UBXN7利用其UIM基序停靠在neddylated cullin复合体上并导致HIF1α积聚

摘要

背景

UBA-UBX家族的蛋白质通过其UBA结构域与泛素化蛋白质相互作用，通过其UBX结构域与p97相互作用，从而充当p97 ATP酶的底物结合适配器。特别是，人UBXN7（也称为UBXD7）介导p97与转录因子HIF1α的相互作用，该转录因子在常氧细胞中被基于CUL2的E3连接酶CRL2主动泛素化。UBA-UBX蛋白免疫沉淀物的质谱分析表明，它们与多种E3泛素连接酶相互作用。值得注意的是，UBXN7最擅长与cullin-RING连接酶亚基相互作用。因此，我们着手确定UBXN7与cullins的相互作用是直接的还是由其与UBA域结合的泛素化靶点介导的。

结果

我们证明UBXN7与cullins的相互作用与泛素和底物结合无关。相反，它依赖于UBXN7中的UIM图案，该图案直接与NEDD8修改cullins相关。为了了解UBXN7与去甲酰化cullins相互作用的功能后果，我们重点研究了HIF1α，这是一种使用UBXD7/p97作为泛素受体的CUL2底物，其途径是蛋白酶体介导的降解。我们发现UBXN7过表达将CUL2转化为neddylated形式，并导致非泛素化HIF1α的积累。这两种效应都严格依赖UIM，只有当UBXN7包含完整的UIM基序时才会发生。我们还发现携带长泛素链的HIF1α可以招募替代的泛素受体，缺乏p97的ATP依赖性分离酶活性。

结论

我们的研究表明，UBXN7独立于其作为p97泛素结合适配器的功能，直接与neddylated cullins相互作用，导致CUL2底物HIF1α的积累。我们认为，通过将CUL2固定在其neddylated形式，UBXN7负调节CRL2的泛素连接酶活性，这可能会阻止泛素受体（p97除外）向核HIF1α募集。

背景

通过由泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）组成的酶级联反应，用泛素链标记拟用于蛋白酶体介导降解的蛋白质[1]. 泛素化的下游，泛素受体识别多泛素化蛋白质并促进其被蛋白酶体降解[2]. 一些泛素受体，如PSMD4（在酵母中称为Rpn10）和RPN13，是蛋白酶体的调节颗粒所固有的[三,4]. 其他的，如来自RAD23或ubiquilin家族的，在蛋白酶体上来回穿梭[5]. 除了上述单亚单位受体外，一类具有ATP酶活性的独特泛素受体的核心是p97六聚体。有人提出，p97通过将ATP导出的能量转换为机械力而起到“隔离层”的作用[6——8]. 事实上，p97复合物可以将底物从细胞结构中分离出来，例如内质网膜[9]或来自蛋白质伴侣[7,10]. p97蛋白本身对泛素几乎没有亲和力，并且依赖于它与泛素结合适配器的相互作用来发挥泛素受体的功能。这种适配器包括NPL4/UFD1二聚体[11,12]和UBA-UBX蛋白[13]. 后者利用其UBX结构域与p97的N末端和UBA（泛素相关）结构域相互作用，结合泛素化蛋白质[14]. 人类表达五种UBA-UBX蛋白：UBXN7、FAF1、FAF2、UBXN1和p47。质谱分析UBA-UBX蛋白免疫沉淀物的一个引人注目的观察结果是，它们能够与大量E3泛素连接酶相互作用[15]. 这些包括cullin-RING E3连接酶（CRL）复合物的成分以及单亚单位RING和HECT域E3。

与泛素类似，泛素样（UBL）蛋白NEDD8通过特定的E1、E2和E3酶附着在底物上。迄今为止，cullins代表了作为neddylation靶标的主要蛋白质类[16]. 在这种情况下，NEDD8 E3活动由DCN1的双重作用提供[17——19]和CRL复合物的RING亚单位[20——22]. 十多年来，众所周知，cullin-去乙酰化对CRL复合物的E3活性至关重要[23]. 最近的结构和生物化学研究阐明了NEDD8修饰CRL激活的复杂分子机制。Neddylation诱导了cullin中的主要构象变化，这基本上允许RBX1的RING域从cullin释放出来。正是RING域的这种增加的灵活性最终转化为CRL优越的泛素连接酶活性[24,25].

我们之前已经确定HIF1α是p97的一种新底物，UBA-UBX蛋白UBXN7作为底物结合适配器[15]. HIF1α与HIF1β异源二聚体化，形成HIF1转录因子，该转录因子在缺氧期间对触发抵抗缺氧应激所需的特定蛋白的表达至关重要[26]. HIF1α在常氧状态下持续表达，并通过基于CUL2的CRL复合物（CRL2）的作用积极靶向泛素介导的降解。在CRL2中，CUL2充当RING亚单位（RBX1）和伸长素B/伸长素C二聚体结合的支架。VHL停靠在伸长素C上并直接与HIF1α相互作用[27]，作为CRL2复合物的底物结合接头（图第1页). 与p97在HIF1α降解中起积极作用一致，HIF1α在siRNA耗尽p97后积累。矛盾的是，UBXN7耗尽导致HIF1α水平降低，表明UBXN6参与HIF1α的降解比预期更复杂[15].

图1

UBXN7的泛素和底物结合与CUL2结合无关. (A类)CRL2泛素连接酶与其底物HIF1α结合的图示。CRL2的核心亚单位以蓝色突出显示。UBA-UBX蛋白UBXN7通过其UBA结构域与泛素化HIF1α相互作用。(B类)CUL2与UBXN7的相互作用独立于泛素结合。从泛素E1的热敏细胞中免疫沉淀UBXN7标记物。当这些细胞在限制性温度下生长20小时时，蛋白质泛素化显著降低（右图）。在这些条件下观察到的泛素结合减少不会影响CUL2与UBXN7的结合（左面板）。(C类)Flag-UBXN7与CRL2复合物的核心亚基稳定地相互作用。用10μM MG132处理或不处理HeLa细胞两小时后，用免疫沉淀法从中分离出标记物UBXN7。标记-UBXN7与CUL2、elongin C和RBX1稳定相互作用。只有蛋白酶体抑制才能检测到与HIF1α和VHL的相互作用（左侧面板）。(D类)内源性UBXN7与CRL2复合物的核心亚单位稳定相互作用。如（C）所示，但内源性UBXN7是使用与蛋白A珠交联的特定抗体从HeLa细胞免疫沉淀的。(B类-D类)使用免疫沉淀物（左）和输入细胞提取物（右）中的特定抗体检测所示蛋白。

在这里，我们表明UBXN7与cullin的相互作用不是由其泛素化底物介导的，而是涉及UBXN6中UIM基序与neddylated cullin之间的直接对接。UBXN7过度表达导致非泛素化HIF1α以依赖于UBXD7中完整UIM基序的方式积聚。我们的数据表明，UBXN7可能是CRL2的负调节因子，这将有助于随后招募p97。

结果

UBXN7与CUL2的相互作用不需要活性泛素化

在人类UBA-UBX蛋白中，UBXN7最擅长与CRL亚单位相互作用。事实上，它与CUL2相互作用的能力大大超过其他UBA-UBX蛋白质[15]. 因此，我们着手进一步探索UBXN7与CRL2的交互作用。我们最初的假设是，UBA-UBX蛋白与E3泛素连接酶的相互作用是间接的，由其泛素化底物介导。为了验证这个假设，我们使用了A31N-ts20细胞，这是对泛素E1具有温度敏感性的小鼠胚胎成纤维细胞[28]. 当这些细胞在非允许温度下生长时，蛋白质泛素化级联的初始步骤被阻断，导致与在35°C下生长的对照细胞相比，泛素化蛋白质的水平显著降低（图1B年). 作为泛素化途径有缺陷的补充证据，我们观察到在39°C下生长的细胞中HIF1α的积累。虽然泛素与标记UBXN7的结合显著减少，但UBXN7-与CUL2的相互作用未受影响（图1B年).

UBXN7与核心CRL2复合体稳定交互

接下来，我们研究了UBXN7与CRL2复合体其他成分的相互作用。Flag-UBXN7有效地协同免疫沉淀CUL2、伸长素C和RBX1，它们构成核心CRL2复合物。相反，UBXN7与VHL和HIF1α的相互作用只能在MG132短暂抑制蛋白酶体后观察到（图1摄氏度). 当内源性UBXN7使用特定抗体进行免疫沉淀时，也获得了类似的结果（图1天).

迄今为止的数据表明，UBXN7与CUL2底物泛素化蛋白的相互作用并不介导CUL2的结合。这提出了一个有趣的假设，即UBXN7可能与CRL2核心复合物直接相互作用，而不管它是否带有底物（图第1页).

与UBXN7的相互作用需要Cullin-neddylation

我们观察到UBXN7优先与CUL2的neddylated形式相互作用，在Flag-UBXN7免疫沉淀后，CUL2从提取物中大量耗尽（图2安培，比较车道3和4）。我们还注意到，Flag-UBXN7的过度表达导致CUL2向迁移速度较慢的形式迁移（图2B型). 为了证实这确实是nedylated-CUL2，我们使用了NEDD8-E1的化学抑制剂MLN4924[29]. MLN4924消除了由UBXN7过度表达引起的cullin-neddylation和CUL2升高（图2B型). 为了研究与UBXN7相互作用需要cullin-neddylation的可能性，我们创建了两个neddylation-defective CUL2突变体K689R和K719R。Lys689是人类CUL2中NEDD8-结合位点，将该残基突变为精氨酸可消除neddylation[30]. Lys719是cullins中的保守残基，其在酵母Cdc53中的等效物是与Dcn1相互作用表面的一部分[17]（图2摄氏度). K719R突变株中的CUL2-neddaylation严重缺陷（图二维)可能是由于其无法与NEDD8-E3的DCN1组件相互作用。我们试图测试该突变体在结合人类DCN1样蛋白方面是否有缺陷，但即使在野生型Flag-CUL2免疫沉淀物中也无法检测到DCNL1。上述突变均未影响CUL2与RBX1的相互作用（图二维). 引人注目的是，CUL2-neddylation与其与内源性UBXN7相互作用的能力之间存在精确的相关性。UBXN7结合在K689R突变体中被完全消除，而在K719R突变体中被强烈降低（图二维). 因此，CUL2与UBXN7的相互作用需要neddylation。这是扑杀中的一个常见特征，因为MLN4924处理不仅阻止了UBXN7与CUL2的相互作用，还阻止了与CUL1、CUL3和CUL4A的相互作用（图第二版). 与蛋白酶体抑制剂MG132同时治疗无法挽救MLN4924治疗引起的cullin-binding缺陷（图第二版). 相反，MLN4924治疗并不影响UBXN7与泛素化蛋白或p97的相互作用（图2楼).

图2

UBXN7在细胞提取物中与奈达基化cullins相互作用. (A类)UBXN7优先与迁移速度较慢的neddylated CUL2相互作用。比较输入细胞提取物和Flag-UBXN7免疫沉淀后的上清液。(B类)Flag-UBXN7过度表达导致CUL2向其neddylated形式上移位。当细胞在NEDD8-E1抑制剂MLN4924存在下生长2小时时，这种效应被消除。(C类)人类CUL2与酵母cullin Cdc53的比对。保守的neddylation位点（K689）和与Dcn1（K719）相互作用的C末端Lys残基以红色突出显示(D类)Neddylation-defective CUL2变体在与内源性UBXN7相互作用时同样存在缺陷。用10μM MG132处理或不处理HeLa细胞两小时后，免疫沉淀野生型或突变型Flag-CUL2。(E类)MLN4924处理消除了UBXN7与几个内源性Cullin的相互作用。(F类)MLN4924处理对UBXN7与泛素化蛋白或p97的相互作用没有影响。(E类,F类)用MG132、MLN4924或两者联合处理的HeLa细胞免疫沉淀UBXN7标记物。使用特定抗体检测所示蛋白。

UBXN7的UIM图案需要进行NEDD8修改

由于UBXN7优先与neddylated-CUL2相互作用，并且cullin-neddylation是发生相互作用的先决条件，因此我们对NEDD8对cullin的修饰可能直接参与招募UBXN7.的可能性产生了兴趣。因此，我们将注意力转向UBXN7及其结构中的各个域。UBXN7的N端有一个UBA域，随后是未知功能的UAS域、UIM基序和C端的UBX域（图3A级). 为了研究UBXN7与CUL2的相互作用是否需要这些结构域中的任何一个，我们比较了几种UBXN6变体的泛素和CUL2结合能力，包括野生型、UBX域中的点突变（P459G）以及缺少UBA、UAS、UIM或UBX域的截断突变（图3B公司和3C公司). UAS结构域的缺失在很大程度上对UBXN7与泛素、p97或CUL2的相互作用没有影响。ΔUBA和ΔUIM截断突变体在泛素结合中均存在部分缺陷（图3B公司，将车道2、4与1进行比较）。有趣的是，虽然ΔUBA具有结合CUL2的野生型能力（图3C、，比较泳道1和2），ΔUIM截短导致CUL2结合显著减少（图3C公司，比较车道1和4）。这些结果表明，UIM基序是CUL2结合所必需的，而UBA结构域则不是。

图3

UBXN7与neddylated-CUL2的交互需要完整的UIM基序. (A类)人类UBXN7的示意图，突出了其各个领域。(B类-D类)从HeLa细胞中免疫沉淀野生型或突变型Flag-UBXN7。使用免疫沉淀物（左）和输入细胞提取物（右）中的特定抗体检测所示蛋白。(B类)UBA或UIM缺失都会导致UBXN7泛素结合减少。UBX缺失或该结构域中的点突变（P459G）消除了p97结合，并严重损害了与泛素化蛋白的相互作用（左图）。(C类)UIM缺失，而非其他突变，导致CUL2与UBXN7结合的强烈减少（左面板），并消除了UBXN6过度表达导致的CUL2向上移位（右面板）。(D类)Ser297的UIM基序内的点突变导致CUL2与UBXN7结合的缺陷，类似于UIM缺失。p97结合不受这些突变的影响（左图）。

正如预期的那样，UBX缺失和该域中的点突变（P459G）都消除了p97结合（图3B公司). 令人惊讶的是，这些突变也影响了泛素结合，表明它们对UBXN7功能有广泛影响，可能是通过改变蛋白质的整体结构。尽管UBX突变体在p97和泛素结合方面严重缺陷，但它们基本上保留了与CUL2相互作用的能力（图3C公司)支持UBXN7与CUL2的结合独立于其与p97或泛素化蛋白的结合。

与UBXN7ΔUIM与CUL2的结合减少一致，该突变的过度表达未能导致CUL2向neddylated形式的上调（图3C公司，比较通道8和11）。实际上，表达UBXN7ΔUIM的细胞中CUL2的迁移与未转染细胞相似（图3C公司第11和14车道）。

UIM基序中的各种残基对其与泛素的相互作用至关重要[31,32]. 我们发现，将Ser297突变为Ala或His会导致类似于UIM缺失的neddylated-CUL2结合缺陷（图三维，将车道4、5与3进行比较）。因此，我们得出结论，该基序中的UIM缺失和点突变都会对UBXN7与奈德酰化铜蛋白的相互作用产生负面影响。

为了进一步证实UBXN7中UIM基序与NEDD8而非泛素相互作用的能力，我们进行了在体外NEDD8-或泛素琼脂糖结合分析。使用两种类型的珠子有效地将野生型UBXN7拉下（图4A级). UIM基序的缺失导致NEDD8-结合显著减少，对泛素结合没有影响，而UBA的缺失则取消了泛素结合，并导致NEDD8结合也有所减少。这些数据强烈支持UBXN7的UIM基序专门识别NEDD8的概念，并且可以直接参与NEDD8对cullins的修改。

图4

UBXN7直接与NEDD8和cullins交互 在体外. (A类)UBXN7的UIM图案直接识别NEDD8。UIM基序的缺失专门减少了UBXN7与NEDD8的结合，而UBA结构域的缺失则消除了与泛素的相互作用。NEDD8或泛素琼脂糖珠与UBXN7的指定重组变异体孵育。(B类)无论CUL2的修改状态如何，野生型UBXN7都能有效下拉CUL2（左侧面板）。细菌表达的Flag-UBXN7与未修饰或部分奈德化的全长CUL2预先孵育，然后使用抗Flag珠进行免疫沉淀。(C类)在体外UBXN7与全长CUL2的相互作用不受UIM删除的影响。野生型或UIM缺失的Flag-UBXN7与neddylated和non-neddyleted CUL2的混合物孵育，然后如（B）所示进行免疫沉淀。(D类)Cullin-neddylation增加全长和UBA缺失的UBXN7的结合，但不增加UIM缺失突变体的结合。涂有非奈德基化或奈德基和非奈德化CUL1（342-776）/GST-RBX1混合物的GSH-beads与所示UBXN7变异体孵育。使用裸GSH珠作为对照。右侧面板中的Flag western blot显示三种UBXN7变体的类似输入水平。

UBXN7与cullin-RING复合物相互作用在体外

检查UBXN7是否能与cullin复合体相互作用在体外，我们使用抗Flag珠来免疫沉淀Flag标记的UBXN7，该UBXN7与未修饰的CUL2或CUL2一起孵育在体外neddylated公司。由于在我们的CUL2制剂中RBX1以亚化学计量量存在，因此只有一小部分CUL2被奈德化。我们发现野生型UBXN7可以与CUL2有效地相互作用，而不管其奈德化状态如何（图4B类). 缺少UIM基序的UBXN7变体同样擅长与两种形式的CUL2相互作用（图4摄氏度). 在这些条件下，UBXN7与CUL2的交互似乎并不严格依赖于UIM或NEDD8。为了消除cullin N端半部分的潜在结合位点，我们将细菌表达的GST-RBX1与CUL1的C端片段（氨基酸324-776）复合使用[33]. 将固定在谷胱甘肽载体上的CUL1/RBX1复合物进行neddylated或暴露于无NEDD8的模拟neddylation-mix中。所有测试的UBXN7变异体在一定程度上与非neddylated CUL1片段相互作用（图4D（四维）). CUL1-neddaylation后，与野生型UBXN7和ΔUBA突变体的相互作用增强，而与ΔUIM突变体的交互作用未受影响（图4D（四维）). 因此，我们确定UBXN7可以直接与cullins交互在体外并证实UIM-NEDD8接触具有贡献（尽管不如使用细胞提取物观察到的重要）。

UBXN7过度表达导致HIF1α以UIM依赖的方式积聚

由于各种UBXN7突变体改变了与泛素化蛋白或CUL2相互作用的能力，我们检查了它们在细胞中的表达是否会对HIF1α水平产生影响，HIF1α是CRL2底物[27]并与UBXN7交互[15]. 野生型UBXN7的过度表达导致HIF1α以其非泛素化形式大量积累（图5A级，比较通道1和2）。最重要的是，这种效应依赖于UIM基序，因为过度表达UIM缺失型UBXN7的细胞中HIF1α水平与未转染细胞相似（图5A级，泳道1和5）。相反，CRL2亚单位CUL2、VHL、elongin C和RBX1的水平未受影响（图5A级). UBXN7在引起依赖UIM的HIF1α积累方面是独特的，因为另一种含有UIM的泛素受体蛋白酶体亚单位PSMD4的过度表达对HIF1α水平没有影响（图5亿).

图5

UBXN7过度表达导致HIF1α以UIM依赖的方式积聚. (A类)非泛素化HIF1α在过度表达野生型Flag-UBXN7的细胞中积累，但在表达UIM缺失版本的细胞中不积累。在细胞裂解前两小时添加10μM MG132，以促进HIF1α检测。UBXN7过表达对CRL2亚单位水平没有影响。(B类)另一种含UIM的蛋白PSMD4的过度表达不会改变HIF1α水平。(C、 D类)在没有蛋白酶体抑制的情况下，UBXN7过度表达时，还观察到非泛素化HIF1α依赖UIM的积累（右面板）。野生型UBXN7以不同程度的泛素化与HIF1α相互作用，而UIM缺陷型UBXN 7（在UIM缺失或Ser297点突变时）仅与缓慢的多-泛素化HIF1α交互作用（左侧面板）。图3D显示了（C）中实验的相应Flag、CUL2和p97 western blots。(D类)UIM基序内Ser288突变的UBXN7结合CUL2（左面板）并导致HIF1α积累（右面板），类似于野生型蛋白质。使用特异性抗体检测指示的蛋白质。

为了便于HIF1α检测，对于图中所示的实验5A级和5亿在细胞溶解之前，细胞受到蛋白酶体活性的短暂抑制。然而，在没有MG132治疗的情况下，也可以观察到UBXN7过度表达时HIF1α的UIM依赖性积累（图5摄氏度和第五天，右侧面板）。UIM基序中Ser297的点突变对CUL2结合产生负面影响（图三维)还消除了HIF1α的积累，类似于UIM缺失（图5摄氏度，右侧面板）。

以前的报告在人类UBXN7的UIM基序中发现了Ser288的磷酸化位点[34,35]. 因此，我们创建了该残基的磷酸化缺陷物（S288A）和磷酸化修饰突变体（S288D），以验证Ser288的磷酸化是否可能调节UIM功能。这两个突变体在CUL2和HIF1α结合方面表现出与野生型相似的行为（图第五天). 它们还导致HIF1α积聚，与野生型UBXN7非常相似（图第五天，右侧面板）。因此，Ser288的磷酸化似乎对UIM功能并不重要。

有趣的是，在UIM缺陷突变体中观察到的CUL2结合缺陷与与非或寡-双喹啉化HIF1α结合的完全丧失相关（图5摄氏度). 尽管如此，这些突变体仍保留了与多-联喹啉化HIF1α（即最慢迁移形式的HIF1α）相互作用的能力，可能是通过UBA结构域。

HIF1α上的长泛素链导致泛素受体选择性降低

我们之前观察到，携带长泛素链的HIF1α可以与UBA-UBX蛋白而非UBXN7相互作用，尽管效果不佳[15]. 与CRL2复合物上的预对接一致，UBXN7以不同程度的泛素化作用与HIF1α相互作用，从非或寡-泛素化到多-泛素化合（图6A级). 相反，另一种UBA-UAS-UBX蛋白FAF1仅与迁移较慢的HIF1α相互作用（图6A级)与UBXN7相似，缺少UIM图案（图第五天).

图6

携带长泛素链的HIF1α在与泛素受体的相互作用中变得杂乱. (A类)FAF1与携带长泛素链的HIF1α相互作用，尽管效率低下（顶面板）。用10μM MG132、1μM MLN4924或二者的组合处理HeLa细胞2小时后，从其中免疫沉淀出Flag-UBXN7或Flag-FAF1。(B类)标记-UBXN7（绿色）定位于HeLa细胞的细胞核。DNA用DAPI（蓝色）染色。比例尺代表15μm。(C类)RAD23B与迁移速度较慢的多聚喹啉化HIF1α相互作用（顶面板）。使用抗Flag珠从HeLa细胞中免疫沉淀Flag-UBXN7或Flag-RAD23B。使用特异性抗体通过蛋白质印迹检测指示的蛋白质。

标记-UBXN7仅在HeLa细胞的细胞核中发现（图6亿). RAD23B，另一个UBA域泛素受体也定位于核室[36,37]这促使我们检查它是否也可能与HIF1α相互作用。与FAF1一样，RAD23B能够协同免疫沉淀携带较长泛素链的HIF1α（图6摄氏度). 因此，随着泛素链变长，底物在与泛素受体的相互作用中的选择性降低。我们的观察表明，UBXN7主要靶向HIF1α的核池，它可能与RAD23B竞争核内泛素化的HIF1α。

讨论

UBXN7与cullins的相互作用需要nedylation，并且与泛素化底物无关

多种证据表明，泛素/底物结合和cullin-binding to UBXN7是两个独立的事件：（1）抑制泛素E1强烈降低泛素结合，但对CUL2结合UBXN6没有影响；（2） UBXN7与HIF1α/VHL的相互作用是短暂的，在蛋白酶体抑制后强烈增强，而UBXN6与核心CRL2复合物的相互作用稳定；（3） UBA域缺失减少泛素与UBXN7的结合，但不影响与CUL2的相互作用。

此外，一些观察结果支持了UBXN7与cullins相互作用需要neddylation的观点：（1）在获得neddylated方面存在不同程度缺陷的CUL2突变体在UBXN7binding中同样存在缺陷；（2） NEDD8-E1的化学抑制消除了UBXN7与多个Cullin的相互作用；(3)在体外CUL1片段的neddylation以UIM依赖的方式刺激其与细菌表达的UBXN7的相互作用。体外，UBXN7可以与非neddylated cullin相互作用，这表明UIM-NEDD8可能不是UBXN6和CRL之间的唯一链接。由于我们使用的简化CRL仅包含cullin和RBX1，因此这些其他绑定决定因素可能特别容易访问，从而放弃了我们观察到的细胞提取物中CUL2天然形式的neddylation的严格要求。

UBXN7，每个交互一个域

UBX域具有泛素样结构[38]被p97共因子广泛用于与p97 N末端相互作用[13]. 我们的分析证实UBX域是UBXN7中p97绑定所需的唯一域。

UBA和UIM都被广泛描述为泛素结合模块[39]. NEDD8和泛素序列57%相同，产生了非常相似的三维折叠，称为泛素超折叠。最重要的是，泛素的疏水表面（由Leu8、Ile44、His68和Val70形成）与泛素结合域（如UBA）相互作用[40]和UIM卡[41]在NEDD8中保存[42]. UBA和UIM与NEDD8互动在体外[43,44]泛素超家族的另一个结构域UBL结构域[45]. 原则上，UBA或UIM都可以作为奈德酰化铜蓝的对接点。

我们表明，在UBXN7中，UBA和UIM发挥着不同的作用。在细胞提取物中，缺少UBA结构域的UBXN7突变体完全能够与cullin相互作用，因此排除了该结构域参与cullin-binding的可能性。这种突变体是泛素结合能力最低的，但它并没有完全缺陷。在这种情况下，泛素结合可能不是直接的，而是由结合到cullins的UIM基序介导的。相反，缺乏UIM基序或携带点突变的UBXN7在cullin-binding中严重缺陷。ΔUIM突变体观察到的残余CUL2结合可能由其UBA依赖性与CRL2泛素化底物的相互作用介导。事实上，这种突变体保留了与携带长泛素链的HIF1α相互作用的能力。我们认为UIM基序有助于UBXN7与奈德酰化铜的直接结合。这一结论得到了我们的大力支持在体外缺乏UIM基序的UBXN7变异体与NEDD8-但不是泛素-琼脂糖结合缺陷的结合分析。该实验还阐明了UIM基序识别NEDD8修饰就其本身而言而不是cullins的neddylated构象。

这里提供的数据表明，UBXN7中发现的三个域中的每一个都能够发生特定的交互作用。因此，UIM基序允许UBXN7与neddylated-cullins对接，UBA结构域是结合泛素化蛋白底物所必需的，UBX结构域招募p97复合物（图7). 未来的工作将揭示UAS领域发挥的作用。

图7

UBXN7利用其UIM基序与neddylated cullins对接UBXN7中的每个域都介导一种特定的相互作用：UBA域与泛素化HIF1α相互作用，UIM基序锚定neddylated CRL复合体，UBX域招募p97/NPL4/UFD1复合体。

CRL依赖性降解中的过程性与选择性

确定UBXN7可以直接与去甲酰化CRL复合物相互作用后，一个关键问题是这种相互作用是否会对CRL的泛素连接酶活性产生任何影响。

这里的数据让我们推测UBXN7不仅是p97的泛素结合适配器，而且可能还体现了一种新的CRL抑制机制。这与我们之前的观察结果一致，即siRNA对UBXN7的缺失会导致HIF1α水平的降低，而不是HIF1α的积累，因为它只是介导HIF1α与p97的相互作用[15].

我们发现UBXN7过度表达导致HIF1α主要以非泛素化形式积聚，这表明UIM-NEDD8相互作用会对泛素链延长产生负面影响，即降低CRL泛素连接酶的加工能力。UBXN7过度表达不仅导致HIF1α积累，而且还将CUL2转化为其neddylated形式。由于这两种效应都完全依赖于UIM基序，因此我们很容易提出，通过隔离其neddytated形式的CUL2，UBXN7可能在空间上阻碍CRL复合物向开放构象的转变，从而减轻NEDD8对CRL E3活性的积极影响。

我们发现，当HIF1α携带长泛素链时，泛素受体的选择性受到损害。因此，我们认为CRL处理能力的降低将有利于p97募集到UBXN7的UBX结构域，而不是将替代的泛素受体募集到快速增长的泛素链。通过之前在neddylated-CRL上的对接，UBXN7将处于理想状态，以调节底物-泛素化，并将平衡转向p97招募。

UBXN7招募p97到核HIF1α

使用p97复合物作为选择的泛素受体在细胞核中尤为重要，HIF1α与HIF1β形成复合物并与其靶基因的启动子相关[46——48]. 在各种泛素受体中，p97独特地提供了在其降解之前从其蛋白伙伴和/或染色质释放核HIF1α所需的分离酶活性。内源性HIF1α存在于正常组织和肿瘤组织正常细胞的细胞核中[49——51]多-联喹啉化HIF1α仅在正常血氧HeLa细胞的细胞核中检测到[52]. 与UBXN7/p97特异性靶向核HIF1α的概念一致，我们发现Flag-UBXN7定位于正常毒性HeLa细胞的细胞核。

结论

在这里，我们表明在p97的泛素结合适配器中，UBXN7具有直接对接到neddylated cullins的独特能力。该功能依赖于UIM基序，该基序仅存在于p97的UBXN7辅因子中。此外，UBXN7与neddylated CUL2的相互作用似乎对其泛素连接酶活性产生了负面影响，因为UBXN6的过度表达导致非泛素化HIF1α以UIM依赖的方式积聚。

为什么p97具有如此多的泛素结合辅因子，例如NPL4、UFD1、各种UBA-UBX蛋白、PLAA，这一直令人困惑。我们的数据表明，UBXN7作为p97的底物结合接头的作用是次要的，因为它能够与CRLs相互作用，并可能调节其活性。UBXN7与cullins的相互作用不需要p97，而UBXN6与NPL4/UFD1的相互作用由p97介导[15]表明UBXN7在泛素依赖性降解的p97途径中作用于NPL4/UFD1的上游。可以假设p97的各种适配器在一种继电器中起作用，它们的时间顺序由功能决定，而不仅仅是泛素识别。未来的工作将告诉有多少上述蛋白质的泛素结合能力只是更复杂功能的一个方面。

方法

克隆信息

人类UBXN7[GenBank:NM_015562]从EST图像5294894中扩增。对于哺乳动物表达，将野生型和突变型UBXN7变异体亚克隆为BamH1/Not1插入pCMV5-Flag。对于细菌表达，将UBXN7变异体亚克隆到含有TEV蛋白酶位点和GST下游Flag标签的改良pGEX6P-1载体中。人类CUL2[GenBank:NM_003591]和RAD23B[GenBank:NM_002874.3]分别从EST IMAGE 4104375和3906269中扩增，作为BamH1/Not1插入物亚克隆到pCMV5-Flag中。分别从EST IMAGE 5928559和6285035中扩增人FAF1[GenBank:NM_007051.2]和PSMD4[GenBank:NM_002810.2]，用于亚克隆到pCMV5-Flag中作为Sal1/Not1插入物。构建GST-CUL2和HIS双重表达杆状病毒载体₆-RBX1，人CUL2被亚克隆为BamH1/Not1插入P_酸碱度pFastBac-Dual-GST的驱动磁带。RBX1[GenBank:NM_014248.2]从EST IMAGE 3138751中扩增，在5'引物上添加Nhe1位点和6HIS标记，在3'引物中添加Kpn1位点，并将其亚克隆到P_第10页pFastBac-Dual-GST-CUL2的驱动磁带。

使用KOD热启动DNA聚合酶（德国达姆施塔特默克米利浦）进行PCR反应。所有全长PCR产物均克隆到pSc-B（安捷伦科技，加州圣克拉拉，美国），并在进一步亚克隆之前进行完全测序。所有突变和缺失均采用Quickchange方法（安捷伦科技公司），但使用KOD Hot Start DNA聚合酶。DNA测序由邓迪大学生命科学学院（CLS）的测序服务机构进行。

细胞提取物和免疫沉淀

对于免疫沉淀实验，将细胞在缓冲液A（50mM N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（HEPES）/KOH，pH 7.2；5 mM镁（OAc）₂; 70 mM KOAc；0.2%Triton®声波风廓线仪X-100；10%甘油；0.2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）；蛋白酶抑制剂），并与交联至蛋白A-琼脂糖或抗旗帜珠（美国密苏里州圣路易斯Sigma）的抗UBXN7抗体孵育。对于图中的实验第五天，PhosSTOP磷酸酶抑制剂（德国曼海姆罗氏公司）也添加到裂解缓冲液中。

使用缓冲液B（50 mM HEPES/KOH，pH 7.2；400 mM NaCl；1%NP-40；0.2 mM EDTA；10%甘油；蛋白酶抑制剂）制备总提取物，以促进提取核HIF1α。

抗体和化学品

以下抗体用于蛋白质免疫印迹检测：小鼠抗Flag M2（Sigma）、小鼠抗泛素FK2（Enzo，Farmingdale，NY，USA）、鼠抗p97（Fitzgerald，North Acton，MA，USA，兔抗CUL4A（Cell Signalling，Danvers，MA，USA）、兔和鼠抗CUL1、兔抗CUL2、兔对抗NEDD8（Invitrogen，Camarillo，CA，USA，兔抗UBXN7（由Millipore，Billerica，MA，USA提供）。在细胞裂解之前，将MG132（酶）以10μM的浓度添加到组织培养基中两小时。如前所述，邓迪大学CLS信号转导治疗部合成了MLN4924[53]. 用1μM MLN4924培养细胞2小时。

重组蛋白的表达与纯化

SCILLS的蛋白质生产和分析开发团队（PPADT）在细菌中生产了各种重组蛋白，如下所示。将全长、UBA或UIM缺失的UBXN7表达载体转化为BL21 DE3细胞。在LB培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠）中培养过夜的培养物，并添加羧苄青霉素。接种自诱导培养基，让细胞在37°C下生长，直到OD₆₀₀达到约1.5。然后将温度降至15°C，并将细胞放置约16小时以表达蛋白质。通过离心收集细胞，并将其重新悬浮在50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、250 mM NaCl、0.4%Triton X-100、0.1 mM EDTA、0.1 mM乙二醇四乙酸（EGTA）、1 mM二硫苏糖醇（DTT）和蛋白酶抑制剂中。对悬浮液进行超声处理，并通过在4°C、28000 g下离心20分钟来沉淀不溶性物质。上清液与GSH-sepharose孵育1小时。将琼脂糖洗涤四次，用TEV蛋白酶切割后回收UBXN7。通过Superdex 75色谱柱进一步纯化蛋白质，蛋白质纯度超过90%。

表达Flag-CUL1（324-776）/GST-HA-RBX1的载体[33]也转化为BL21细胞，但在LB/氨苄西林中生长，并在OD下用0.1 mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导₆₀₀0.7。然后将其在15°C下表达过夜，并如上所述制备裂解物。

编码GST-CUL2/HIS的双表达载体₆-RBX1被用于按照制造商的协议使用Bac-to-Bac系统（Invitrogen）生成重组杆状病毒。这些杆状病毒被用来感染食果夜蛾21个电池（1.5×10⁶/ml）感染5次，感染48小时后采集感染细胞。在GSH-Sepharose上纯化GST-CUL2/RBX1，并透析成50 mM Tris-HCl pH 7.5、0.1 mM EGTA、150 mM NaCl、270 mM蔗糖、0.03%Brij-35、0.1%2-巯基乙醇、1 mM苯甲脒、0.1 mM-苯甲基磺酰氟（PMSF）。

体外试验结合分析

将Flag-CUL1（324-776）/GST-HA-RBX1复合物固定在GSH-sepharose（GE）上。对于每个结合分析，携带约1μg CUL1/RBX1的10μl珠在30°C下与含有NEDD8 E1（PPADT，SCILLS）、NEDD8 E2（Ubiquigent，Dundee，UK）、NEDD8和ERS（BostonBiochem，Cambridge，MA，USA）的奈德化反应混合物在缓冲液C（50 mM HEPES/KOH，pH 7.5；60 mM KOAc；5 mM MgCl）中孵育30分钟₂; 5%甘油，1 mM DTT）。通过从混合物中省略NEDD8，平行进行模拟neddylation反应。然后用3μg野生型或突变型Flag-UBXN7在不含DTT的缓冲液C中清洗并孵育珠子1小时，并补充0.1%Triton X-100（缓冲液D）。洗涤珠粒后，用莱姆利缓冲液洗脱结合的蛋白质。结合分析也使用裸珠进行，以说明UBXN7与珠的非特异性结合。

用PreScission蛋白酶将GST从CUL2上切下，所得CUL2/RBX1如上所述进行neddylated。将CUL2/RBX1（1.5μg）与1.5μg Flag-UBXN7（约为CUL2摩尔过量量的1.5倍）预先孵育30分钟，然后在缓冲液D中与10μl反Flag珠孵育1小时。在Laemmli缓冲液中煮沸洗脱与珠结合的蛋白质。

将野生型或突变型UBXN7（25μg）与10μl NEDD8-或泛素琼脂糖（BostonBiochem）在缓冲液D中孵育1小时，并如上洗脱结合蛋白。

免疫荧光染色和显微镜检查

对于Flag-UBXN7免疫染色，细胞生长在盖玻片上，并在-20°C下用冰镇甲醇固定6分钟。然后将细胞在1%的BSA/PBS中封闭30分钟，然后在室温下与小鼠抗标志M2（Sigma）抗体在3%的BSA/PBS中孵育1小时。用PBS清洗后，用驴抗鼠FITC-结合抗体（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，USA）培养细胞45分钟。细胞核用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，Invitrogen）染色。使用液压支架将盖玻片安装在玻璃载玻片上（美国佐治亚州亚特兰大国家诊断公司）。

使用DeltaVision Spectris显微镜（Applied Precision）、CoolSNAP HQ相机（Roper）和60×1.4 NA物镜（Olympus）获取图像。SoftWorx软件（Applied Precision）用于采集和反褶积。