摘要
在本研究中,我们评估了Src与雌激素受体α(ERα)和一种新发现的支架蛋白MNAR(ER非基因组活性调节剂)相互作用后激活的分子机制。在基本条件下,Src酶活性受到分子内相互作用的抑制。该酶可通过Src的SH2结构域与磷酸酪氨酸序列之间的相互作用和/或Src SH3结构域与包含PXXP基序的蛋白质之间的相互影响而激活。MNAR的突变分析和功能评估以及ERα和cSrc突变体的使用表明,MNAR通过其N末端PXXP基序与Src的SH3结构域相互作用。该基序的突变同时消除了MNAR诱导的Src激活和ER转录活性的刺激。ER使用磷酸酪氨酸537与Src的SH2结构域相互作用,该复合物通过MNAR-ER相互作用进一步稳定。定位研究表明,内质网受体α的A/B结构域和Y537都是MNAR诱导内质网转录活性激活所必需的。负责MNAR与ER相互作用的区域映射到MNAR的两个N端LXXLL基序。这些基序的突变阻止了ER-MNAR复合物的形成,并消除了Src/MAPK通路的激活。这些数据解释了MNAR、ER和Src之间的协调交互如何导致Src激活。我们的研究结果还表明,MNAR是一种介导ER-Src相互作用的支架蛋白,在Src介导的信号转导中ER作用的整合中发挥重要作用。
雌激素受体α和β(ERα和-β)通常被描述为配体诱导的转录因子,控制参与代谢、发育和生殖调节的靶基因的表达(1,2). 然而,越来越多的证据表明,并非雌激素的所有生物效应都是通过直接受体控制靶基因表达来介导的。雌激素的一些作用似乎归因于细胞级联的雌激素调节。
雌激素影响细胞内钙动员(三)并刺激腺苷酸环化酶活性和cAMP生成(4,5). 在卵巢中,它们激活G蛋白偶联受体并刺激肌醇磷酸的产生(4). 在内皮细胞和乳腺癌细胞中,它们激活磷脂酰肌醇3-激酶途径(6–9). 血管内皮内(10)、神经母细胞瘤(11),乳腺癌(12)和骨细胞系(13,14)它们刺激MAPK信号通路。其他类固醇激素也会影响细胞信号传导(综述见参考文献。15和16).
这些和其他快速效应表明,雌激素和其他类固醇可以与靠近质膜的受体相互作用。这些受体的性质尚待阐明,尽管一些研究表明存在与传统ERα和-β无关的ER(17,18). 然而,真正新型膜ER的克隆、分离和确认尚未完成。其他研究表明,经典ER的一个亚群与细胞膜有关,并与雌激素信号作用的某些表现有关(12,19,20).
ER整合到细胞信号传导中的分子机制尚不清楚。然而,ER与IGF受体、cSrc、磷脂酰肌醇3-激酶和caveolin-1的物理联系已被报道(19,21–23). 多项证据表明,酪氨酸激酶cSrc的激活是ER-介导细胞信号传导的初始步骤之一(24). 在来自Src的胚胎成纤维细胞的实验中,证明了Src激酶在类固醇受体的非基因组作用中的重要作用−/−老鼠。这些细胞对雄激素受体和ER的激活没有显示出MAPK通路的快速激活,而野生型Src+/+细胞有(13).
Src激酶具有氨基末端60–80氨基酸(aa)不同的共同结构组织(25). 所有Src家族成员共有几个功能性图案。氨基末端区域Src同源4结构域(SH4)包含肉豆蔻酰化和棕榈乙基化的一致序列(26). SH3结构域结合聚脯氨酸基序(27),SH2结构域与磷酸酪氨酸序列结合(26). 羧基末端SH1结构域包含催化区和一个短调控结构域,其中主要调控酪氨酸Y527(25). 在基本条件下,Src的催化域通过分子内相互作用被限制在非活性状态。SH2结构域与C-末端磷酸化酪氨酸的结合和SH3结构域与Src连接结构域中富含脯氨酸的区域的结合将分子锁定在受抑制的构象中(28). 完全催化活化需要释放这些约束。Src的激酶活性可以通过磷酸酪氨酸序列与SH2结构域的结合以及富含脯氨酸的序列与SH3结构域的连接来增强(29). 已知Src激酶的激活会影响许多途径,包括MAPK途径。
Src/Ras/Erk激酶途径的激活被证明可以促进ER介导的转录(30–33). ER包含两个转录激活域:激活功能(AF)-1和AF-2。配体结合控制AF-2的活性,而磷酸化提供了调节AF-1功能的重要机制。丝氨酸104、106、118和167的磷酸化调节AF-1活性(34–39),其突变导致ERα的反式激活减少(35,36). Erk 1/2激酶的激活体外和体内导致丝氨酸118上的ER磷酸化(S118)。此外,MAPK激活使ERα的配体依赖性激活(30,32,40). 通过证明AF-1和AF-2结构域可以与同一助活化分子的不同表面相互作用,对AF-1结构域与AF-2作用协同的能力提出了一个有趣的解释(41). 因此,激活Src可以通过激活导致S118磷酸化的Raf/MAPK激酶/ERK信号级联来刺激ERα活性。
通过亲和纯化,我们最近分离出一种新的支架蛋白,称为MNAR(内质网非基因组活性调节剂),它促进内质网与酪氨酸激酶Src家族成员之间的配体依赖性相互作用。我们已经证明,这种相互作用导致cSrc酶活性的刺激和MAPK通路激活(Erk1和Erk2激酶)(42).
在本研究中,我们研究了ERα-MNAR-Src相互作用导致Src活化的分子机制。我们的数据表明,MNAR和ER与Src的SH3和SH2结构域的配位结合分别通过MNAR的LXXLL基序通过ER-MNAR相互作用稳定,导致cSrc和Src介导的信号的激活。
结果
MNAR的结构-功能组织
MNAR序列分析揭示了10个LXXLL基序,包括两个双链,定位于分子的N末端部分(参见图1). 我们从最N末端的基序开始,将这些基序指定为1-10号。其他转录因子中的类似基序已被证明与核激素受体配体结合域表面的疏水沟槽相互作用(43)由于这些基序的存在及其假定功能,我们将MNAR的N末端区域称为核受体相互作用域(NRID)。NRID还包含三个PXXP基序。这些基序可能与多个信号传递分子中的Src同源结构域3(SH3)相互作用(44). MNAR分子的一个有趣的特征是位于MNAR分子C末端的富含脯氨酸和谷氨酸的延伸结构域,这给MNAR分子带来了强负电荷,使预测的pI达到4.30(图1). 我们在该结构域的基因数据库中没有发现同源性。
图1。
MNAR结构-功能组织MNAR组织示意图。由于存在多个假定的LXXLL基序,MNAR的N末端部分被称为NRID,而MNAR C末端区域由于存在许多脯氨酸和谷氨酸残基,被称为脯氨酸和富含谷氨酸的结构域。LXXLL(LXXLL)(蓝色)和PXXP(红色)从最N末端的基序开始,基序分别被指定为1–10和1–3。
与ER交互需要MNAR的LXXLL模型4和5
为了确定MNAR的哪个区域介导其与ERα的相互作用,表达野生型MNAR和MNAR截断突变体(由aa 1–120、1–189、1–278、1–469、1–1130、80–594和595-1130编码),35通过偶联转录/翻译反应进行S放射性标记,并与纯化的谷胱甘肽孵育-S公司-转移酶(GST)-ERα配体结合结构域。使用谷胱甘肽-硫糖分离MNAR-ER复合物,并用10%SDS-PAGE分离(图2A). 由aa 1–189、1–278、1–469和80–594编码的全长MNAR和MNAR截断突变体均与ER配体相互作用。然而,由aa 1–120和595-1130编码的MNAR突变体均不能与内质网相互作用。序列分析表明,与内质网膜相互作用的所有MNAR突变株之间的共同元素包括LXXLL 4和5,表明MNAR-ER相互作用是由这两个基序的一个或组合介导的。
图2。
下页图例分析MNAR-ER相互作用A、全长MNAR和MNAR截断突变体,并35S通过耦合进行无线电标记体外转录/翻译反应,并在存在或不存在1μ米用谷胱甘肽-硫糖分离E2结合物,并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。用于这些研究的MNAR截断突变体示意图(右侧面板),显示了LXXLL和PXXP图案的相对位置。B、 ELISA型实验方法的示意图,用于评估ER与不同MNAR LXXLL基序的结合。该图显示了与一个固定的MNAR LXXLL基序结合的标志标记的ERα。使用HRP融合的抗flag抗血清检测ER结合。C、 ERα以配体依赖的方式与MNAR LXXLL基序4和5相互作用。MNAR LXXLL基序从1-9开始编号,从N末端基序最多开始,分别命名为L1-L9。D、 用2XERE-tk-荧光素酶报告基因、ERα表达质粒和/或MNAR转染HepG2细胞1–469、MNAR1–469如图所示,LXXLL基序4、5或4和5中的亮氨酸残基被丙氨酸取代。用载体(−E2)处理细胞,10 n米E2(+E2),或E2和Src激酶抑制剂PP2在10μ米(+E2+PP2)。24小时处理后,细胞被裂解,荧光素酶活性被测定,如材料和方法.
为了进一步研究MNAR和ER之间的相互作用,我们使用了ELISA型测定。根据这个分析(图2B)合成了与每个MNAR LXXLL基序相对应的生物素化肽,并通过生物素-中微子素相互作用将其固定在中微子板上。标记的ERα与17β-雌二醇(E2,1μ米)或载体,并允许与固定肽相互作用。用与辣根过氧化物酶(HRP)融合的抗Flag抗体检测ERα结合。ERα以配体依赖的方式与分别对应于LXXLL基序4和5(L4和L5)的肽相互作用(图2C). 这些结果与使用GST下拉分析获得的数据一致(图2A)并提示MNAR与ER的结合可能由LXXLL 4和5或这些基序的组合介导。
我们之前已经证明,在E2存在下,通过ER-MNAR-Src相互作用和激活Src和MAPK通路(Erk 1和2),MNAR过度表达增加了ERα转录活性和ERα介导的基因表达(42). 我们使用瞬时共转染试验来确定MNAR LXXLL基序4、5或4和5的亮氨酸到丙氨酸突变是否会影响MNAR诱导的内质网转录活性激活(图2D). 为了解决这个问题,HEPG2细胞与2XERE-tk-luc-reporter基因、ERα表达载体和用于表达野生型或突变MNAR的质粒共同转染。细胞未经处理,或在10 n时用E2处理米或E2和PP2的组合(Src激酶抑制剂在10μ米). 与我们之前的数据一致(42),经E2处理的细胞中MNAR过度表达刺激了内质网转录活性,而与PP2共同处理的细胞可消除这种活性。LXXLL基序4或5中亮氨酸残基突变为丙氨酸并不影响MNAR介导的内质网活性刺激。然而,当LXXLL基序4和5中的亮氨酸残基突变为丙氨酸时,MNAR无法刺激ER转录活性(图2D). 这些结果以及结合研究(图2,A–C),表明LXXLL基序4和5是可互换的,并且两者都可以调节ER-MNAR相互作用。
MNAR的N末端部分对于刺激ERα转录活性是必要的和充分的
为了确定激活内质网所必需和足够的MNAR分子区域,我们生成了一个MNAR截断突变体库(图3A)以刺激ERα介导的转录的能力进行评估。将ERα和各种MNAR突变体的表达质粒与2xERE-tk-Luc报告质粒一起转染HepG2细胞。
图3。
MNAR的N末端部分是刺激ER介导的转录A所必需的,野生型MNAR和MNAR截断突变体的示意图,用于瞬时转染实验,以确定刺激ER转录活性所需的MNAR分子的哪一部分。B、 用2XERE-tk-荧光素酶报告基因构建物、ERα表达质粒和空载体、全长MNAR或其中一个MNAR截断突变体转染HepG2细胞。转染细胞后用载体(−激素)或10 n米E2(+E2)。处理24小时后对细胞进行裂解,并评估荧光素酶活性。
由aa 1–469、1–278和1–189编码的野生型MNAR和MNAR截断突变体能够增强10 n处理的HEPG2细胞中ERα转录活性米E2级(图3B). MNAR公司1–189是保留刺激ER活性能力的最小片段。MNAR分子的这一部分包含LXXLL基序1-6。相比之下,MNAR1–120在共转染试验中,不含LXXLL基序4、5或6的基因沉默。这些数据与我们之前的结果一致,表明MNAR的LXXLL基序4和5是MNAR诱导的内质网活性刺激所必需的(图2,A–D)。然而,MNAR80–594和MNAR80–574分别含有LXXLL基序3–10或3–9的基因在本试验中均处于非活性状态。这些数据表明,虽然需要包含LXXLL基序4和5的MNAR区域,但这不足以使MNAR诱导的内质网活化,并且位于由aa 1–80编码的MNAR分子的N末端部分的其他结构元素也对内质网的活化至关重要。MNAR公司1–80包含两个PXXP基序(PXXP编号1和2),可能介导MNAR与Src SH3域的相互作用。
MNAR Src交互分析。MNAR刺激ERα活性需要PXXP基序1
为了评估这个假设,我们使用了GST下拉法。Src SH3结构域在细菌系统中表达为GST融合蛋白,并使用谷胱甘肽琼脂糖纯化。用转录/翻译、,35S-放射性标记全长MNAR。使用谷胱甘肽琼脂糖分离形成的复合物。我们的数据表明,MNAR与SH3域相互作用(图4A). 为了评估MNAR的N端PXXP基序中的哪一个是MNAR-Src相互作用和ERα转录活性激活所必需的,我们使用了报告基因分析。用ERα表达质粒单独或与全长MNAR、MNAR联合转染HepG2细胞1–469,或MNAR1–469其中第一、第二或第一和第二PXXP基序中的脯氨酸均突变为丙氨酸。在10 n时用E2处理细胞,评估荧光素酶活性米在24小时内,将第一个或第一个和第二个PXXP基序中的脯氨酸突变为丙氨酸,消除了对ERα转录活性的MNAR刺激,而仅第二个PXXP基模的突变没有影响(图4B). 这些数据表明,ERα激活需要PXXP基序1,并表明该基序用于MNAR与Src的SH3结构域的相互作用。
图4。
MNAR与Src A的SH3和SH2结构域相互作用,表达全长MNAR35S无线电标记人体外转录/翻译反应并与Src的GST-SH3结构域孵育。用谷胱甘肽-硫糖分离结合物,并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。B、 用2XERE-tk-荧光素酶报告基因、ERα表达质粒和空表达载体或编码全长MNAR、MNAR的表达载体转染HepG2细胞1–469、MNAR1–469其中PXXP基序1、2或两者1和2中的脯氨酸残基突变为丙氨酸。转染后,用载体(−激素)或10 n米E2(+E2)。处理24小时后对细胞进行裂解,并评估荧光素酶活性。C、 表达全长MNAR和MNAR截断突变体35S放射性标记由耦合输入体外转录/翻译反应并与Src的GST-SH2结构域孵育。用谷胱甘肽-硫糖分离结合物,并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。
接下来,我们询问MNAR是否与cSrc的SH2域相互作用。为了解决这个问题,纯化的GST-SH2与转录/翻译和35S-放射性标记全长MNAR及其截断突变体由aa 1-594、595-1130、595-887、595-962和888-1130编码。GST-SH2结构域与全长MNAR和MNAR截断突变体MNAR相互作用595–1130、MNAR595–962和MNAR888–1130(图4C). 这些突变体之间常见的MNAR区域由aa 888–962编码(图4C)并且含有酪氨酸920(Y920),当磷酸化时,其可能作为SH2结构域的相互作用位点。然而,与磷酸化Y920的MNAR区域相对应的14肽不能阻断SH2-MNAR结合,这表明Y920不是MNAR相互作用的位点(数据未显示)。由aa 888–962编码的MNAR分子部分包含多个谷氨酸残基;因此,这种相互作用可能由限制在MNAR这一部分的强负电荷介导。这种相互作用的功能后果目前尚不清楚。缺失SH2相互作用位点的MNAR截断突变体(MNAR1–469, 1–278, 1–189, 80–594, 80–574)在ER和E2存在下,能够激活Src/MAPK级联并刺激ER转录活性。然而,MNAR与Src SH2和SH3域的相互作用可能解释了为什么体外,在不存在ER-E2的情况下,MNAR能够刺激cSrc活性。值得注意的是,MNAR激活Src体外通过添加ER-E2而增强(42).
Y537介导ERα与cSrc SH2结构域的相互作用
先前已经证明ERα可以以配体依赖的方式与Src的SH2结构域相互作用(20). 接下来,我们询问这种相互作用需要哪些ERα酪氨酸。为了解决这个问题,表达全长ERα,并35S在偶联转录翻译反应中放射性标记并与cSrc的GST-SH3、GST-SH2或GST-SH32孵育。根据之前公布的数据(20),ERα以配体依赖的方式与SH2相互作用,但不与Src的SH3结构域相互作用。合成了14个与ER分子中含有酪氨酸残基的区域相对应的聚肽。这些肽用于下拉/竞争分析(所有肽在30μ米)带有35S-放射性标记全长转录/翻译ERα和GST-SH2(图5B). ERα与SH2结构域的结合被与包含Y537残基的aa 530-544编码的ERα分子部分相对应的磷酸化肽所消除。有趣的是,Y537上未磷酸化的控制肽对ER-SH2相互作用没有影响。这些结果表明,ER与Src的SH2结构域的相互作用是由磷酸化的Y537介导的,并表明ER-Y537磷酸化状态对Src作用很重要。
图5。
与Src A的SH2结构域的ERα相互作用需要磷酸化酪氨酸537,表达全长ERα35S放射性标记由耦合输入体外转录/翻译反应,并与GST-SH2、GST-SH3或GST-SH3-SH2在不存在(−E2)或存在10μ米E2(+E2)。用谷胱甘肽-硫糖分离结合物,并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。B、 在50μ米在不存在(−E2)或存在1μ米E2(+E2)。用谷胱甘肽-硫糖分离结合物,并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。
MNAR诱导的ERα活性刺激需要ERα完整的AB结构域和酪氨酸537
我们之前已经证明,在E2存在下MNAR过度表达导致Src/Erk激活和ERα转录活性的刺激(参考文献。42; 另请参见图2D,三、和4摄氏度). 为了确定MNAR诱导的ERα激活需要ER分子的哪些部分,用MNAR和野生型ERα或其中一个ERα突变体转染HepG2细胞(图6).
图6。
用2XERE-tk-荧光素酶报告基因MNAR和野生型ERα或其中一个ERα突变体转染A/B结构域和Y537,以激活MNAR诱导的ERα介导的转录HepG2细胞。转染后,用载体(−激素)或10 n米E2(+E2)。在24 h处理后,对细胞进行裂解,并评估β-Gal和荧光素酶活性。
尽管MNAR过度表达刺激了野生型ERα的转录活性,但MNAR无法激活缺乏AB结构域(由aa 263–595编码)的ERα突变体,或丝氨酸104、106和118突变为丙氨酸的ERα。这些数据表明,MNAR诱导的内质网活化是通过内质网磷酸化介导的。以前已经证实,表皮生长因子激活Src/MAPK通路会导致S118上的ER磷酸化,从而增强受体的活性(30,32). E2处理细胞还导致S118处ERα磷酸化(35,36). 因此,这些数据与我们之前的结果一致,即MNAR介导E2诱导的Src/MAPK通路激活和ER转录活性激活。537酪氨酸突变为丙氨酸也可通过MNAR消除ERα激活。这些结果证实了我们的发现,在MNAR-ERα-Src复合物中,ERα与Src相互作用需要磷酸化酪氨酸537(图6).
讨论
核/类固醇激素受体配体对细胞信号级联的激活是众多实验室深入研究的重点。尽管人们普遍认为它具有生物学重要性,但对这种现象的分子机制仍知之甚少。在评估MCF7细胞中ER相互作用蛋白的光谱时,我们发现了一种新的支架蛋白,它与cSrc和ERα相互作用并控制ER诱导的Src激活。我们已经表明,在E2处理的细胞中,MNAR过度表达激活Src/MAPK级联并增强ER转录活性。Src和MAPK激酶抑制剂阻断MNAR诱导的内质网活化(42). 在本研究中,我们使用该分析作为MNAR-ER诱导Src激活的读数。
cSrc可以通过C末端抑制性磷酸酪氨酸位点的去磷酸化(或通过C末端尾部的丢失在致癌变体中)或通过高亲和力配体与SH2或SH3结构域的结合来激活。随后的自抑制结构的解开导致激酶结构域的激活,这可能是由SH3和SH2结构域的解耦以及这些结构域和细胞蛋白的结合所帮助的,从而将激酶结构域定位于其底物(45). SH2和SH3结构域是调节蛋白质相互作用的模块化多肽单元,在许多蛋白质上都被发现在一起,这表明它们的活性可以协调,并且可以在Src调节中相互配合(27).
MNAR包含三个完美的PXXP基序,分别位于分子的N末端部分和C末端的一个延伸的富含脯氨酸的区域,可能介导MNAR与Src SH3结构域的相互作用。GST-SH3下拉试验证明体外转录和翻译的全长MNAR与Src的SH3域特异性相互作用(图4A和7). MNAR分子的N末端部分由aa 1–189编码,包含两个PXXP基序,对MNAR诱导的Src激活至关重要。因此,我们产生了MNAR突变体,其中第一、第二或两个PXXP基序中的脯氨酸被丙氨酸取代,并在与ER的共转染实验中对其进行评估。第一个PXXP-基序的突变消除了ER的激活,而第二个PXXP-基序是可有可无的。这些数据表明,PXXP基序1用于与Src的SH3结构域的MNAR相互作用(图4B和7). MNAR也与Src的SH2结构域相互作用。使用GST-SH2结构域的下拉实验,我们将这种相互作用映射到由aa 887–962编码的MNAR的C端区域(图4C). MNAR的这个区域只包含一个酪氨酸(Y920),当磷酸化时,它可能成为Src SH2结构域的相互作用位点。然而,这种相互作用的功能尚不清楚,因为MNAR C末端部分的缺失并不影响其激活Src/MAPK级联并刺激ER转录活性的能力(图3B).体外纯化Src和MNAR的分析表明,MNAR本身能够增强Src酶的活性;在ER-E2的存在下,这种刺激被强烈增强(42). 潜在地,MNAR与Src的SH2结构域结合可能有助于Src激活。评估其在调节Src活性中的作用是未来研究的一个重要目标。
图7。
提出的MNAR/ER/Src相互作用模型Src SH3和SH2畴与MNAR和ER之间的协调相互作用通过ER-MNAR相互作用稳定,导致Src活化。
MNAR使用LXXLL基序4和/或5与ERα相互作用(图2和7). LXXLL基序存在于多种转录因子中,包括SRC/p160共激活因子家族的成员(46–52),p300/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)结合蛋白(53,54)和甲状腺激素受体相关蛋白/维生素D受体相互作用蛋白/介质复合物(55–58). 这些结构域足以与核激素受体进行配体依赖性相互作用(59,60). 核受体相互作用蛋白中LXXLL基序的数量不同。SRC/p160家族成员有三个LXXLL基序(61)受体相互作用蛋白140包含这些基序中的9个(62). MNAR包含10个LXXLL基序,包括两个双链。所有这些基序的存在可能表明MNAR可以与多种核激素受体相互作用。事实上,我们的数据表明,除了ERα和-β外,雄激素受体、糖皮质激素受体和孕激素受体也以配体依赖的方式与MNAR相互作用(42). 与LXXLL基序4和5相对应的肽都能与ER相互作用。只有一个LXXLL模序中的亮氨酸替换为丙氨酸并不影响MNAR和ER对Src的激活(图2D). 然而,两个LXXLL基序的突变都取消了Src的激活。这些数据表明,基序4和5对于MNAR-ERα相互作用是可互换的。
绑定到MNAR可能会使ER接近Src。先前已经证明ERα以配体依赖的方式与Src相互作用(20). 我们的数据表明,内质网的磷酸化酪氨酸537Y是这种相互作用所必需的,因为与内质网这一区域相对应的磷酸化肽阻断了内质网与Src的SH2结构域的结合(图5和7). 研究表明,用几种不同的氨基酸取代该残基,在没有配体的情况下会导致内质网活化和辅活化子募集,但在三苯氧胺或ICI 182780的情况下不会。因此,有人推测,保守螺旋N末端的酪氨酸构成内质网中配体依赖性激活功能的主要部分,在缺乏激素的情况下,需要它来维持受体的转录不活跃状态(63,64). MNAR过度表达并不影响ERα突变体的转录活性,其中537Y被苯丙氨酸取代,苯丙氨酸是一种氨基酸,其疏水侧链的大小和结构与酪氨酸相似,但缺乏羟基,不能通过磷酸化修饰(图6). 这种ERα突变体对E2有反应,其转录活性与野生型受体类似(63,64).
同样,MNAR过表达对ERα的转录活性没有影响,其中Ser 104、106和118被丙氨酸取代(图6)或其中a/B结构域被删除的ERα突变体。丝氨酸118可以被MAPKs Erk 1和Erk 2磷酸化(30)对生长因子治疗或Src过度表达/激活的反应(33)导致ER的配体依赖性激活,并刺激配体诱导的ER活性(32). 这些数据证实了我们之前的发现,即MNAR诱导的ER激活是由Src/MAPK途径的刺激介导的,可能是由ER磷酸化介导的。
总之,本研究表明,Src的SH3和SH2结构域与MNAR和ER之间的配位相互作用相应地,通过ER-MNAR相互作用稳定,导致Src活化。这些数据为我们之前的假设提供了额外的信息和支持,即MNAR是一种新的支架蛋白,将ER作用纳入Src介导的细胞信号传导。
材料和方法
试剂
E2和4(OH)-三苯氧胺来自西格玛化学公司(密苏里州圣路易斯)。ICI-182780由Zeneca Pharmaceuticals提供。惠氏研究所的肽化学小组合成并纯化了对应于不同MNAR LXXLL基序的生物素化肽。谷胱甘肽琼脂糖珠来自Sigma。抗磷酸酪氨酸抗体、SuperSignal Elisa Pico过氧化物酶底物和Reacti-Bind NeutraAvidin涂层微孔板均来自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。Src抑制剂PP2来自Calbiochem(加州La Jolla)。
克隆、蛋白质表达和纯化
通过设计寡核苷酸从cDNA模板中扩增MNAR编码区的适当片段,并通过限制性内切酶位点亚克隆到pcDNA3.1表达载体中,构建了一系列融合到N末端标记肽的MNAR C末端截断突变体编码结构。通过测序确认合适的克隆,并在报告分析中进行测试,如所述。Src SH2(aa 151–253)和SH3(aa 81–150)结构域被克隆到pGEX-5X-3载体中,并在细菌中表达,并使用谷胱甘肽-脑葡萄糖4B(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)纯化。ER突变体先前已有描述(36,64–68).
使用GST下拉菜单进行交互分析
转录/翻译野生型MNAR和MNAR截断突变体(由aa 1–189、1–278、1–469、80–594、595-1130和1–1130编码)和全长ERα,并35使用TNT快速耦合转录/翻译系统(威斯康星州麦迪逊市Promega)对S进行放射性标记。为了进行相互作用分析,将指示的GST融合蛋白与谷胱甘肽-Sepharose 4B结合,以及指示的转录和翻译蛋白在4℃的结合缓冲液(50 m)中培养3 h米三氯化氢,pH值8;150米米氯化钠;10%甘油,0.05%诺奈德P-40;1米米苯甲基磺酰氟;1米米二硫苏糖醇)。在竞争实验中,肽的最终浓度为50μ米用结合缓冲液洗涤珠子四次,通过添加SDS缓冲液洗脱结合蛋白,并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。
细胞培养和转染
HEPG-2人肝细胞癌细胞取自美国型培养物收集中心(ATCC,Manassas,VA),并在补充有亚特兰大生物制品公司(Norcross,GA)10%热灭活胎牛血清的DMEM中培养。细胞生长在95%O的增湿环境中2-5%一氧化碳237℃;每个孔75000个细胞被镀在96个板中,并转染到DMEM中我-谷氨酰胺或酚红,补充1%炭渣脱脂血清。按照制造商的指示,使用Lipofectamine 2000将2xERE-tk-荧光素酶报告子(100 ng)、1 ng pcDNA3.1 ERα、0.2 ng、1 ng或5 ng pcDNA 3.1 MNAR表达载体和10 ng pCMV b-半乳糖苷酶(Stratagene,La Jolla,CA)作为内部对照物引入细胞中(马里兰州盖瑟斯堡生命技术公司)。转染16小时后,用指定的处理方法培养细胞24小时。收集细胞,并根据制造商的说明评估β-Gal和荧光素酶活性。
基于ELISA的交互分析
我们使用了一种快速、非同位素ELISA型方法来表征受体-激活剂相互作用。合成了与不同MNAR的LXXLL基序对应的生物素化肽(从N末端最基序指定为1-9),并将其固定在Reacti-Bind NeutraAvidin涂层微孔板上(Pierce Biotechnology,Rockford,IL)。用结合缓冲液(50 m米Tris-HCl,pH 8.0;150米米氯化钠;1米米二硫苏糖醇;1米米乙二胺四乙酸;0.01%诺奈德P-40;和0.01%BSA)。肽在100μl结合缓冲液中稀释至最终浓度50μ米,在室温下与Reacti-Bind NeutraAvidin涂层微孔板孵育1h,并用结合缓冲液洗涤四次。标记的ERα,与载体或1μ预先孵育米E2在室温下作用1小时,在室温下与对应于MNAR的LXXLL基序之一的固定化肽作用2小时。用结合缓冲液清洗平板四次,并用与HRP(Sigma)融合的抗体孵育1小时,然后再清洗四次。SuperSignal ELISA Pico化学发光底物(Pierce Biotechnology)用于检测抗原-抗体复合物,并使用Wallac Victor读取信号21420多标签计数器(Perkin-Elmer Lifesciences,马萨诸塞州波士顿)。
致谢
这项工作得到了NIH拨款CA18119(给B.S.K.)的部分支持。
C.-W.W.的当前地址:Metabolex,Inc.,3876 Bay Center Place,Hayward,California 94545。
缩写
aa公司
空军
第2页
急诊室
消费税
人力资源计划
MNAR公司
身份证号码
第118节
第2页
1曼格尔斯多夫
流行音乐播音员
,拇指
C类
,比托
米
,海尔里希
P(P)
,舒茨
G公司
,乌梅索诺
K(K)
,布隆伯格
B类
,卡斯特纳
P(P)
,作记号
米
,尚邦
P(P)
,埃文斯
R(右)
1995
核受体超家族:第二个十年。
单元格
83
:835
–839
2麦肯纳
新泽西州
,奥马利
BW公司
2002
核受体和协同调节剂对基因表达的组合控制。
单元格
108
:465
–474
三Improta-Brears公司
T型
,沃顿
AR公司
,科达齐
F类
,约克
JD公司
,迈耶
T型
,麦克唐纳
DP公司
1999
雌激素诱导的有丝分裂原活化蛋白激酶的激活需要细胞内钙的动员。
《美国科学院院刊》
96
:4686
–4691
4拉赞迪
米
,佩德拉姆
A类
,格林
德国劳埃德船级社
,莱文
急诊室
1999
细胞膜和核雌激素受体(ER)来源于单个转录物:中国仓鼠卵巢细胞中ERα和ERβ表达的研究。
分子内分泌学
13
:307
–319
5阿罗尼卡
性虐待
,卡齐内伦伯根
英国标准
1993
雌激素、环磷酸腺苷和胰岛素样生长因子-I刺激雌激素受体介导的大鼠子宫雌激素受体磷酸化状态的转录和改变。
分子内分泌学
7
:743
–752
6陈
Z轴
,尤安娜
是
,加尔切瓦·加尔戈瓦
Z轴
,卡拉斯
右侧
,门德尔松
我
,沙乌尔
PW公司
1999
雌激素受体α通过雌激素介导内皮一氧化氮合酶的非基因激活。
临床研究杂志
103
:401
–406
7海恩斯
MP公司
,辛哈
D类
,罗素
堪萨斯州
,碰撞
米
,富尔顿
D类
,莫拉莱斯·鲁伊斯
米
,塞萨
厕所
,折弯机
年少者
2000
膜雌激素受体参与通过PI3-激酶-Akt途径激活人内皮细胞中的内皮一氧化氮合酶。
循环研究
87
:677
–682
8太阳
米
,帕西加
JE公司
,费尔德曼
RI公司
,元
Z轴
,科波拉
D类
,卢
年
,雪莱
沙特阿拉伯
,尼科西亚
SV公司
,程
JQ公司
2001
磷脂酰肌醇-3-OH激酶(PI3K)/AKT2在乳腺癌中被激活,通过雌激素受体α(ERα)与PI3K之间的相互作用调节并被雌激素受体α诱导。
癌症研究
61
:5985
–5991
9济
电子邮箱
,王
S-C公司
,李
J-N公司
,挂
M-C型
2001
雌激素受体阴性乳腺癌细胞中雌激素对Akt的激活。
癌症研究
61
:8390
–8392
10罗素
堪萨斯州
,海恩斯
MP公司
,辛哈
D类
,牧师会
E类
,折弯机
年少者
2000
人类血管内皮细胞含有雌二醇的膜结合位点,可介导快速的细胞内信号传导。
《美国科学院院刊》
97
:5930
–5935
11瓦特
JJ公司
,坎贝尔
JS公司
,坎宁安
美赞臣
,克雷布斯
如
,多尔莎
DM公司
1997
神经母细胞瘤细胞中类固醇的快速膜效应:雌激素对丝裂原活化蛋白激酶信号级联和c-fos即时早期基因转录的影响。
内分泌学
138
:4030
–4033
12米利亚乔
A类
,迪多梅尼科
米
,卡斯托利亚
G公司
,日期Galco公司
A类
,邦滕波
P(P)
,诺拉
E类
,基奥
F类
1996
MCF-7细胞中雌二醇受体复合物激活酪氨酸激酶/p21ras/MAP-激酶途径。
欧洲工商管理硕士J
15
:1292
–1300
13库斯特尼
S公司
,贝利多
T型
,普洛金
锂
,奥布莱恩
卡
,博登纳
DL公司
,汉族
L(左)
,汉族
K(K)
,迪格雷戈里奥
GB(英国)
,卡齐内伦伯根
青年成就组织
,卡齐内伦伯根
英国标准
,罗伯逊
PK(主键)
,温斯坦
RS系列
,吉尔卡
RL公司
,马诺拉加斯
联合国安全理事会
2001
通过雌激素或雄激素受体的非遗传性、性别非特异性信号:与转录活性分离。
单元格
104
:719
–730
14恩多
H(H)
,沙沙贵
H(H)
,丸山
K(K)
,竹山
K(K)
,瓦加
我
,清水
T型
,加藤
S公司
,川岛
H(H)
1997
雌激素在骨细胞系中快速激活MAP激酶。
生物化学-生物物理研究委员会
235
:99
–102
15詹姆斯
H(H)
.Segars公司
博士
2002
雌激素作用和细胞质信号级联。I.膜相关信号复合物。
内分泌代谢趋势
13
:349
–354
16卡托
自动控制
,雀巢
A类
,水貂
S公司
2002
类固醇受体在细胞信号通路中的快速作用。
科学STKE
138
:RE9(参考文献9)
17菲拉尔多
EJ公司
,奎因
青年成就组织
,温和的
KI公司
,弗拉克尔顿Jr公司
AR公司
2000
雌激素诱导的Erk-1和Erk-2激活需要G蛋白偶联受体同源物GPR30,并通过释放HB-EGF来激活表皮生长因子受体而发生。
分子内分泌学
14
:1649
–1660
18雷韦利
A类
,马索布里奥
米
,特萨里克
J型
1998
生殖组织中类固醇激素的非基因组作用。
Endocr版本
19
:三
–17
19米利亚乔
A类
,短笛
D类
,卡斯托利亚
G公司
,迪多梅尼科
米
,比兰西奥
A类
,伦巴第
米
,龚
周
,比托
米
,基奥
F类
1998
孕酮受体通过与雌激素受体的相互作用激活Src/p21ras/Erk通路。
欧洲工商管理硕士J
17
:2008
–2018
20米利亚乔
A类
,卡斯托利亚
G公司
,迪多梅尼科
米
,日期法尔科
A类
,比兰西奥
A类
,伦巴第
A类
,男爵
妈妈
,Ametrano公司
D类
,扎尼尼
微软
,阿勃
C类
,基奥
F类
2000
类固醇诱导的雄激素受体-雌二醇受体β-Src复合物触发前列腺癌细胞增殖。
欧洲工商管理硕士J
19
:5406
–5417
21施莱格尔
A类
,王
C类
,卡泽内伦博金
英国标准
,佩塞尔
RG公司
,利桑蒂
MP公司
1999
Caveolin-1增强雌激素受体α(ERα)信号传导。
生物化学杂志
274
:33551
–33556
22卡勒特
S公司
,纽德林
S公司
,货车艾克尔
米
,维特
H(H)
,迈耶
R(右)
,格罗赫
C类
2000
雌激素受体α迅速激活IGF-1受体途径。
生物化学杂志
275
:18447
–18453
23西蒙奇尼
T型
,Hafezl-Moghadam公司
A类
,巴西
DP公司
,莱伊
K(K)
,下巴
栈单
,廖
JK公司
2000
雌激素受体与磷脂酰肌醇-3-OH激酶调节亚单位的相互作用。
自然
407
:538
–541
24米利亚乔
A类
,卡斯托利亚
G公司
,迪多梅尼科
米
,De法尔科
A类
,比兰西奥
A类
,基奥
F类
2002
Src是性类固醇激素作用的初始靶点。
Ann NY科学院
963
:185
–190
25托马斯
性虐待
,布鲁格
JS公司
1997
Src家族激酶调节的细胞功能。
年收入细胞开发生物
13
:513
–609
26Resh(休息)
米
1993
酪氨酸激酶癌蛋白与细胞膜的相互作用。
Biochim生物物理学报
1155
:307
–322
27科恩
G公司
,任
R(右)
,巴尔的摩
D类
1995
信号转导蛋白中的模块结合域。
单元格
80
:237
–248
28松田
米
,迈耶
BJ公司
,福井
Y(Y)
,哈纳福萨
H(H)
1990
转化蛋白P47gag-crk与多种磷酸酪氨酸蛋白的结合。
科学类
248
:1537
–1539
29哈伯德
SR公司
,穆罕默德
米
,施莱辛格
J型
1998
蛋白酪氨酸激酶的自我调节机制。
生物化学杂志
273
:11987
–11990
30加藤
S公司
,恩多
H(H)
,正弘
Y(Y)
,北本
T型
,内山
S公司
,沙沙贵
H(H)
,马苏希格
S公司
,高多
Y(Y)
,西田
E类
,川岛
H(H)
,梅茨格
D类
,尚邦
P(P)
1995
通过丝裂原活化蛋白激酶磷酸化激活雌激素受体。
科学类
270
:1491
–1494
31张
L(左)
,卡琳,
米
2001
哺乳动物MAP激酶信号级联。
自然
410
:37
–40
32丁腈橡胶
G公司
,布赖恩
P(P)
,米基西克
R(右)
,皮卡德
D类
1996
EGF激活未连接的雌激素受体涉及MAP激酶途径和直接磷酸化。
欧洲工商管理硕士J
15
:2174
–2183
33冯
周
,韦伯
P(P)
,阮(Nguyen)
P(P)
,线路接口单元
X
,锂
J型
,卡琳
米
,库什纳
PJ公司
2001
Src/JNK通过丝氨酸118依赖性途径增强雌激素受体激活功能1(AF-1)。
分子内分泌学
15
:32
–45
34陈
D类
,洗手间
E类
,萨瓦尔
N个
,贝茨
G公司
,步伐
体育课
,蒂鲁努瓦卡拉苏
V(V)
,泰勒
J型
,爱泼斯坦
RJ公司
,全速前进
F类
,埃格利
吉咪
,库姆斯
钢筋混凝土
,阿里
S公司
2002
磷酸化特异性抗血清揭示了丝氨酸118处人类雌激素受体通过两种不同的信号转导途径磷酸化。
癌基因
21
:4921
–4931
35阿里
S公司
,梅茨格
D类
,博内特
J型
,尚邦
P(P)
1993
通过人类雌激素受体A/B区的配体依赖性磷酸化调节转录激活。
欧洲工商管理硕士J
12
:1153
–1160
36勒戈夫
P(P)
,蒙塔诺
米
,肖丁
D类
,卡齐内伦伯根
B类
1994
人类雌激素受体的磷酸化。识别激素调节位点并检查其对转录活性的影响。
生物化学杂志
269
:4458
–4466
37阿诺德
S公司
,奥伯恩
J型
,雅菲
H(H)
,通知
A类
1994
丝氨酸167是雌激素受体上雌二醇诱导的主要磷酸化位点。
分子内分泌学
8
:1208
–1214
38罗加茨基
我
,特罗布里奇
吉咪
,加拉贝德语
美赞臣
1999
通过细胞周期蛋白A-CDK2复合物对丝氨酸104和106的磷酸化增强人类雌激素受体α转录激活。
生物化学杂志
274
:22296
–22302
39史密斯
C类
,康尼利
O(运行)
,奥马利
B类
1993
激素和抗激素对人类雌激素受体的配体依赖性激活的调节。
《美国科学院院刊》
90
:6120
–6124
40阿诺德
旧金山
,奥伯恩
JD公司
,杰菲
H(H)
,诺蒂斯
自动控制
1995
酪氨酸537上人类雌激素受体的磷酸化体内和src家族酪氨酸激酶体外.
分子内分泌学
9
:24
–33
41韦伯
P(P)
,阮(Nguyen)
P(P)
,新坂
J型
,安德森
C类
,冯
周
,阮(Nguyen)
MP公司
,陈
D类
,黄
性虐待
,Subramanian语
S公司
,麦基尼
E类
,卡齐内伦伯根
英国标准
,斯塔尔库普
先生
,库什纳
PJ公司
1998
雌激素受体激活功能1通过结合p160辅活化蛋白发挥作用。
分子内分泌学
12
:1605
–1618
42Wong(王)
C-W公司
,麦克纳利
C类
,尼克巴格
E类
,科姆
英国标准
,切斯基斯
BJ公司
2002
雌激素受体相互作用蛋白,通过Src/Erk磷酸化级联调节其非基因组活性。
美国国家科学院Proc Soc
92
:5696
–5699
43海利
DM公司
,卡尔霍文
E类
,霍尔
S公司
,帕克
MG公司
1997
转录共激活剂中的标志性基序介导与核受体的结合。
自然
387
:733
–736
44凯
黑色
,威廉姆森
MP公司
,Sudol公司
米
2000
脯氨酸的重要性:信号蛋白中富含脯氨酸的基序与其同源结构域的相互作用。
法国银行
14
:231
–241
45年轻
妈妈
,贡弗洛尼
S公司
,Superti-Furga公司
G公司
,鲁克斯
B类
,Kuriyan村
J型
2001
c-Src和Hck的SH2和SH3结构域之间的动态耦合是其通过c末端酪氨酸磷酸化失活的基础。
单元格
105
:115
–126
46锂
H(H)
,戈麦斯
PJ公司
,陈
JD公司
1997
RAC3是一种与SRC-1和TIF2相关的类固醇/核受体相关辅活化剂。
《美国科学院院刊》
94
:8479
–8484
47安齐克
SL公司
,科诺宁
J型
,散步的人
RL公司
,阿佐萨
执行
,坦纳
MM(毫米)
,关
XY公司
,索特
G公司
,卡利奥涅米
操作
,特伦特
吉咪
,熔化器
PS(聚苯乙烯)
1997
AIB1,一种在乳腺癌和卵巢癌中扩增的类固醇受体辅激活物。
科学类
277
:965
–968
48商行
H(H)
,科尔里
K(K)
,特里维迪
A类
,约翰逊
DL公司
,斯塔尔库普
先生
1996
GRIP1是一种新型的小鼠蛋白,在酵母中作为类固醇受体激素结合域的转录辅激活剂。
《美国科学院院刊》
93
:4948
–4952
49沃格尔
JJ公司
,海涅
美赞臣
,蒂尼
米
,维瓦特
V(V)
,尚邦
P(P)
,格罗内迈尔
H(H)
1998
辅激活子TIF2包含三个核受体结合基序,并通过CBP结合依赖和独立途径介导反式激活。
欧洲工商管理硕士J
17
:507
–519
50陈
H(H)
,林
RJ公司
,希尔茨
RL公司
,查克拉瓦蒂
D类
,纳什
A类
,纳吉
L(左)
,普里瓦斯基
毫升
,中谷
Y(Y)
,埃文斯
马来西亚令吉
1997
核受体辅活化因子ACTR是一种新型组蛋白乙酰转移酶,与P/CAF和CBP/p300形成多聚体激活复合物。
单元格
90
:569
–580
51宣
反恐精英
,贝罗丁
TJ公司
,马斯罗尼
R(右)
,切斯基斯
BJ公司
,利特尔
铬
,脆弱的
判定元件
1998
一种转录共激活因子,类固醇受体共激活因子-3,选择性增强类固醇受体的转录活性。
生物化学杂志
273
:27645
–27653
52竹下
A类
,卡多纳
希腊
,小布奇
N个
,宣
C-S公司
,下巴
栈单
1997
TRAM-1是一种新型的160-kDa甲状腺激素受体激活剂分子,具有与类固醇受体辅激活剂-1不同的性质。
生物化学杂志
272
:27629
–27634
53查克拉瓦蒂
D类
,拉莫特
VJ公司
,纳尔逊
国会议员
,中岛
T型
,舒尔曼
IG公司
,朱桂林
H(H)
,蒙敏伊
米
,埃文斯
马来西亚令吉
1996
CBP/p300在核受体信号传递中的作用。
自然
383
:99
–103
54龟井静香
Y(Y)
,徐
L(左)
,海因策尔
T型
,托尔基亚
J型
,Kurokawa村
R(右)
,光泽
B类
,林
联合国安全理事会
,海曼
无线电高度表
,玫瑰色
数据仓库
,玻璃
CK公司
,罗森菲尔德
MG公司
1996
CBP积分复合物通过核受体介导转录激活和AP-1抑制。
单元格
85
:403
–14
55方德尔
JD公司
,Ge公司
H(H)
,罗德
RG公司
1996
转录活性甲状腺激素受体辅激活物复合物的配体诱导。
《美国科学院院刊》
93
:8329
–8333
56伊藤
米
,元
CX公司
,奥卡诺
HJ公司
,达内尔
无线电广播
,罗德
RG公司
2000
TRAP/SMCC辅激活物复合体的TRAP220成分参与胚胎发育和甲状腺激素作用。
分子电池
5
:683
–693
57拉谢
C类
,苏尔丹
Z轴
,病房
J型
,张
人物配对关系
,布拉科夫
D类
,曲棍球
H(H)
,暴风雨
P(P)
,弗里德曼
有限合伙人
1998
一种新的蛋白质复合物,以配体依赖的方式与维生素D3受体相互作用,并在无细胞系统中增强VDR反式激活。
基因开发
12
:1787
–1800
58拉谢
C类
,柠檬
BD公司
,苏尔丹
Z轴
,Bromleigh公司
V(V)
,赌博
米
,纳尔
调幅
,仪表-制动
H(H)
,暴风雨
P(P)
,弗里德曼
有限合伙人
1999
核受体的配体依赖性转录激活需要DRIP复合物。
自然
398
:824
–828
59玻璃
CK公司
,罗森菲尔德
MG公司
2000
核受体转录功能中的协同调节物交换。
基因开发
14
:121
–141
60达里蒙特
BD公司
,瓦格纳
RL公司
,Apriletti公司
JW公司
,斯塔尔库普
先生
,库什纳
PJ公司
,巴克斯特
JD公司
,弗莱特里克
RJ公司
,山本
韩国
1998
核受体-激活剂相互作用的结构和特异性。
基因开发
12
:3343
–3356
61麦肯纳
新泽西州
,兰兹
无线电广播
,奥马利
BW公司
1999
核受体协同调节剂:细胞和分子生物学。
Endocr版本
20
:321
–344
62卡瓦耶
V(V)
,多瓦
S公司
,勒霍斯特
F类
,洛佩兹
G公司
,霍尔
S公司
,库什纳
PJ公司
,帕克
MG公司
1995
核因子RIP140通过雌激素受体调节转录激活。
欧洲工商管理硕士J
14
:3741
–3751
63白色
R(右)
,斯霍伯格
米
,卡尔霍文
E类
,帕克
MG公司
1997
保守酪氨酸突变引起雌激素受体的配体依赖性激活。
欧洲工商管理硕士J
16
:1427
–1435
64韦斯
韩国
,埃克纳
K(K)
,托马斯
青年成就组织
,拉森内克
G公司
,卡齐内伦伯根
英国标准
1996
受体蛋白中含有酪氨酸537的氨基酸替代的组成活性人类雌激素受体。
分子内分泌学
10
:1388
–1398
65雷恩
CK公司
,卡齐内伦伯根
英国标准
1993
通过酵母区域特异性突变和表型筛选对人类雌激素受体激素结合域的结构-功能分析。
生物化学杂志
268
:24089
–24098
66肖丁
流行音乐播音员
,庄
Y(Y)
,夏皮罗
流行音乐播音员
,卡齐内伦伯根
英国标准
1995
确定显性负性雌激素受体有效性的机制分析。
生物化学杂志
270
:31163
–31171
67麦金纳尼
相对长度单位
,卡齐内伦伯根
英国标准
1996
抗雌激素依赖性和雌二醇依赖性转录激活所需的人类雌激素受体激活功能-1的不同区域。
生物化学杂志
271
:24172
–24178
68蒙塔诺
MM(毫米)
,穆勒
V(V)
,特洛鲍
A类
,卡齐内伦伯根
英国标准
1995
人类雌激素受体的羧基末端F结构域:在受体转录活性中的作用以及抗雌激素作为雌激素拮抗剂的有效性。
分子内分泌学
9
:814
–825
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