胰腺癌与高死亡率和不良预后相关,部分原因是已知其在疾病进展早期转移。一些研究表明MUC1糖蛋白有助于胰腺癌的生长和转移。免疫组化检测的90%以上胰腺肿瘤中检测到MUC1蛋白(1)蛋白质组分析显示胰腺癌患者的胰液中,以及大多数胰腺癌细胞系中(2, 3). 唾液酸化MUC1在侵袭性和转移性胰腺癌细胞中过度表达,但在正常胰腺或慢性胰腺炎或胰腺导管增生病例中不表达(4). 我们实验室以前的研究已经证实MUC1在胰腺癌侵袭和转移中的作用(5, 6).
MUC1是一种I型跨膜蛋白,由一个由黏蛋白型串联重复序列组成的大细胞外亚单位和一个较小的亚单位组成,该亚单位包括一个小细胞外结构域和一个跨膜结构域以及一个72氨基酸胞质尾部(MUC1CT)。这两个亚单位是由单个前体多肽链的细胞内自催化蛋白水解裂解产生的(7——9). 较大的细胞外亚单位由O(运行)-20个氨基酸的糖基化串联重复单元,在不同等位基因中重复18到100次以上(10——12).
MUC1CT被磷酸化并参与不同的信号通路(13). 初步研究表明MUC1CT磷酸化的变化与细胞粘附的差异相关(14——17). MUC1CT中的SXXXXXSSL基序与β-catenin相互作用,并可能与E-cadherin竞争与β-catanin的结合(第18页,第19页). 这种相互作用被DRSPYEV序列的酪氨酸突变为苯丙氨酸而消除,DRSPYEKV序列是一个被c-Src、表皮生长因子受体(EGFR)或Lyn激酶磷酸化的位点。MUC1CT的一个片段与β-catenin一起易位到细胞核,并可能影响其作为转录辅激活子的活性(19). 磷酸化YEV被认为是Src SH2结构域的结合位点(20). MUC1CT中YTNP序列中酪氨酸的磷酸化被假定为增强与衔接蛋白Grb2及其相关的小G蛋白激活剂SOS的结合,为Ras及其效应器提供了潜在的激活机制(21, 22). 因此,有大量证据表明MUC1CT的磷酸化调节与增殖和转移相关的信号传导。
先前对MUC1磷酸化的研究基于特定酪氨酸残基突变结构的表达,以及通过抗磷酸化酪氨酸抗体的Western blot分析MUC1CT上所有酪氨酸残基磷酸化程度的变化。在这里,我们通过基于质谱(MS)的MUC1CT序列分析直接评估了胰腺癌细胞系中MUC1的磷酸化状态,这揭示了MUC1CT中HGRYVPP序列上的一个新的酪氨酸磷酸化位点。我们发现血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ)是一种定位激酶,用PDGF-BB刺激胰腺癌细胞株S2-013.MUC1F可增强MUC1CT的磷酸化,增加MUC1CT及其相关伙伴β-连环蛋白的核定位,增强S2-013.MUC1F细胞的侵袭性,但不显著影响其增殖率。这些位点的酪氨酸到苯丙氨酸突变显著降低了MUC1CT的核定位和细胞的侵袭性,而酪氨酸残基到谷氨酸的突变增强了核定位和侵袭性。这些结果提供了令人信服的证据,证明PDGFRβ介导的MUC1CT磷酸化调节胰腺癌细胞的侵袭性。
细胞和试剂。Panc1来自美国类型培养物收集。S2-013是来源于肝转移瘤的人胰腺癌细胞系(SUIT-2)的克隆亚系(23). 针对MUC1CT的亚美尼亚仓鼠单克隆抗体(mAb)CT2由Sandra J.Gendler博士(亚利桑那州斯科茨代尔市梅奥诊所)提供。抗β-肌动蛋白单克隆抗体购自Sigma。辣根过氧化物酶(HRP)结合的AffiniPure山羊抗阿曼仓鼠IgG(H+L)购自Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.。针对PDGFRβ激酶插入域的兔多克隆IgG已在别处描述(24). HRP结合兔抗羊IgG购自Pierce。重组人PDGF-BB购自PeproTech。重组活性PDGFRβ和c-Src购自Upstate Cell Signaling Solutions。MUC1F-wt,MUC1。F类HPM(在YHPM具有突变为苯丙氨酸的酪氨酸)、MUC1。F类VPP(在YVPP处酪氨酸突变为苯丙氨酸),MUC1。E类HPM(YHPM位点的酪氨酸突变为谷氨酸)和MUC1。E类使用QuikChange II XL site-Directed Mutagenesis kit(Stratagene)创建VPP(在YVPP位点有酪氨酸突变为谷氨酸),并在pLNCX1.1中克隆。
细胞培养。如前所述,培养S2-013细胞系(S2-013.MUC1F)、Panc1细胞系(Panc1.MUC1F(25). HPAF-2细胞保存在Eagle's MEM(Life Technologies,Inc.)中,并在类似条件下补充10%热灭活胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、丙酮酸钠和青霉素/链霉素。为了表达MUC1F-wt和突变MUC1构建物,逆转录病毒转导基本上如前所述(26).
蛋白质印迹和免疫沉淀。在1×SDS-PAGE缓冲液(1 g/L SDS,3 g/L Tris碱,14.4 g/L甘氨酸)中,在10%或14%Novex Tris-甘氨酸变性聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上解析细胞裂解物蛋白。如前所述进行蛋白质印迹和免疫沉淀(19).
体外激酶分析。10μL反应缓冲液中的肽(1μg)[PDGFRβ反应缓冲液:40 mmol/L MOPS(pH 7.5),1 mmol/L-EGTA;Src反应缓冲液2,25 mmol/L氯化锰2将2 mmol/L EGTA、0.25 mmol/L-原钒酸钠、2 mmol/L DTT]与10μCi[γ-32P] ATP和500ng活性人重组PDGFRβ或20单位活性人重组c-Src。通过在还原SDS样品缓冲液中煮沸样品来停止反应。样品在16%Tricine凝胶上溶解。然后干燥凝胶并通过磷光成像仪分析。
MUC1CT的串联质谱分析。来自细胞裂解物的免疫沉淀MUC1CT或在体外磷酸化MUC1CT肽在14%Novex Tris-glycine变性聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上溶解并银染,然后按照公开的方法切除和消化MUC1CT相应的条带(27). 用电喷雾电离Q-TOF Ultima串联质谱仪(微粒/水)分析洗脱后的肽。使用以下变量的数据依赖性采集进行分析:1秒调查扫描(380–1900 Da),然后以8000 Da的质量分辨率进行三次2.4秒MS/MS采集(60–1900 Da)。使用双质子化Glu纤维蛋白肽的片段离子质量校准仪器。
使用MassLynx软件(Micromass)处理MS/MS数据,生成峰值列表,输入搜索引擎MASCOT(矩阵科学),并根据国家生物技术信息中心非冗余数据库进行搜索。搜索变量如下:质量准确度0.1 Da、酶特异性胰蛋白酶、固定修饰羧氨基甲基半胱氨酸和可变修饰氧化蛋氨酸。蛋白质鉴定基于随机概率分数,最小值为25。
免疫荧光显微镜。细胞在4.5×10的玻璃盖玻片(Fisherbrand显微镜盖玻片:12-545-100 18CIR-1)上培养5用无血清培养基冲洗细胞一次,无血清24小时,然后用PDGF-BB(50 ng/mL)处理2小时或在无血清培养液中不处理细胞。免疫荧光染色如前所述(19).
基质侵入试验。 体外如前所述,使用Biocoat Matrigel侵入室(Becton Dickinson Labware)检测PDGF-BB刺激下细胞的侵袭潜能(6). 电池(5×104)接种于双结构基质凝胶室的上腔。下室含有DMEM,含或不含50 ng/mL PDGF-BB或1%FBS。
肿瘤生长研究。先天性无胸腺雌性国家癌症研究所裸鼠(NCr-努/努)从国家癌症研究所购买。将动物保持在无致病条件下,并喂以无菌水和食物随意。根据机构动物护理和使用委员会指南对小鼠进行治疗。电池(1×105)如前所述,用于将细胞原位注射到裸鼠胰腺中(5). 老鼠(12——14)用于每种细胞类型。术后4周后测量肿瘤大小。从处死的小鼠上解剖、固定和切片内脏器官,包括肺、肝和所有可触及的肠系膜和纵隔淋巴结。在量化转移数量之前,通过用H&E染色组织切片来确认解剖器官内的转移。
统计分析。结果表示为三到五个独立实验的平均值±SE,每个实验重复三次。非参数Kruskal-Wallis检验用于比较细胞系之间的差异。如果整体Kruskal-Wallis检验表明细胞系存在差异,则对每一个感兴趣的成对比较进行Wilcoxon秩和检验。使用社会科学统计软件包或Windows 8.2版统计分析系统(SAS Institute)进行分析。学生的t吨适当时进行测试。P(P)<0.05被认为是显著的。
小说的识别体内MUC1磷酸化位点。使用两个稳定表达FLAG表位标记的全长MUC1(分别为Panc1.MUC1F和S2-013.MUC1F)的人胰腺癌细胞系Panc1和S2-013,来表征MUC1的磷酸化状态。Panc1是一种分化差的人胰腺癌细胞系,表达低水平内源性MUC1和相对低水平的其他糖蛋白(28). S2-013是一种中度分化的人类胰腺癌细胞系,已知其表达丰富O(运行)-糖基化粘蛋白样蛋白,包括低水平的内源性MUC1(23). 编码MUC1的FLAG表位标记形式的cDNA构建物已在前面描述(12).
用CT2免疫沉淀S2-013.MUC1F和Panc1.MUC1F的细胞裂解物,CT2是一种针对含有MUC1CT COOH末端17氨基酸的肽的单克隆抗体,用SDS-PAGE分离,并用MS兼容银染程序进行银染。将重复凝胶进行Western blot并用CT2抗体进行检测。通过与平行Western blotting实验获得的条带进行比较,在~30 kDa时鉴定出MUC1CT的银染条带。从凝胶中切下这些条带,进行凝胶内胰蛋白酶消化,并通过串联质谱分析以鉴定磷酸化位点。在重复实验中,我们检测到整个MUC1CT的胰蛋白酶片段,并在Panc1.MUC1F和S2-013.MUC1F细胞的YVPPSSTDRSPYEK肽片段中的第一个酪氨酸残基处观察到一个新的磷酸化位点(图1A和B). 在这些分析中,我们没有检测到任何其他酪氨酸残基的磷酸化(尽管检测到一些丝氨酸残基磷酸化,这将是另一份报告的主题)。
图1。
的MS/MS光谱体内磷酸化pYVPPSSTDRSPYEK。从Panc1.MUC1F和S2-013细胞中获得的MUC1CT免疫沉淀在SDS-PAGE上进行解析并进行银染,切除适当的条带并进行胰蛋白酶消化和串联质谱分析以确定磷酸化位点。来自Panc1.MUC1F细胞的pYVPPSTDRSPYEK的MS/MS光谱(A类)和S2-013.MUC1F电池(B).
图1。
的MS/MS光谱体内磷酸化pYVPPSSTDRSPYEK。从Panc1.MUC1F和S2-013细胞中获得的MUC1CT免疫沉淀在SDS-PAGE上进行解析并进行银染,切除适当的条带并进行胰蛋白酶消化和串联质谱分析以确定磷酸化位点。Panc1.MUC1F细胞pYVPPSSTDRSPYEK的MS/MS谱(A类)和S2-013.MUC1F电池(B).
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用基序扫描程序鉴定相应的激酶。由于在HGRYVPP位点磷酸化酪氨酸的激酶未知,因此使用Scansite评估MUC1CT序列,6
一种基于同源性的算法,用于搜索可能被特定蛋白激酶磷酸化的蛋白质中的基序(29). 蛋白质激酶的最佳磷酸化位点是通过确定氨基酸在每个位置相对于磷酸化位点的选择性值矩阵来预测的,这是通过定向肽库技术确定的。Scansite项目确定PDGFRβ是HGRYVPP位点酪氨酸残基的潜在激酶(得分:0.3498)。为了进行比较,Scansite在DRSPYEV基序上鉴定了酪氨酸的c-Src SH2结构域亲和力(分数:0.2045),这是该位点的已知激酶。在中度或高度严格的搜索中都没有发现这些位点的其他激酶。PDGFRβ和c-Src均在低严格性条件下鉴定。
体外激酶分析。为了测试PDGFRβ磷酸化HGRYVPP处MUC1CT的预测在体外用重组人PDGFRβ和跨越MUC1CT的合成肽进行激酶分析。通过SDS-PAGE解析这些分析的反应,将其干燥并在磷光成像仪屏幕上成像。
MUC1CTp-66型(图2A,,顶部)是一种跨越MUC1CT大部分区域的66肽,由重组人PDGFRβ磷酸化,由在体外激酶测定(图2A,,左下方). 蛋白酪氨酸激酶底物Raytide EL也被重组PDGFRβ磷酸化,用作阳性对照。作为第二个控制,我们做到了在体外用重组c-Src进行激酶分析,其也催化MUC1CT的磷酸化(图2A ,右下角).
图2。
体外PDGFRβ对MUC1CT的磷酸化。A、,MUC1CTp-66是一种与人MUC1的细胞质尾部相对应的66位合成肽。MUC1CTp-1、MUC1CTp-2和MUC1CTp3是三个重叠的肽,共同跨越人类MUC1的整个细胞质尾部区域。每个肽都设计为跨越包含一个或两个酪氨酸的序列,并在每个重叠中包含一个或者两个酪酸,从而将MUC1CT中的所有七个酪氨酸包含在三个肽中。自动射线照片来自32P标记在体外MUC1CT肽与PDGFRβ的激酶反应(左下角)和c-Src(右下角). MS分析证实了磷酸化底物肽。蛋白质酪氨酸激酶底物Raytide EL被用作酪氨酸激酶活性的对照。B到D中,MUC1CTp-66肽磷酸化在体外PDGFRβ激酶测定(B和C类)或c-Src(D类)通过串联质谱测序,并在DTpYHPMSEYPTYHTHGR显示磷酸化(B)和pYVPPSSTDRSPYEK,通过PDGFRβ(C类). MUC1CTp-66在YVPPSSTDRSPpYEK被c-Src磷酸化(D类).
图2。
体外PDGFRβ对MUC1CT的磷酸化。A、,MUC1CTp-66是一种与人MUC1的细胞质尾部相对应的66位合成肽。MUC1CTp-1、MUC1CTp-2和MUC1CTp3是三个重叠的肽,共同跨越人类MUC1的整个细胞质尾部区域。每个肽都设计为跨越包含一个或两个酪氨酸的序列,并在每个重叠中包含一个或者两个酪酸,从而将MUC1CT中的所有七个酪氨酸包含在三个肽中。自动射线照片来自32P标记在体外MUC1CT肽与PDGFRβ的激酶反应(左下角)和c-Src(右下角). MS分析证实了磷酸化底物肽。使用蛋白酪氨酸激酶底物Raytide EL作为酪氨酸激酶活性的对照。B到D中,MUC1CTp-66肽磷酸化在体外PDGFRβ激酶测定(B和C类)或c-Src(D类)通过串联质谱测序,并在DTpYHPMSEYPTYHTHGR显示磷酸化(B)和pYVPPSSTDRSPYEK,通过PDGFRβ(C类). MUC1CTp-66在YVPPSSTDRSPpYEK被c-Src磷酸化(D类).
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为了进一步评估重组PDGFRβ磷酸化MUC1CT的区域,在体外用横跨整个MUC1CT的三个重叠肽进行激酶分析:MUC1CTp-1(30位肽)、MUC1CTp-2(32位肽)和MUC1CTp3(29位肽)。这些肽编码的序列如所示图2AHGRYVPP序列仅包含在MUC1CTp-2片段中。重组PDGFRβ磷酸化MUC1CTp-1和MUC1CTp-2;然而,MUC1CTp-3未被PDGFRβ磷酸化(图2A).
MS分析在体外磷酸化MUC1CTp-66。MS序列分析在体外PDGFRβ-磷酸化MUC1CTp-66显示了两个磷酸化位点:RDTYHPM的酪氨酸(图2B)和HGRYVPP(图2C)MUC1CT中。此外,DRSPYEV处的酪氨酸被c-Src磷酸化(图2D). 我们还进行了在体外用重组人EGFR和c-Met(肝细胞生长因子受体)进行检测,其在YVPP位点没有磷酸化MUC1,但磷酸化了另一份报告的主题的其他位点(数据未显示)。
PDGFRβ介导体内MUC1CT的磷酸化。S2-013.MUC1F细胞的标记[32P] 与未刺激细胞相比,50 ng/mL PDGF-BB刺激后的正磷酸盐诱导MUC1CT磷酸化显著增加(图3A). PDGFR特异性磷酸化抑制剂AG1295(10μmol/L;图3A). 磷酸化的刺激取决于PDGF-BB孵育的持续时间,因为当细胞分别处理15分钟、30分钟和1小时时,放射自显影图上磷酸化MUC1CT带的强度增加(图3B和C).
图3。
体内PDGFRβ对MUC1的磷酸化。A、,将血清饥饿的S2-013。MUC1F细胞与[32P] 在存在或不存在人重组PDGF-BB(50 ng/mL)或PDGF抑制剂AG1295(10μmol/L)的情况下使用正磷酸盐(250μCi/mL)。免疫沉淀物(IP(IP))用单克隆抗体CT2在14%SDS-PAGE上进行解析并进行免疫印迹(国际银行)带CT2(底部)然后对膜进行放射自显影(顶部).B、,S2-013.MUC1F细胞经PDGF-BB(50 ng/mL)和[32P] 增加周期(15分钟、30分钟和1小时)的正磷酸盐(250μCi/mL),以未刺激细胞作为对照(顶部).底部,同时进行Western blotting实验以确定免疫沉淀MUC1CT的数量。代表性实验重复三次。C、,每个波段的平均像素强度根据MUC1CT波段中的像素强度进行了归一化,并绘制了与未刺激细胞相比的倍增曲线。D中,核能(N个)和细胞质(C类)MUC1CT在YVPP和YHPM位点酪氨酸磷酸化的定位通过磷酸化位点特异性抗体的Western blotting测定。用抗MUC1CT(CT2mAb)、组蛋白2B的抗体重新处理聚偏二氟乙烯膜(过氧化氢)是核蛋白的标记,β-肌动蛋白是蛋白质负荷的控制因素。
图3。
体内PDGFRβ磷酸化MUC1。A、,将血清饥饿的S2-013。MUC1F细胞与[32P] 在存在或不存在人重组PDGF-BB(50 ng/mL)或PDGF抑制剂AG1295(10μmol/L)的情况下使用正磷酸盐(250μCi/mL)。免疫沉淀物(IP(IP))用单克隆抗体CT2在14%SDS-PAGE上进行解析并进行免疫印迹(国际银行)带CT2(底部)然后对膜进行放射自显影(顶部).B、,S2-013.MUC1F细胞经PDGF-BB(50 ng/mL)和[32P] 增加周期(15分钟、30分钟和1小时)的正磷酸盐(250μCi/mL),以未刺激细胞作为对照(顶部).底部,同时进行Western blotting实验以确定免疫沉淀MUC1CT的数量。重复三次的实验代表。C、,每个波段的平均像素强度根据MUC1CT波段中的像素强度进行了归一化,并绘制了与未刺激细胞相比的倍增曲线。D中,核能(N个)和细胞质(C类)MUC1CT在YVPP和YHPM位点酪氨酸磷酸化的定位通过磷酸化位点特异性抗体的Western blotting测定。用抗MUC1CT(CT2 mAb)、组蛋白2B的抗体重制聚偏二氟乙烯膜(过氧化氢)是核蛋白的标记,β-肌动蛋白是蛋白质负荷的控制因素。
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PDGF刺激导致YVPP和YHPM基序中酪氨酸磷酸化MUC1CT的核定位。我们在YVPP和YHPM位点制备了磷酸化酪氨酸的兔多克隆抗体,通过ELISA和Western blotting分析验证了这些位点磷酸化的66位MUC1CT肽的特异性(未磷酸化的66-位MUC1C肽用作对照;数据未显示)。这些抗体用于评估PDGF刺激对MUC1CT中这些位点磷酸化的影响。PDGF-BB刺激的S2-013细胞核和细胞质提取物的Western blotting分析显示,YVPP和YHPM基序中酪氨酸磷酸化显著增加,这与PDGF刺激持续时间的增加一致,并且主要在细胞核部分观察到(图3D). 独立细胞裂解物的MS分析证实了磷酸化,但不是定量方法(数据未显示)。抗pYVPP抗体呈单条带;然而,抗pYHPM抗体观察到两条带,其外观取决于PDGF刺激的持续时间。这两条带可能代表YHPM和YVPP基序中一个或两个酪氨酸磷酸化的不同MUC1CT片段,或仅在YHPM基序中磷酸化的酪氨酸,但显示出不同的迁移性,这可能是因为此时未定义的其他翻译后修饰。
PDGF-BB刺激增强了β-连环蛋白和MUC1CT的核定位。我们评估了PDGFRβ介导的MUC1CT磷酸化对β-catenin共定位的影响。用CT2单克隆抗体(针对MUC1CT)和抗β-catenin单克隆抗体对S2-013进行免疫荧光分析。用50 ng/mL PDGF-BB处理MUC1F细胞2 h(30). 将MUC1CT和β-catenin的定位模式与血清饥饿的S2-013.MUC1F细胞进行比较。
血清饥饿的S2-013。MUC1F细胞在细胞外围显示MUC1CT和β-连环蛋白的定位(图4A,,顶部). 部分但非全部MUC1和β-catenin在外周共定位;推测细胞连接处的β-catenin与E-cadherin共定位(31)MUC1存在于细胞区域而非这些连接处。PDGF-BB刺激诱导β-连环蛋白的广泛核定位以及MUC1CT的细胞核和弥漫性细胞质染色(图4A ,底部). 这些结果表明PDGFRβ介导的MUC1CT磷酸化增强了MUC1CT的核定位。
图4。
A、,PDGF-BB刺激对S2-013.MUC1F细胞中β-catenin和MUC1CT亚细胞定位的影响。S2-013.MUC1F细胞在与单克隆抗体CT2、抗β-连环蛋白和核染料碘化丙啶孵育前,血清饥饿24 h,刺激2 h或保持未刺激状态,固定并渗透。依次采集每次扫描的荧光信号。mAb CT2(anti-MUC1CT)显示为蓝色,并用Cy5偶联二级抗体检测,mAb anti-β-catenin用FITC-偶联二级抗原识别,显示为绿色,细胞核显示为红色。白色箭头,蓝色、绿色和红色的三倍大(MUC1CT/β-连环蛋白/细胞核)在缺血清条件下,MUC1CT和β-catenin在细胞表面共定位。B、,酪氨酸突变对MUC1核定位的影响。S2-013.MUC1。F类HPM,S2-013.MUC1。E类HPM,S2-013.MUC1。F类VPP和S2-013.MUC1。E类VPP细胞进行MUC1CT(单抗CT2)和细胞核[碘化丙啶]染色(圆周率)].酒吧,25微米。放大倍数,×63。结果代表三到四个单独的细胞扫描观察结果。
图4。
A、,PDGF-BB刺激对S2-013.MUC1F细胞中β-catenin和MUC1CT亚细胞定位的影响。S2-013.MUC1F细胞在与单克隆抗体CT2、抗β-连环蛋白和核染料碘化丙啶孵育前,血清饥饿24 h,刺激2 h或保持未刺激状态,固定并渗透。连续采集每次扫描的荧光信号。mAb CT2(anti-MUC1CT)显示为蓝色,并用Cy5偶联二级抗体检测,mAb anti-β-catenin用FITC-偶联二级抗原识别,显示为绿色,细胞核显示为红色。白色箭头,蓝色、绿色和红色的三倍大(MUC1CT/β-连环蛋白/细胞核)在缺血清条件下,MUC1CT和β-catenin在细胞表面共定位。B、,酪氨酸突变对MUC1核定位的影响。S2-013.MUC1。F类HPM,S2-013.MUC1。E类HPM,S2-013.MUC1。F类VPP和S2-013.MUC1。E类VPP细胞进行MUC1CT(单抗CT2)和细胞核[碘化丙啶]染色(圆周率)].酒吧,25微米。放大倍数,×63。结果代表三到四个单独的细胞扫描观察结果。
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为了证实YHPM和YVPP基序中的磷酸化酪氨酸有助于MUC1CT的核定位,对克隆到pLNCX1逆转录病毒表达载体中的MUC1CT YHPM及YVPP模序产生了磷酸化介导(Y至F)和磷酸化微扰(Y至E)突变。用单克隆抗体CT2进行Western blotting,检测逆转录病毒转导的S2-013细胞是否稳定表达重组MUC1蛋白。这些S2-013转染体命名为S2-013.MUC1。F类HPM,S2-013.MUC1。E类HPM,S2-013.MUC1。F类VPP和S2-013.MUC1。E类VPP用于评估血清缺乏和PDGF-BB刺激条件下MUC1CT的核定位。如预期,S2-013.MUC1。F类HPM和S2-013.MUC1。F类表达失活突变的VPP细胞显示出MUC1CT在细胞外周的显著定位,而PDGF-BB的刺激对其没有显著影响(图4B). S2-013.MUC1。E类HPM和S2-013.MUC1。E类表达激活突变的VPP细胞显示出MUC1的显著结构核定位,即使在缺乏血清的条件下(图4B).
PDGFRβ介导的MUC1磷酸化增强胰腺癌细胞的侵袭性。MUC1的过度表达、MUC1CT和β-catenin的核定位增强与不同腺癌的转移增加和预后不良相关。因此,进行Matrigel侵袭试验以评估PDGFRβ介导的MUC1磷酸化对胰腺癌细胞侵袭性的影响(图5). S2-013.MUC1F细胞与S2-013.CT3相比侵袭率显著升高(P(P)<0.0001)或S2-013.Neo细胞(P(P)< 0.0001;图5). 含有S2-013细胞的细胞质尾切MUC1的侵袭潜能与对照转染细胞无显著差异(P(P)> 0.3). 与未刺激细胞相比,用PDGF-BB(50 ng/mL)刺激S2-013.MUC1F可显著增强这些细胞的侵袭力(P(P)< 0.02). PDGF-BB介导的S2-013.MUC1F细胞侵袭潜能的增加通过PDGFRβ激酶抑制剂(10μmol/L)处理细胞来消融。PDGF-BB刺激对S2-013.CT3和S2-013的侵袭潜能没有显著影响(P(P)分别为0.3和0.7)。
图5。
PDGF-BB对载体对照转染的S2-013细胞基质胶侵袭的影响(S2-013.新),细胞质尾切(S2-013.CT3号机组),或MUC1的全长构造(S2-013.MUC1F型). 在含有或不含PDGF-BB(50 ng/mL)的培养24小时后,通过Matrigel和8-μm孔膜侵入S2-013细胞的数量。电池(5×104)在上面的隔间里播种。下室含有含有或不含PDGF-BB的DMEM(50 ng/mL)。柱,三次独立实验侵入细胞数的平均值;酒吧,东南方。
图5。
PDGF-BB对转染载体控制的S2-013细胞基质侵袭的影响(S2-013.新),细胞质尾切(S2-013.CT3号机组),或MUC1的全长构建体(S2-013.MUC1F型). 在含有或不含PDGF-BB(50 ng/mL)的培养24 h后,通过Matrigel和8-μm孔膜侵入S2-013细胞的数量。电池(5×104)在上面的隔间里播种。下室含有含有或不含PDGF-BB的DMEM(50 ng/mL)。柱,三次独立实验侵入细胞数的平均值;酒吧,东南方。
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MUC1CT的YHPM和YVPP基序中酪氨酸在S2-013.MUC1F细胞侵袭潜能中的作用。在观察到PDGF-BB刺激增加了MUC1表达细胞的侵袭性后,我们试图确定MUC1CT的YHPM和YVPP基序中磷酸酪氨酸对MUC1表达的细胞侵袭性的作用。表达这些基序失活和激活突变的细胞株(S2-013.MUC1)。F类HPM,S2-013.MUC1。E类HPM,S2-013.MUC1。F类VPP和S2-013.MUC1。E类VPP)和对照细胞(S2-013.MUC1F和S2-013.Neo)在基质胶侵袭测定中进行评估。S2-013细胞表达磷酸化引发的酪氨酸突变(S2-013.MUC1)。F类HPM或S2-013.MUC1。F类VPP)降低在体外与S2-013.MUC1F细胞相比,这些残基有助于S2-013.MUC1F细胞的侵袭性(两者都有P(P)< 0.001;图6A). 相比之下在体外通过表达磷酸化修饰酪氨酸突变(S2-013.MUC1)的S2-013细胞观察到侵袭性。E类HPM或S2-013.MUC1。E类VPP)与S2-013.MUC1F电池进行比较(P(P)<0.05和0.001;图6A).
图6。
MUC1CT酪氨酸突变对侵袭和转移的影响。A、,MUC1CT酪氨酸突变对在体外基质入侵。细胞接种到无血清DMEM的上腔,而下腔含有含1%FBS的DMEM。B、,酪氨酸突变对体内肿瘤生长率。电池(1×105)将小鼠原位移植到裸鼠体内,于第4周末处死小鼠后切除肿瘤并测量肿瘤大小。柱,根据两个最大横截面的乘积得到的面积单位绘制的平均肿瘤直径;酒吧,SE.酪氨酸突变对淋巴结的影响(C类)和肺转移(D类). 通过显微镜观察原位移植的裸鼠雌性裸鼠的H&E染色组织切片来检测转移的发生率。在原位植入酪氨酸突变体或MUC1F或模拟载体表达的S2-013细胞的第4周后处死小鼠。柱,通过福尔马林固定和H&E染色的组织切片的显微镜检查计数转移所确定的平均转移数量;酒吧,东南部*,P(P)<0.05,与S2-013.MUC1F细胞相比;***,P(P)<0.001,与S2-013.MUC1F细胞相比。水平线上的星号,直线下方竖线所代表的单元格事件的统计显著性。
图6。
MUC1CT酪氨酸突变对侵袭和转移的影响。A、,MUC1CT酪氨酸突变对在体外基质入侵。细胞接种到无血清DMEM的上腔,而下腔含有含1%FBS的DMEM。B、,酪氨酸突变对体内肿瘤生长率。电池(1×105)将小鼠原位移植到裸鼠体内,于第4周末处死小鼠后切除肿瘤并测量肿瘤大小。柱,根据两个最大横截面的乘积得到的面积单位绘制的平均肿瘤直径;酒吧,SE.酪氨酸突变对淋巴结的影响(C类)和肺转移(D类). 通过显微镜观察原位移植的裸鼠雌性裸鼠的H&E染色组织切片来检测转移的发生率。在原位植入酪氨酸突变体或MUC1F或模拟载体表达的S2-013细胞的第4周后处死小鼠。柱,通过福尔马林固定组织切片和H&E染色组织切片的显微镜检查来计算转移瘤的平均数量;酒吧,东南部*,P(P)与S2-013.MUC1F细胞相比<0.05;***,P(P)<0.001,与S2-013.MUC1F细胞相比。水平线上的星号,直线下方竖线所代表的单元格事件的统计显著性。
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我们通过裸鼠原位注射评估了这些MUC1酪氨酸突变对S2-013.MUC1细胞致瘤和转移潜能的影响。4周后处死小鼠。术后4周后分析平均肿瘤大小(图6B). S2-013.MUC1。E类HPM和S2-013.MUC1。E类VPP细胞的肿瘤比S2-013.MUC1F大,而S2-013.MUC1大。F类HPM和S2-013.MUC1。F类VPP显示肿瘤较小;然而,这些差异并没有达到统计学意义(图6B). 对处死小鼠的内脏和淋巴结进行解剖、固定、切片,并用H&E染色,以确定和量化转移。移植S2-013.MUC1的小鼠淋巴结转移的发生率显著降低。F类HPM和S2-013.MUC1。F类VPP细胞与S2-013.MUC1F的比较(P(P)分别<0.05和0.001;图6C). 小鼠植入S2-013.MUC1。E类与S2-013相比,HPM的淋巴结转移率明显较高。MUC1F(P(P)< 0.05). 关于肺转移,只有小鼠植入S2-013.MUC1。F类HPM显示出统计显著差异(减少;P(P)< 0.05;图6D). 肝脏和膈肌转移的发生率没有显著差异(数据未显示)。
蛋白质组学方法用于鉴定胰腺肿瘤细胞产生的MUC1CT上的酪氨酸磷酸化位点。在两种不同的人胰腺癌细胞S2-013.MUC1F和Panc1.MUC1F中观察到HGRYVPP序列的酪氨酸磷酸化,表明这种修饰与胰腺癌有关。这是第一份关于该位点磷酸化的报告,第一份通过MS直接显示MUC1CT上酪氨酸磷酸化位点的报告,以及第一份通过使用位点特异性抗体确认这些发生的报告(以前的研究使用突变结构,并显示总磷酸化减少)。
我们检测并测序了跨越整个细胞质尾部的肽,这表明此处使用的蛋白质组学方法足够敏感,可以检测MUC1CT中的多种肽。我们未能检测到除HGRYVPP外的酪氨酸位点的磷酸化,这增加了在此处分析的生长条件下培养的胰腺癌细胞主要磷酸化HGRYVPN处的酪氨酸的可能性,并且其他位点的磷酸化度受到高度调节。仍有可能,提取物中存在其他低水平的修饰,而此处使用的技术无法检测到这些修饰。先前报告DRSPYEV磷酸化的结果是从乳腺癌细胞系或来自其他器官部位的细胞系中获得的,这提出了另一种可能性:MUC1CT的磷酸化存在器官特异性或细胞特异性差异,反映了这些细胞中受体酪氨酸激酶或磷酸酶的表达或活性的差异。在这方面,值得注意的是,我们在DRSPYEV位点检测到酪氨酸磷酸化在体外由c-Src提供(图2). 无论如何,应该进一步明确MUC1CT上被不同正常和肿瘤细胞类型磷酸化的特定位点。
Scansite算法分析显示PDGFRβ是一种假定的激酶,催化HGRYVPP位点的磷酸化。体外用MUC1CTp-66(MUC1CT的一种66位合成肽)进行的激酶分析清楚地表明PDGFRβ磷酸化了MUC1CT(图2A)随后的分析表明,MUC1CT中RDTYHPM和HGRYVPP序列的酪氨酸被磷酸化在体外PDGFRβ(图2B–D). 值得注意的是,Wreschner等人之前预测了PDGFR在RDTYHPM序列中酪氨酸的磷酸化(32). Wang等人(33)之前提出的证据表明,在CD8抗体刺激下,使用苯丙氨酸替代突变体和抗磷酸酪氨酸抗体检测磷酸化,CD8/MUC1嵌合蛋白合成的CD8/MUCl嵌合蛋白中RDTYHPM基序的酪氨酸磷酸化。值得注意的是,这两个位点都位于MUC1CT的一个区域内,该区域被假设为与p53相关(34).
我们在代表胰腺癌不同分化状态的多个人类胰腺癌细胞系中检测到PDGFRβ的显著表达,并检测到FG、Colo357和Capan-2中YVPP基序中酪氨酸的磷酸化(数据未显示)。PDGFB、PDGFRα和PDGFRβ在胰腺癌中高度表达,并参与调节胰腺腺泡细胞增殖的信号级联,在胰腺癌和其他癌症的导管细胞致癌过程中起关键作用(35——38).
我们观察到,用PDGF-BB(PDGFRβ的配体)刺激S2-013.MUC1F细胞时,MUC1CT磷酸化增强,这支持PDGFR?刺激影响MUC1介导的信号传导的假设。PDGFR特异性激酶抑制剂酪蛋白(AG1295)可消除这种磷酸化增强,该抑制剂已被用于特异性消除PDGFR的激活(39——42). 酪蛋白在治疗增殖性玻璃体视网膜病变、同种异体主动脉血管病变和再狭窄方面显示出良好的疗效。HGRYVPP和RDTYHPM处磷酸化酪氨酸特异性抗体的免疫印迹证实PDGF-BB刺激依赖性体内这两个位点中酪氨酸处MUC1CT的磷酸化。
我们的研究表明,PDGF-BB刺激可诱导PDGFRβ介导的MUC1CT磷酸化,进而增强MUC1CT和β-catenin的核定位,并降低这些蛋白在细胞表面的定位。激活其他受体酪氨酸激酶,如EGFR,破坏细胞表面钙粘附素-β-连环蛋白的相互作用,并通过β-连环素增加核信号(43). PDGFRβ激活可导致过多酪氨酸激酶的激活,包括c-Src,其直接磷酸化β-catenin并破坏其细胞表面定位(44). MUC1CT和β-catenin均可定位于细胞核,β-catentin的核定位与肿瘤的增殖和病理分级增加有关。MUC1CT和β-连环蛋白的核定位增加使我们研究了PDGFRβ介导的MUC1CT磷酸化是否影响胰腺癌细胞的增殖和转移活性。我们观察到在增殖方面没有显著差异在体外与流式细胞仪细胞周期分析确定的未刺激细胞相比,PDGF-BB刺激下任何时间点过度表达重组MUC1的对照细胞或细胞(数据未显示)。PDGF-BB刺激24和48小时后的胸腺嘧啶掺入试验结果证实了这些发现(数据未显示)。
相比之下在体外侵袭实验清楚地表明,PDGF-BB刺激显著增强了MUC1过度表达的S2-013细胞的侵袭潜能。PDGFRβ激酶抑制剂AG1295可消除增加的侵袭潜能,表明这些作用与PDGFRα激酶活性直接相关。Hwang等人(36)已经显示通过用STI571(格列卫)抑制PDGFR磷酸化,在原位裸鼠模型中减少了人胰腺癌的生长和转移。在对照S2013中,PDGF-BB介导的侵袭潜能没有显著增加。Neo或S2013.CT3细胞表明,PDGFRβ介导的MUC1CT磷酸化对观察到的侵袭潜能增强至关重要。此外,MUC1CT中磷酸化介导突变的表达降低了两者的侵袭潜能在体外和体内分析。相反,磷酸化修饰突变显著增强了胰腺癌细胞的侵袭和转移能力,支持了我们的假设,即这些位点的磷酸化调节胰腺癌细胞致癌和转移的潜能。
PDGFRβ介导的MUC1CT磷酸化在正常胰腺细胞和胰腺癌细胞中是如何调节的?一个明显的因素是MUC1、PDGFRβ和PDGFB组织或细胞特异性共表达的需要;然而,MUC1和受体酪氨酸激酶(如PDGFRβ或EGFR)在特定细胞中的简单共表达并不能保证这些蛋白将以有意义的方式相互作用和发出信号。底物(MUC1CT)对激酶(PDGFRβ)的可及性差异可以在极化上皮细胞中进行空间调节,并可能有助于调节这些磷酸化事件,我们假设这些磷酸化活动在不同类型的正常细胞和肿瘤细胞中起作用(13). 我们不知道是什么将MUC1和受体酪氨酸激酶结合在一起。正常上皮细胞在基底表面表达受体酪氨酸激酶(如EGFR和PDGFRβ),而MUC1在顶端表面表达(45). 预计这种空间分离将排除这些分子之间的相互作用。致癌转化的一个特征是顶端-基底极性的丧失,这在理论上会使膜相关粘蛋白,如MUC1和生长因子受体,如乳腺中所示,在物理上靠近乳腺(30)从而使他们能够相互联系。这种机制可能解释了胰腺癌中PDGFRβ对MUC1的磷酸化作用,胰腺癌已经失去了一些顶端-基底细胞极性并过度表达MUC1。这种事件是否代表异常信号?也许,但也有可能设想一种MUC1和生长因子受体(如PDGFR或EGFR)在受损或受损并失去细胞极性或分化结构某些方面的正常上皮中相互作用的模型。上皮细胞的损伤或改变导致细胞极性的破坏,并通过PDGFRβ使MUC1结合和磷酸化,可能会向细胞发送信号,通知其分化结构或功能的丧失。正常上皮细胞结构的这种丢失需要激活可能涉及细胞增殖和运动的细胞修复机制,这两种功能以前都与癌症中的MUC1相关。因此,胰腺癌中MUC1、PDGFR和其他受体酪氨酸激酶介导的信号传导可能是肿瘤为了生存、增殖和侵袭而占用正常细胞功能的另一个例子。
总之,这里的研究结果表明,MUC1被PDGFRβ磷酸化,这导致MUC1CT和β-catenin的核定位增加,并增强胰腺癌细胞的侵袭潜能。这些结果也支持磷酸化事件介导MUC1介导的肿瘤相关信号的假说。MUC1和PDGFRβ信号通路的阻断可能与胰腺癌的治疗具有临床相关性,需要进一步研究。事实上,我们没有检测到MUC1CT中其他酪氨酸位点的磷酸化,这增加了以下可能性:MUC1CT的位点特异性磷酸化在组织或肿瘤之间存在差异,或者其他位点的磷酸化受胰腺癌细胞系中未反映的因素调节。无论如何,重要的是要进行额外的研究,以破译MUC1CT磷酸化在信号转导中的作用。