甲状腺转录因子-1(TTF-1NKX2.1型基因)是一种同源域转录因子,是肺形态发生的主要调节因子,TTF-1基因缺失小鼠出生后立即死亡,原因是肺发育严重不足(1). TTF-1在人类肺内稳态中的重要性也被发现突出TTF-1/NKX2.1型单倍体不足表现为先天性肺病(2). TTF-1主要在II型肺细胞和Clara细胞中表达,并调节这些细胞标记物的表达,即表面活性蛋白C(SPC)和Clara分泌蛋白(CCSP)(三).
肺癌是最常见的癌症类型,每年导致100多万人死亡。尽管化疗和分子靶向治疗最近取得了进展,但预后仍然很差。TTF-1在所有类型的肺癌中均有表达,但其在腺癌(72.1%)和小细胞癌(90.5%;参考文献。4).
上皮-间充质转化(EMT)是将极化上皮细胞定向为间充质细胞的分化开关,在胚胎发育过程中起着关键作用(5, 6). 通过EMT产生的间充质细胞对各种纤维化状况有显著贡献,肿瘤细胞侵袭过程也与EMT有关。除了细胞间黏附丧失外,EMT的特点是间充质标记物上调,包括纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白,以及获得成纤维细胞样迁移和侵袭表型。
最近的研究表明,包括蜗牛、Slug、δEF-1(ZEB1)和SIP1在内的几个转录因子参与了EMT的诱导(7–9). 这些转录因子抑制E-钙粘蛋白的表达,并在上皮细胞中过表达时诱导EMT。相反的过程,即间质-上皮转换(MET),已被证明发生在发育过程中,并在纤维化疾病和癌症中受到干扰。然而,与EMT相比,对于哪些信号会导致MET,目前还不太清楚。
转化生长因子-β(TGF-β)是一种调节多种细胞反应的多功能细胞因子(10). TGF-β配体的三种亚型,即TGF-α1、TGF-γ2和TGF-δ3,在包括肺在内的各种组织中表现出不同的表达模式。TGF-β与II型和I型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合并传递细胞内信号。Smad是TGF-β信号转导的主要载体;Smad2和Smad3被TGF-βI型受体磷酸化,并与Smad4形成复合物。这些复合物积聚在细胞核中并调节靶基因的转录。TGF-β抑制上皮细胞的生长,而肿瘤细胞经常对TGF-α的生长抑制活性失去反应性。此外,已知TGF-β通过多种肿瘤细胞自主和宿主-肿瘤相互作用促进肿瘤进展。TGF-β是EMT的主要介质,在肺形态发生过程中与上皮-间充质相互作用密切相关(11).
在慢性肾损伤模型中,骨形态发生蛋白-7(BMP-7)被证明可以逆转TGF-β诱导的EMT(12)这一发现鼓励我们探索在癌细胞中诱导MET的治疗策略,大多数癌细胞以“部分EMT”的中间表型状态存在,有可能经历“完全EMT”。在这里,我们研究了TTF-1在肺癌中的功能。因为据报道,TTF-1阳性是非小细胞肺癌患者良好的预后标志物(13),本研究的重点是肺腺癌。我们的结果表明,肺腺癌中TTF-1的缺失加速了EMT的进程,导致癌症的进展。
试剂和抗体。TGF-β1购自研发系统,使用浓度为1 ng/mL。抗磷酸化Smad2、磷酸化Smad1/Smad3、纤连蛋白和蜗牛抗体来自细胞信号。抗总Smad2/3、N-钙粘蛋白、E-cadherin、ZO-1和CD31抗体来自BD Pharmingen(Transduction Laboratories)。抗TTF-1抗体来自Lab Vision Corporation。抗α-微管蛋白和全细胞角蛋白抗体来自Sigma-Aldrich。LY364947来自Calbiochem,使用浓度为3μmol/L。
细胞系。A549和Lewis肺癌(LLC)细胞来自东北大学发展、衰老和癌症研究所生物医学研究细胞资源中心。NCI-H441(H441)细胞来自美国类型培养物收集。LC-2/ad细胞来自RIKEN BRC。
人TTF-1 cDNA的克隆。有两种替代的成绩单TTF-1型基因,短形式包含总转录本的90%以上(14). 我们从Lu139细胞的cDNA中克隆了短形式的开放阅读框。
相位对比和荧光显微镜。如前所述,进行了磷脂染色和免疫细胞化学分析(15). 荧光由共焦激光扫描显微镜(卡尔蔡司)检测。细胞也使用相控显微镜(Olympus)拍摄。
荧光素酶报告分析。人类E-cadherin启动子构建物由根特大学的F.van Roy博士善意提供。如前所述测定萤光素酶活性(15).
免疫印迹分析。放射免疫沉淀分析缓冲液和裂解缓冲液分别用于TTF-1和其他蛋白的免疫印迹。详细程序如前所述(16).
RNA分离和反转录-PCR。使用RNeasy(Qiagen)分离总RNA,并使用上标第一链合成系统(Invitrogen)合成第一链cDNA。使用ABI PRISM 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)和Power SYBR Green进行定量反转录-PCR(RT-PCR)分析。表达水平归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。PCR引物见补充表S1。
明胶酶谱。感染Ad-LacZ或Ad-TTF-1的细胞在无血清培养基中培养48 h,收集条件培养基。将等量的样品施加到浸有1 mg/mL明胶的10%(w/v)聚丙烯酰胺凝胶中。电泳后,凝胶用0.5%考马斯蓝染色。
伤口愈合和侵袭分析。如前所述进行伤口愈合分析(16). 按照补充信息中的描述执行视频延时成像。使用Image J软件(NIH)分析图像。
使用细胞培养插入物(BD Biosciences)进行细胞侵袭试验。胶原IC被涂覆在腔室的上侧。将细胞进行胰蛋白酶化,并在每个孔中以5×10的浓度重新接种4每口井。8小时后,去除过滤器上表面的细胞,将下表面的细胞固定在甲醇中,并用0.2%结晶紫和20%甲醇染色。
RNA干扰和寡核苷酸。使用HiPerFect试剂(QIAGEN)转染小干扰RNA(siRNA)。人TTF-1 siRNA(隐形RNAi HSS144278)和阴性对照(隐形RNAi 12935-200)购自Invitrogen。
ELISA检测。用1 N HCl酸化培养上清液10 min,然后用1.2 N NaOH/0.5 mol/L HEPES中和。然后对样品进行TGF-β2酶联免疫吸附试验(R&D系统)。
动物模型和统计分析。C57/BL6小鼠,5至6周龄,从三共实验室获得。总计1×107将100μL PBS中的细胞经皮下注射到小鼠体内。肿瘤体积通过以下等式进行近似计算,vol=(一×b条2)/2,其中vol为体积,一是长轴的长度,以及b条是短轴的长度。使用JMP6软件(SAS Institute)通过多变量方差分析对结果进行统计分析。生存率采用Kaplan-Meier方法进行分析P(P)数值通过对数秩检验计算。将切除的样品放入OCT复合物中,在干燥丙酮中冷冻,并进一步切片进行免疫组织化学。
肺腺癌细胞中TTF-1的异位表达。A549肺腺癌细胞缺乏TTF-1表达,而H441细胞内源性表达(17). 与感染编码LacZ的对照腺病毒的H441细胞相比,TTF-1(Ad-TTF-1)的腺病毒转导在A549细胞中产生的TTF-1转录物水平相似(Ad-LacZ;补充图S1A类). TTF-1位于感染Ad-TTF-1的A549细胞的细胞核中(补充图S1B类),并且在腺病毒转导后96小时诱导TTF-1的已知靶点,包括CCSP和SPC(补充图S1C类).
TTF-1抑制肺腺癌细胞的EMT。为了研究TTF-1在肺腺癌细胞中的作用,我们首先检测了A549细胞的形态学变化。TTF-1导致从细长形状到多边形或圆形外观的明显变化(图1A). 由于细胞间粘附的形成主要依赖上皮细胞中的E-cadherin系统,我们进一步探讨了TTF-1是否影响E-cadherin的表达。荧光素酶分析显示,TTF-1以剂量依赖的方式增强人类E-cadherin启动子活性(图1B). 免疫细胞化学证实,未经处理的A549细胞在低细胞密度时缺乏E-cadherin表达。当细胞增殖到较高的细胞密度时,可观察到E-钙粘蛋白染色不均匀且较弱(图1C). TTF-1的强制表达导致细胞膜或细胞质中E-cadherin的染色增强(图1C ,左下方). 这些结果表明,TTF-1可能至少部分地恢复上皮特性,并促使我们探索TTF-1对肺腺癌细胞EMT的影响。
图1。
TTF-1抑制TGF-β介导的EMT。A、,Ad-LacZ或Ad-TTF-1感染A549细胞的相差显微镜观察。B、,A549细胞中人E-cadherin荧光素酶报告分析。酒吧,标准偏差。C、,E-钙粘蛋白的免疫细胞化学研究(绿色).红色,TRITC-球蛋白;蓝色,TOTO3(细胞核)。用Ad-LacZ或Ad-TTF-1感染A549细胞48小时,再加或不加TGF-β1孵育48小时。D、,作为in处理的细胞的高倍放大C.红色,TRITC-球蛋白;蓝色,TOTO3(细胞核)。
图1。
TTF-1抑制TGF-β介导的EMT。A、,Ad-LacZ或Ad-TTF-1感染A549细胞的相差显微镜观察。B、,A549细胞中人E-cadherin荧光素酶报告分析。酒吧,标准偏差。C、,E-cadherin的免疫细胞化学(绿色).红色,TRITC-球蛋白;蓝色,TOTO3(细胞核)。用Ad-LacZ或Ad-TTF-1感染A549细胞48小时,再加或不加TGF-β1孵育48小时。D、,作为in处理的细胞的高倍放大C.红色,TRITC-球蛋白;蓝色,TOTO3(细胞核)。
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因为TGF-β已被证明在A549细胞中诱导EMT(18),我们进一步研究了有无TGF-β刺激时TTF-1的作用。与未经处理的A549细胞相比,TGF-β引发了纺锤体样或成纤维细胞样外观的剧烈形态学变化(图1C和D). 在TGF-β处理的细胞中,无论细胞密度如何,E-钙粘蛋白染色均完全消失,而阴茎倍体染色显示肌动蛋白重组明显,表明TGF-α诱导了EMT。有趣的是,TGF-β诱导的EMT明显受到异位TTF-1的抑制(图1C和D).
TGF-βI型受体抑制剂LY364947增强了E-钙粘蛋白的表达(补充图S2A类)表明阻断内源性TGF-β信号传导可诱导E-cadherin上调。除了LY364947的作用外,TTF-1还进一步增强了E-cadherin的表达(补充图S2A类). 免疫印迹进一步证实了TTF-1介导的E-钙粘蛋白上调和对TGF-β介导的EMT的拮抗作用(补充图S2B类). 除E-钙粘蛋白丢失外,EMT的特点是间充质标志物上调。TGF-β介导的纤维连接蛋白上调被TTF-1拮抗,而N-钙粘蛋白的上调没有显著影响(补充图S2B类). LY364947通过TGF-β抑制纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白的诱导,上调E-钙粘蛋白表达(补充图S2B类).
除E-cadherin外,对A549细胞进行其他上皮标记物的进一步免疫染色,即ZO-1和泛细胞角蛋白(补充图S3)。在LacZ表达细胞和TTF-1表达细胞中均观察到ZO-1表达。在LacZ转导的细胞中,TGF-β处理导致其在细胞膜上的染色减少,而TTF-1明显拮抗了这种作用。泛细胞角蛋白表达降低,但即使在TGF-β治疗后仍保持不变。
TTF-1减弱肺腺癌细胞的基质金属蛋白酶-2活性、细胞迁移和侵袭能力。EMT伴随着基质金属蛋白酶(MMP)活性的增强,促进肿瘤细胞周围细胞外基质的降解。如定量RT-PCR所示,TGF-β治疗增强了MMP-2的表达,而TTF-1抑制了这种作用(图2A). LY364947有效地阻断了TGF-β在对照细胞和TTF-1表达细胞中诱导MMP-2的作用(补充图S4A类). 明胶酶谱进一步显示,TGF-β增强了MMP-2活性,而TTF-1则抑制了这种作用(图2B).
图2。
TTF-1减弱MMP-2活性、细胞迁移和侵袭能力。A、,定量RT-PCR。TGF-β1处理后LacZ转导或TTF-1转导细胞中MMP-2的动态表达。酒吧,这些值表明了与0小时对照组LacZ表达细胞相比的倍数差异。B、,明胶酶谱。定量了活化MMP-2对明胶的消化,并指示了相对强度。分子质量标记以kDa为单位。C、 左侧,用Ad-LacZ或Ad-TTF-1感染的细胞被刮伤,并与TGF-β1一起或不与TGF-β1一起孵育72小时;正确的,伤口愈合试验的定量。24小时后,用延时视频显微镜在每组八个区域测量细胞迁移距离。酒吧,标准偏差。D、 左侧,细胞侵袭试验。迁移的细胞被结晶紫染色。正确的,侵袭试验定量。对迁移的细胞进行计数,并获得每个孔的五个随机字段的总和。每个实验一式三份进行。酒吧,标准偏差。
图2。
TTF-1减弱MMP-2活性、细胞迁移和侵袭能力。A、,定量RT-PCR。TGF-β1处理后LacZ转导或TTF-1转导细胞中MMP-2的动态表达。酒吧,这些值表明了与0小时对照组LacZ表达细胞相比的倍数差异。B、,明胶酶谱。定量了活化MMP-2对明胶的消化,并指示了相对强度。分子质量标记以kDa为单位。C、 左侧,刮除感染Ad-LacZ或Ad-TTF-1的细胞,加入或不加入TGF-β1孵育72h;正确的,伤口愈合试验的定量。24小时后,通过延时视频显微镜在每组8个场测量细胞迁移的距离。酒吧,标准偏差。D、 左侧,细胞侵袭试验。迁移的细胞被结晶紫染色。正确的,侵袭试验定量。对迁移的细胞进行计数,并获得每个孔的五个随机字段的总和。每项实验一式三份。酒吧,标准偏差。
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为了分析TGF-β诱导的EMT的功能方面和TTF-1的拮抗作用,我们进行了伤口愈合和侵袭试验。尽管TGF-β具有生长抑制作用,但治疗后细胞高度迁移,72小时后伤口更早愈合(图2C,,左上). 与LacZ转导细胞相比,TTF-1的表达导致伤口闭合延迟,反映出迁移性减弱,TGF-β治疗未能增强TTF-1转导细胞中的细胞迁移(图2C,,左下方). 这些效果通过延时电影进行量化(图2C ,对和补充视频)。
癌症侵袭的过程包括基底膜和主要由胶原蛋白组成的细胞外基质的降解。为了确定肺癌细胞的侵袭能力,我们使用了胶原IC涂层的腔室。TGF-β治疗导致腔室下表面迁移细胞数量增加。表达TTF-1的细胞通过滤膜迁移受损,TGF-β的作用被TTF-1完全拮抗(图2D,,左侧). 定量分析这些结果表明,TTF-1抑制肺腺癌细胞的侵袭能力,TGF-β未能恢复其侵袭能力(图2D ,对).
TTF-1负调节EMT相关分子的表达。在A549细胞中,异位TTF-1抑制TGF-β靶基因Smad7和PAI-1的诱导,这些靶基因受Smad通路的调节(图3A). 尽管存在这些显著差异,但TGF-β处理后Smad2或Smad3的磷酸化在对照细胞和表达TTF-1的细胞之间没有显著差异(补充图S5A类和S5B类). 接下来,我们降低了H441细胞中内源性TTF-1的表达。转染TTF-1 siRNA可有效抑制TTF-1的表达(图3B,,左侧). 在TGF-β刺激H441细胞后,TTF-1敲除导致Smad7和PAI-1的诱导增强(图3B ,对)与A549细胞的结果一致。最近的数据表明,Smad3与TTF-1发生物理相互作用,并调节TTF-1靶基因SPB的转录(19, 20). 综上所述,TTF-1抑制Smad介导的细胞核内TGF-β靶基因亚群的转录,从而抑制肺腺癌细胞中TGF-α介导的EMT。
图3。
TTF-1下调参与EMT的分子。A、,定量RT-PCR。Smad7和PAI-1的动力学表达如图2A.B、 左侧,转染模拟对照siRNA的H441细胞中TTF-1的免疫印迹(硅NTC)和用于TTF-1的siRNA(硅TTF-1). α-管蛋白被用作负荷控制。正确的,定量RT-PCR。Smad7和PAI-1的动力学表达。用si-NTC或si-TTF-1转染H441细胞,并用TGF-β1处理指定的时间段。C、 左侧,定量RT-PCR。蜗牛和鼻涕虫的动力学表达。正确的,用Ad-LacZ或Ad-TTF-1感染A549细胞,并用或不用TGF-β1处理24小时,对蜗牛进行免疫印迹。
图3。
TTF-1下调参与EMT的分子。A、,定量RT-PCR。Smad7和PAI-1的动力学表达如图2A.B、 左侧,转染模拟对照siRNA的H441细胞中TTF-1的免疫印迹(硅NTC)和用于TTF-1的siRNA(硅TTF-1). α-管蛋白被用作负荷控制。正确的,定量RT-PCR。Smad7和PAI-1的动力学表达。用si-NTC或si-TTF-1转染H441细胞,并用TGF-β1处理指定的时间段。C、 左侧,定量RT-PCR。蜗牛和鼻涕虫的动力学表达。正确的,用Ad-LacZ或Ad-TTF-1感染A549细胞,并用或不用TGF-β1处理24小时,对蜗牛进行免疫印迹。
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我们进一步探讨了TTF-1对TGF-β诱导的EMT的拮抗作用。E-cadherin的表达受多种转录因子调节,包括锌指转录阻遏物蜗牛和Slug(8). TTF-1抑制蜗牛和蛞蝓的基础表达水平,并且在TGF-β处理后它们的快速诱导也被TTF-1所抑制(图3C,,左侧). 免疫印迹也显示蜗牛表达受到抑制(图3C ,对). 尽管LY364947治疗在24小时后抑制了LacZ转导细胞中蜗牛和Slug的表达,但它并没有诱导TTF-1转导细胞的进一步减少(补充图S4B类和C类).
荧光素酶分析表明,蜗牛或Slug抑制人类E-cadherin启动子活性,拮抗TTF-1的作用以增强其活性(补充图S6A类). 此外,人蜗牛的腺病毒转导导致E-钙粘蛋白下调,N-钙粘蛋白和纤维连接蛋白上调,模拟TGF-β的作用(补充图S6B类). 这些结果支持了蜗牛和鼻涕虫参与A549细胞EMT调节的观点,正如之前在其他细胞类型中所描述的那样。
最近,血小板衍生生长因子(PDGF)信号转导(21)和胶原蛋白I(22)据报道与TGF-β诱导的EMT有关。在A549细胞中,TGF-β刺激导致PDGF-B和α1(I)胶原的诱导,而异位TTF-1阻断了这种作用(补充图S7A类和B类). 这些结果表明,TTF-1通过抑制导致EMT的一系列事件来阻断EMT并诱导上皮分化。此外,TTF-1也抑制了TGF-β治疗后CTGF的诱导(补充图S7C类). 因此,也提示TTF-1可以通过下调纤维化因子发挥抗纤维化因子在癌症和纤维化疾病中的作用。
沉默TTF-1可调节上皮表型并增强TGF-β介导的EMT。为了进一步研究TTF-1对TGF-β诱导的EMT的影响,我们敲除了H441细胞中的内源性TTF-1。在存在或不存在持续TGF-β刺激的情况下,在0和72小时转染对照或TTF-1 siRNA,并在144小时检测细胞形态(图4A)因为之前有报道称,当TGF-β长期治疗>144小时时,肺泡上皮细胞会发生EMT(23). H441细胞中TTF-1的沉默导致形态改变为扁平或细长形状,细胞与细胞的粘附减少(图4A). TGF-β治疗导致肌动蛋白应力纤维重组,而细胞间黏附持续(图4A以及补充图S8A类). TTF-1敲除和TGF-β联合处理的细胞表现出细胞间粘附受损,在低细胞密度下培养时经常发现成纤维细胞样细胞(图4A ,底部).
图4。
TTF-1的沉默增强了TGF-β介导的EMT。A、,对转染si-NTC或si-TTF-1的H441细胞进行相差显微镜观察,并与TGF-β1孵育144h。B、,定量RT-PCR。蜗牛和鼻涕虫的动力学表达如图所示图3B.C、 左侧,用si-NTC或si-TTF-1转染H441细胞,并用TGF-β1处理或不处理24小时,蜗牛的免疫印迹;正确的,E-cadherin和间充质标记物(纤维连接蛋白和蜗牛)的免疫印迹。在0和72小时用si-NTC或si-TTF-1转染H441细胞,并用或不用TGF-β1孵育144小时。
图4。
沉默TTF-1增强TGF-β介导的EMT。A、,对转染si-NTC或si-TTF-1的H441细胞进行相差显微镜观察,并与TGF-β1孵育144h。B、,定量RT-PCR。蜗牛和鼻涕虫的动力学表达如图所示图3B.C、 左边,用si-NTC或si-TTF-1转染H441细胞,并用TGF-β1处理或不处理24小时,蜗牛的免疫印迹;正确的,E-cadherin和间充质标记物(纤维连接蛋白和蜗牛)的免疫印迹。在0和72小时用si-NTC或si-TTF-1转染H441细胞,并用或不用TGF-β1孵育144小时。
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H441细胞也进行了E-cadherin、ZO-1和泛细胞角蛋白的免疫染色(补充图S8B类). H441细胞膜上E-cadherin染色清晰。与A549细胞相比,即使在TGF-β治疗后,E-cadherin的表达仍持续存在。TTF-1单独敲除并不能显著抑制其表达,但TGF-β同时治疗导致细胞间黏附丧失,E-cadherin染色显著降低。H441细胞中ZO-1染色不规则,TTF-1敲除或TGF-β处理导致其表达降低。泛细胞角蛋白表达降低,但即使在TGF-β治疗或TTF-1敲除后仍持续表达。结合A549细胞的结果,细胞角蛋白可能在具有间充质表型的肺癌细胞中持续表达,这与大多数肺癌细胞持续表达细胞角蛋白的临床结果一致。
接下来,我们研究了TTF-1敲低对TGF-β介导的蜗牛或蛞蝓的快速诱导和EMT标记物表达的影响。与A549细胞的观察结果一致(图3C),TTF-1的沉默导致蜗牛和鼻涕虫的诱导增强(图4B). 免疫印迹法也显示蜗牛的诱导增强(图4C,,左侧). 我们还研究了长期暴露(144小时)TGF-β的影响。TTF-1敲除导致蜗牛表达增强,在TTF-1被敲除的条件下,TGF-β介导的纤维连接蛋白诱导增强(图4C,,对). 这些观察结果支持TTF-1的作用,它抑制TGF-β介导的EMT。与免疫细胞化学观察结果相反(补充图S8B类)在高细胞密度培养的大量细胞中,TGF-β处理或TTF-1敲除均未显著影响E-钙粘蛋白的表达(图4C ,对). 这一结果表明,E-cadherin的表达被其他机制所保留,这些机制可能会克服高密度培养的H441细胞中TGF-β或TTF-1的作用。
TTF-1表达和TGF-β信号转导的相互调节。为了研究TGF-β对TTF-1表达的影响,我们使用了两种不同的肺腺癌细胞系H441和LC-2/ad,这两种细胞系内源性表达TTF-1。TGF-β治疗72小时可抑制两种细胞株中TTF-1 mRNA和蛋白的表达(图5A和B),用LY364947阻断TGF-β信号传导导致TGF-α抑制的TTF-1表达的恢复(图5B). 这些发现与之前的报告一致,表明接受EMT治疗的肺泡上皮细胞中TTF-1的表达降低(23).
图5。
外源性TGF-β下调TTF-1和TTF-1下调肺腺癌细胞中的TGF-α2。A、,TTF-1的定量PCR。H441或LC-2/ad细胞经或不经TGF-β1处理72h。酒吧,标准偏差。B、,TTF-1的免疫印迹。H441或LC-2/ad细胞经TGF-β1和LY364947处理72h。C、,半定量RT-PCR。将感染Ad-LacZ或Ad-TTF-1的A549细胞在有无TGF-β1的条件下培养48小时。D、,TGF-β2的ELISA检测。感染Ad-LacZ或Ad-TTF-1的A549细胞在无血清培养基中培养48 h(感染后4 d)。将细胞在替换的无血清培养基中再培养48小时(感染后6天)。酒吧,标准偏差。
图5。
外源性TGF-β下调TTF-1和TTF-1下调肺腺癌细胞中的TGF-α2。A、,TTF-1的定量PCR。H441或LC-2/ad细胞经或不经TGF-β1处理72h。酒吧,标准偏差。B、,TTF-1的免疫印迹。H441或LC-2/ad细胞经TGF-β1和LY364947处理72h。C、,半定量RT-PCR。将感染Ad-LacZ或Ad-TTF-1的A549细胞在有无TGF-β1的条件下培养48小时。D、,TGF-β2的ELISA检测。感染Ad-LacZ或Ad-TTF-1的A549细胞在无血清培养基中培养48 h(感染后4 d)。将细胞在替换的无血清培养基中再培养48小时(感染后6天)。酒吧,标准偏差。
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为了研究TTF-1对TGF-β配体表达的影响,对A549细胞中TGF-α的三种亚型进行了半定量RT-PCR。TTF-1下调TGF-β2的转录,而对照细胞和TTF-1转基因细胞之间TGF-(图5C). 在A549细胞中未检测到TGF-β3的转录物(数据未显示)。条件培养基中TGF-β2蛋白的定量进一步证实了TGF-?表达下调(图5D). 综上所述,TTF-1和TGF-β信号转导之间存在相互调节,表明自分泌TGF-α信号转导的增强加速了TTF-1表达的减少,反之亦然。
TTF-1抑制肿瘤进展体内.解决TTF-1的影响体内,我们使用了一个小鼠同基因模型。通过逆转录病毒基因转移产生稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)或TTF-1的小鼠LLC细胞,并接种到同基因C57/BL6小鼠中。GFP荧光证实了逆转录病毒转导(补充图S9A类). LLC细胞缺乏TTF-1表达,异位TTF-1位于细胞核内(补充图S9B类). TTF-1的表达导致肿瘤生长迟缓(图6A),生存率延长(图6B). 在表达TTF-1的肿瘤中,血管密度较低,表明TTF-1表达可能影响肿瘤与基质的相互作用(图6C和D).
图6。
TTF-1表达肿瘤的生长抑制。A、,将感染编码GFP或TTF-1的逆转录病毒的LLC细胞接种到C57/BL6小鼠中(n个=每组5个)。P(P)<0.05(多变量方差分析)。酒吧,东南方。B、,携带GFP表达或TTF-1表达肿瘤的小鼠的存活率。P(P)=0.068,对数秩检验。C、,GFP表达或TTF-1表达LLC细胞衍生肿瘤的血管密度。CD31阳性染色区域的百分比从每只小鼠随机选择的五个区域进行测量。该值表示每组五只小鼠的平均值。P(P)值由Student的吨测试。酒吧,标准偏差。D、,CD31免疫组织化学染色的代表性照片(红色)在每个肿瘤中。蓝色,TOTO3(细胞核)。
图6。
TTF-1表达肿瘤的生长抑制。A、,将感染编码GFP或TTF-1的逆转录病毒的LLC细胞接种到C57/BL6小鼠中(n个=每组5)。P(P)<0.05(多变量方差分析)。棒材,东南方。B、,携带GFP表达或TTF-1表达肿瘤的小鼠的存活率。P(P)=0.068,对数秩检验。C、,GFP表达或TTF-1表达LLC细胞衍生肿瘤的血管密度。CD31阳性染色区域的百分比从每只小鼠随机选择的五个区域进行测量。该值表示每组五只小鼠的平均值。P(P)值由Student的吨测试。酒吧,标准偏差。D、,CD31免疫组织化学染色的代表性照片(红色)在每个肿瘤中。蓝色,TOTO3(细胞核)。
关闭模态
在本研究中,我们发现TTF-1抑制EMT对TGF-β的反应,并恢复肺腺癌细胞的上皮表型,从而抑制细胞迁移和侵袭。TTF-1取消了TGF-β介导的蜗牛和鼻涕虫诱导,后者调节EMT基因表达模式的变化(9). 另一方面,与EMT有关的其他因子的表达谱,如δEF-1(ZEB1)和SIP1(15)、HMGA2(24)和扭曲1(25),表明它们与TGF-β介导的EMT或TTF-1在A549细胞中的作用无关(数据未显示)。TTF-1抑制TGF-β介导的EMT的机制可以用多种机制解释。一种是抑制Smad介导的EMT诱导分子的转录,如蜗牛和鼻涕虫(图3)最近的研究表明,Smad3与TTF-1发生物理相互作用并调节其转录活性(19, 20). 我们还展示了另一条途径的重要性;即TGF-β2下调对自分泌TGF-α信号的减弱(图5).
基因组分析的累积证据表明,在10%至15%的肺腺癌中,TTF-1基因扩增,并且体外研究进一步支持TTF-1作为谱系特异性癌基因的概念(26–28). 另一方面,TTF-1在其他肺腺癌亚群中的功能意义仍有待阐明,其中TTF-1表达减少或丢失。
据报道,TTF-1在高分化癌中表达较高,在低分化癌中表达相对较低(13). 根据Yatabe及其同事将肺腺癌分为终末期呼吸单位(TRU)型和非TRU型,大多数TTF-1阳性病例表现为TRU形态。相反,大多数TRU形态的腺癌TTF-1阳性(29). 这些观察结果表明,TTF-1表达缺失与腺癌分化不良有关。因此,我们认为,显示TTF-1致癌作用的最新数据并不排除TTF-1可能在另一类肺腺癌中起抑癌作用,可能与其他癌基因的突变或扩增相结合。
我们发现TGF-β抑制TTF-1的表达,而LY364947抑制了这种作用。TTF-1的表达可能由前馈机制通过TTF-1与自身启动子的结合来维持(30). 我们还表明,TTF-1可以通过下调TGF-β2来减弱TGF-α信号传导。TGF-β信号通常通过诱导不同亚型的TGF-(31). 因此,增强自分泌TGF-β信号可能会加速TTF-1表达的下降,相反,TTF-1可能会减弱自分泌TGFβ信号。由于TTF-1通过抑制EMT发挥肿瘤抑制作用,这些发现揭示了TGF-β加速肺癌进展的新途径。
TGF-β配体的三种亚型在肺分支形态发生过程中表现出不同的表达谱。虽然TGF-β1在整个间质中表达显著,但TGF-α2主要定位于发育中的远端气道上皮。TGF-β2可能对以细胞自主方式确定上皮细胞行为至关重要。TTF-1在发育中的远端气道尖端表达,可能在维持上皮极性中发挥作用。在肺腺癌细胞中,TTF-1和TGF-β信号相互调节,参与肺分支形态发生。
TTF-1表达缺失可能与腺癌分化不良有关,我们的结果表明,TTF-1抑制EMT和肺腺癌细胞的侵袭性。一些临床研究表明,TTF-1阳性是非小细胞肺癌患者良好的预后指标。综上所述,我们目前的研究揭示了TTF-1的新功能,它可以抑制癌症进展。