化内源性复合物，以及用纯化的蛋白质进行结合测定。

雌激素依赖性转录先前被证明可以保护多种神经元细胞免受同样多种压力源的影响（综述见贝尔，2002年). 事实上，CITED1的共表达消除了TOX3对CREB依赖性转录的影响BCL-2型启动子，但增加了TOX3对内质网应激或caspase级联的直接激活的保护作用，这表明TOX3的保护活性可能通过诱导激素依赖性ERE依赖性转录介导，而较少通过诱导CREB介导的转录介导在这些细胞中。然而，由于我们只研究了一个CREB依赖性启动子，我们不能排除其他CREB依存性神经保护蛋白的诱导，因为CREB与雌激素类似，在细胞生存中具有众所周知的功能，并诱导多种保护蛋白（有关综述，请参阅沃尔顿和德拉古诺，2000年).

TOX3的激素依赖性生存功能最受关注，因为最近有文献证明TOX3在乳腺癌易感性中的作用(Easton等人，2007年)尤其是CITED1也与乳腺癌有关。在人类乳腺癌样本中，CITED1的表达与ERα的表达相似(McBryan等人，2007年). 因此，蛋白TOX3和CITED1似乎与乳腺癌和雌激素依赖性信号转导有关。很容易想到，TOX3由于提高了癌细胞的存活率而带来风险。然而，这需要在乳腺癌细胞和模型中进行更详细的研究，这超出了本研究的范围。

我们得出结论，TOX3是一种核蛋白，含有C末端聚谷氨酰胺延伸，主要在大脑中表达，并通过诱导来自不同细胞保护启动子的转录来保护细胞免受死亡，这取决于转录活性复合物中存在的辅因子。考虑到大量神经退行性疾病是由聚谷氨酰胺延伸的扩张引起的，这导致了随后对转录控制的修补，因此这是最令人感兴趣的。

Neuro2a和COS7细胞保存在补充有10%胎牛血清（FCS）、100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（PAA实验室）中，CHO细胞保存在DMEM中，DMEM补充有L-谷氨酰胺、10%FCS、100 IU/ml青素和100μ/ml链霉素。人类CITED1-4在pRC/CMV、pHA-CITED1-ΔCR2、pHA-CITED1-△SID、pGERE-Luc、pERE-tk-Luc、3×ERE-E1B-TATA-Luc中的表达已在前面进行了描述(Shioda等人，1998年；Yahata等人，2001年). 通过PCR产生Myc标记的全长大鼠TOX3和TOX3缺失突变体，并克隆到pBOS主干中。带有HA标签的人类美洲狮在pcDNA3中缺乏其细胞死亡域，这是Andreas Villunger（奥地利因斯布鲁克医科大学生物中心）送给它的一份礼物。pcDNA3中的BAX–EGFP（增强型绿色荧光蛋白）是Pawel Kermer（德国哥廷根大学）的礼物，pcDNA3中的CREB和S133A-CREB是Ugo Moens（挪威特罗姆瑟大学）的一份礼物，pCAGGS中的ACREB是Hermann Rohrer（德国法兰克福MPI Hirnforschung）的礼物。SRE-Luc和CRE-Luc报告结构购自Clontech，ERE-Luc（Addgene质粒编号11354）、C3-Luc（Addgene质粒11358）、，Bcl-2型-启动子–荧光素酶（Addgene质粒编号15381）和VP16–ERα（Addgene-plasmid编号11351）来自Addgene。pGFP-V-RS中针对TOX3的HuSH-shRNA构建物来自Origene。由Mr.Gene合成C3突变启动子，并通过内部限制位点克隆到原始C3质粒平均II和巴姆你好。Tunicamycin购自Calbiochem，ICI-182780购自Tocris。

使用Nucleobond AX 500柱（Machery&Nagel）制备高纯度质粒。对于瞬时转染，细胞生长到80%–90%的汇合处，并用Lipofectamine 2000（Invitrogen）或Attractene（Qiagen）转染。

对于LUMIER测定，蛋白质在HEK-293细胞中瞬时表达为与金黄色葡萄球菌蛋白质A标签或动物海肾萤光素酶与所指示的末端融合。使用0.05μl Lipofectamine 2000（Invitrogen）将每个表达构建物共20 ng转染到10000个HEK293细胞中。40小时后，取出培养基，并在10μl冰冷裂解缓冲液中将细胞溶解在冰上[20 mM Tris-HCl，pH 7.5，250 mM NaCl，1%Triton X-100，10 mM EDTA，10 mM-二硫苏糖醇（DTT），蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche），磷酸酶抑制剂鸡尾液（罗氏），100单位/μl苯甲酸酶（最终浓度）（Novagen）]含有羊抗（兔IgG）涂层磁珠（Invitrogen；Dynabeads M280，最终浓度2 mg/ml）。然后将裂解液在冰上培养15分钟。接下来，在每个孔中添加100μl洗涤缓冲液（PBS和1 mM DTT），并在洗涤之前去除10%的稀释裂解液以测定每个样品中存在的荧光素酶活性。其余样品在Tecan Hydroflex洗板机的洗涤缓冲液中洗涤六次。测定裂解液和洗涤珠中的荧光素酶活性。阴性对照组转染表达各自荧光素酶融合蛋白的质粒和表达蛋白a二聚体而非蛋白a融合蛋白的载体。对于每个样品，测量了四个值：洗涤（输入）前10%样品中的荧光素酶，洗涤（绑定）后珠子上的荧光素酶活性，以及阴性对照（输入nc和绑定nc）的相同值。归一化交互信号的计算如下：log（bound）/log（input）–log（bind-nc）/log（input nc）。标准化交互信号为z（z）-通过减去平均值并除以标准偏差进行转换。平均值和标准偏差是从预期不会相互作用的蛋白质对的大数据集（即从阴性参考集）中计算出来的。

TOX3（TOX3）在7900 HT序列检测系统（Applied Biosystems）上，使用TaqMan实时PCR检测定量人体组织中的mRNA水平以及促凋亡和抗凋亡转录物的调节。用随机六聚体引物启动第一链cDNA合成。人类TOX3引物为5′-ATACAGGGCCAGCCTGTT-3′和5′-TCTGCTGGAACAGAGAGAGATG-3′，以及6-羧基荧光素（FAM）或6-羧基四甲基罗丹明（TAMR）标记探针5′-TGCTGGAGTCAGCACAGACGCACGAC-3′。对于鼠标TOX3（TOX3）以及促凋亡和抗凋亡转录物，我们使用来自Universal Probe Library（Roche）的探针和根据补充材料表S1cDNA标准化为看家基因次黄嘌呤磷酸核糖转移酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达水平(GAPDH公司)和β-肌动蛋白。使用规范化表达值计算相对表达。用5′-TCCTGTTGCCTAACTTGC-3′和5′-GGTGCTGGGACAGAAACGT-3′从Neuro2a细胞中扩增ERα，产生191 bp（1398–1571）的小鼠ERαmRNA外显子跨度产物。

总细胞裂解物或洗脱液在8–16%聚丙烯酰胺凝胶（Thermo Scientific）上分离，转移到硝化纤维素膜（Invitrogen）上，并在室温下在3%非脂肪奶粉中封闭1小时，然后与初级仓鼠多克隆抗BCL-2抗体（BD Bioscience，1:1000）孵育过夜，小鼠单克隆抗Myc抗体（克隆4A6，Upstate，1:1000）、兔多克隆抗HA抗血清（Abcam，1:4000）、兔多克隆抗VP16抗体（Abcan，1:2000）、家兔多克隆抗CITED1抗体（I51904K，1:500）(Shi等人，2006年)，兔多克隆抗TOX3抗体（1:1000）(袁等，2009)、兔单克隆抗β-肌动蛋白抗体（Millipore，1:5000）、小鼠单克隆抗GAPDH（Cell Signaling，1:5000或抗（兔IgG）二级抗体（Fc），视情况而定，与红外荧光荧光团结合（Licor，1:30000）。使用奥德赛系统（Licor）在680或800 nm处对膜进行红外荧光扫描。根据制造商的说明，使用ProFound HA或Myc标签IP/Co-IP试剂盒（Pierce）进行共免疫沉淀。简言之，用所示结构转染CHO、COS7或Neuro2A细胞，48小时后在含有蛋白酶抑制剂的M-PER哺乳动物蛋白提取试剂（每10-cm直径板1000μl）中溶解。将总共200μl的裂解物（总蛋白约500μg）与10μl抗HA（或抗Myc）琼脂糖浆液在4℃孵育过夜，用40μl非还原性样品缓冲液洗脱，然后用SDS-PAGE分离20μl每个样品，转移到硝化纤维素膜上，并用上述抗体进行探测。

根据制造商的方案，使用SimpleCHIP酶促染色质IP试剂盒（细胞信号传导）进行染色质沉淀。简而言之，10⁷用载体或Myc标记的TOX3转染的HEK-293细胞通过与1%多聚甲醛（PFA）孵育10分钟交联并裂解。通过与微藻核酸酶孵育来消化核部分中的染色质，通过超声处理来破坏核膜，并清除混合物。为了测定染色质浓度，将15μg染色质与抗Myc抗体、IgG或抗（组蛋白H3）抗体在4°C下孵育过夜，然后与蛋白g–琼脂糖珠孵育2小时。染色质洗脱、反向交联并用蛋白酶K消化。纯化后，用核糖体蛋白L30的引物作为对照，用两对识别C3启动子区的引物对样品进行实时定量PCR分析。引物和探针的详细信息见补充材料表S1.

为了通过流式细胞仪进行细胞死亡分析，将Neuro2a细胞置于24孔板中，并转染0.4μg BAX–EGFP和指示的构建物。24小时后，将细胞重新悬浮在100μl的膜联蛋白V结合缓冲液（BD-Pharmingen）中，并用5μl的壁联蛋白V–PE（藻红蛋白）（BD-Parmineng）和5μl 7-AAD进行染色。单个EGFP阳性细胞在488nm处进行门控，并分析annexin V和7-AAD染色。数据通过FACSCalibur流式细胞仪获得，并使用Cell Star软件（Becton Dickinson）进行量化。为了分析衣霉素介导的细胞死亡，在24小时后添加5μg/ml衣霉素，24小时后评估细胞死亡。

将Neuro2a细胞瞬时转染到一个带有指示荧光素酶报告质粒（SRE–雷尼利亚或EGFP控制质粒，以及指示的表达结构。转染24小时后，将细胞清洗并溶解在200μl被动裂解缓冲液（Promocell）中，将裂解液离心至12000克1分钟后，将20μl上清液转移到96 well的白色微量滴定板上。然后，在测量之前，将100μl荧光素酶检测缓冲液（Promocell）直接注入每个孔中。使用Genios Pro微孔板阅读器（Tecan）测量发光度并积分10.000 ms。通过EGFP荧光或双荧光素酶分析进行归一化；将20μl裂解液转移到第二个白色微量滴定板上，并将40μl雷尼利亚向微孔中添加分析增强剂溶液。然后将适当的分析缓冲液中的科伦特嗪（Promocell）注入孔中，并如上所述测量发光。

数据汇总为平均值±标准偏差，并使用双尾Student’st吨-如图所示，使用Tukey或Dunnett的多重比较测试或方差分析。

这项工作由Forschungsfördengsfond HHU（9772380）、VFK Krebsforschung和Wilhelm Sander Stiftung（2009.054.1）资助。T.S.是Susan G.Komen乳腺癌研究基金会资助BCTR0503620和FAS0703860的受益者。