HMGB1–核小体复合物诱导炎症和免疫反应：对SLE发病机制的影响

在凋亡细胞死亡过程中，寡核苷酸和单核小体是由核酸内切酶对染色质的核小体间裂解产生的(23,24). 在体内，正常情况下，通过吞噬细胞有效清除凋亡细胞来阻止循环中核小体的出现(25–27). 在体外，当垂死的细胞进入凋亡晚期，即继发性坏死时，核小体被释放到培养上清液中(28). 为了研究继发性坏死细胞自发释放的核小体是否含有HMGB1，我们通过紫外线照射（未公布的数据）或staurosporine治疗48小时来诱导Jurkat细胞凋亡，当时几乎所有细胞都经历了继发性死亡。热处理导致原发性坏死。使用不同的抗组胺和抗dsDNA抗体，HMGB1从继发性坏死细胞的上清液中沉淀出来，而不是从原发性坏死细胞的上清液中沉淀出来(图1). 从原代热诱导坏死细胞的上清液中，HMGB1仅由抗HMGB1抗体沉淀，表明原代坏死细胞释放的HMGB1与核小体无关。早期凋亡细胞未释放可检测到的HMGB1（未发表的数据）。因此，培养细胞继发性坏死时释放的核小体至少部分与HMGB1相关。

我们和其他人之前已经描述过HMGB1在SLE患者的血浆和血清中经常检测到(22,29). 在一些SLE患者的外周血中，可以检测到大量的循环免疫复合物，这些复合物通常含有核小体(30–32). 为了测试这些循环免疫复合物是否含有HMGB1，从SLE和其他疾病（包括类风湿性关节炎、过敏和感染）患者以及健康对照者的血清中沉淀免疫复合物，并通过Western blotting进行分析。在8份SLE血清中的6份中，HMGB1很容易检测到。相反，在4名健康献血者和10名非系统性红斑狼疮患者的沉淀物中，未检测到HMGB1或检测到极少HMGB1(图2 A且未描述）。

为了探讨HMGB1是否与SLE患者血液中循环DNA/核小体相关，我们使用与Sepharose珠共价偶联的抗体进行联合免疫沉淀。使用抗组蛋白和抗dsDNA/核小体抗体，我们可以从SLE患者的HMGB1血清中共沉淀HMGB1，但不能从健康献血者的血清中共沉淀物HMGB1(图2 B). 结果类似于图2 B从SLE患者获得额外血清(n个=6）和健康对照(n个= 5). 这些数据表明，SLE患者血液中循环的核小体与HMGB1相关。

为了研究来源于凋亡细胞的含HMGB1核小体是否具有促炎活性，我们通过蔗糖梯度超速离心从活细胞、葡萄孢菌素处理的凋亡细胞和热诱导坏死Jurkat细胞中分离核小体。单核小体DNA和组蛋白的检测表明，在所有制剂的第4部分中主要发现了单核小体(图3). 就活细胞而言，HMGB1几乎只存在于不含核小体/DNA的组分梯度的顶部(图3 A). 在坏死细胞制备的制剂中，仅在含有组分4和5的单核小体中检测到微量HMGB1(图3 B). 在通过其他方法（如冷冻-解冻）坏死的细胞中，大多数HMGB1位于梯度的顶部，并且仅在单核小体或高分子质量分数6-8中检测到微量HMGB1（未公布的数据）。只有来自凋亡细胞的制剂在核小体组分4和5中含有大量HMGB1(图3 C). 此外，在凋亡细胞密度梯度的顶部发现了相对大量的HMGB1，表明HMGB1是游离的。通过SDS-PAGE和凝胶考马斯蓝染色对主要含有单核小体的组分4进行分析，以证明组蛋白的主要组成和制剂的纯度(图3 D). 总之，这些数据表明HMGB1主要附着在凋亡细胞的核小体上。

为了比较巨噬细胞激活能力，我们将人类单核细胞来源的巨噬细胞暴露于20μg/ml来自活细胞、坏死细胞和凋亡细胞的核小体。24小时后，在培养上清中测定TNF-α、IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和IL-18的浓度(图4). 含有大量HMGB1的凋亡核小体能有效刺激TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的分泌，而不含HMGB1活细胞的核小体不能诱导细胞因子释放。坏死细胞中HMGB1含量低于凋亡细胞的核小体诱导可测量的细胞因子分泌，但低于凋亡核小体(图4). 暴露于核小体后，我们无法检测到人类巨噬细胞分泌的IFN-α、IFN-γ、IL-8和IL-18（未发表数据）。使用小鼠腹腔巨噬细胞也获得了类似的结果（未发表的数据）。从用其他凋亡诱导剂（如抗Fas抗体或紫外线照射）处理的细胞中分离出的核小体，可从葡萄孢菌素处理的细胞向核小体释放类似的细胞因子（未公布的数据）。此外，由早期或晚期凋亡细胞制备的核小体诱导的细胞因子没有显著差异（图S1，可用）。重要的是，晚期凋亡细胞自发释放的核小体也诱导人单核细胞衍生的巨噬细胞释放细胞因子（图S2）。这些数据表明，单核小体的细胞因子诱导能力与其HMGB1含量相关。

为了进一步测试HMGB1是否有助于凋亡核小体的促炎活性，我们从嗯1^−/−（含HMGB2）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）(33)和HMGB^低的（HMGB1缺失，仅表达微量HMGB2）来自WT对应物的MEF，并比较其细胞因子诱导能力。将人单核细胞衍生的原代巨噬细胞与从存活和凋亡的MEF中纯化的核小体孵育，并评估TNF-α和IL-10的分泌。从凋亡细胞中纯化的核小体嗯1^−/−MEF仅诱导少量TNF-α和IL-10（未发表的数据）以及HMGB制备的TNF-β和IL-10^低的成纤维细胞几乎不诱导细胞因子，这与活细胞的核小体相当。相反，从濒临死亡的WT成纤维细胞纯化的核小体刺激TNF-α和IL-10分泌(图5 A). 因此，HMGB1和HMGB2可能是凋亡细胞核小体诱导的细胞因子分泌所必需的。

为了特异性拮抗HMGB1的作用，我们使用重组盒A（HMGB1截短的N末端结构域），该盒作为全长HMGB1蛋白的竞争性抑制剂(34,35). 在存在或不存在10μg/ml重组A盒的情况下，用从凋亡Jurkat细胞纯化的核小体培养人单核细胞衍生的巨噬细胞。重组A盒治疗强烈抑制凋亡核小体的细胞因子刺激活性，而LPS诱导的TNF-α和IL-10的释放没有改变(图5 B).

先前的研究表明HMGB1是RAGE、TLR2和TLR4的内源性配体，而CpG寡核苷酸信号依赖于TLR9。衔接蛋白MyD88（髓样分化初级反应蛋白88）在激活所有TLR后导致促炎细胞因子基因诱导的信号转导中至关重要(36,37). 为了评估RAGE和TLR信号在介导凋亡核小体促炎效应中的相关性，我们将从活细胞和凋亡细胞纯化的核小体与从WT和RAGE缺陷小鼠获得的巯基乙酸合法腹腔巨噬细胞孵育(38)，MyD88型(39)，TLR9(40)、TLR2、TLR4(41)或TLR2/4信令。暴露于凋亡核小体后，MyD88缺陷巨噬细胞以及TLR2/4-和TLR2-缺陷巨噬细胞中TNF-α和IL-10的释放被完全消除。相反，RAGE缺陷、TLR4突变和TLR9缺陷巨噬细胞的细胞因子分泌没有受到损害(图6). 因此，TLR2对含HMGB1的核小体诱导的促炎信号至关重要，而RAGE、TLR4和TLR9是不必要的。

DC作为最有效的APC，可能通过激活原始自身反应性T辅助淋巴细胞而在SLE的发病机制中起关键作用(42,43). 有效的T细胞启动需要成熟的DC表达MHC II类和共刺激分子，如B7家族成员，即B7-1/CD80和B7-2/CD86(44). 为了确定核小体，特别是来自凋亡细胞的核小体是否可以诱导DC成熟，将单核细胞衍生的未成熟DC在没有或存在20μg/ml核小体的情况下培养，这些核小体是从存活的和凋亡的Jurkat细胞纯化而来的。48小时后，通过流式细胞术检测DC表面MHC II类、CD86和CD83分子的表达。只有凋亡细胞中含有HMGB1的核小体显著诱导MHCⅡ类、共刺激分子CD86和DC成熟标记CD83的表面表达(图7 A). 除了成熟外，凋亡核小体还诱导单核细胞衍生DC释放TNF-α（未发表数据）。

为了研究凋亡核小体诱导的DC成熟是否也与DC功能相关，我们在没有或存在从活细胞或凋亡细胞分离的核小体的情况下，对单核细胞衍生的DC进行共培养。48小时后，加入同种异体T细胞，并评估其增殖反应。DC与凋亡细胞的核小体预孵育后，混合白细胞反应显著增强，而与活细胞核小体预先孵育的DC则无此作用(图7 B). 这些数据表明，DC激活T细胞的能力因凋亡核小体而增加。

为了进一步测试HMGB1是否参与凋亡细胞核小体诱导的DC成熟，将未成熟DC暴露于从WT或HMGB分离的核小体^低的采用流式细胞术检测48 h MEF后DC表面CD83和CD86的表达。从凋亡的WT-MEF中分离的核小体显著上调DC上CD83和CD86的表达，而从HMGB中分离的核小体^低的MEF对CD83和CD86的表面表达仅显示出细微的影响(图7 C). 这些数据表明，凋亡细胞中含有HMGB1的核小体可以诱导DC成熟，这对于有效的抗原提呈至关重要。

从浆细胞样DC（pDC）释放的IFN-α可能对SLE的免疫发病机制起关键作用，并且可以由CpG寡核苷酸诱导，甚至更有效地由HMGB1 CpG核苷酸复合物以TLR9-和RAGE依赖的方式诱导(10,11). 在我们的实验中，来自活细胞或凋亡细胞的核小体均未诱导pDC中IFN-α或成熟标记物的表达（图S3，可用；未描述）。然而，如果pDC与核小体以及含有抗dsDNA的SLE血清一起孵育，则会强烈诱导IFN-α释放（图S3）。这些数据表明，pDC分泌IFN-α并不依赖于与核小体相连的HMGB1，而是依赖于免疫复合物的形成。

为了测试凋亡细胞中含有HMGB1的核小体在体内是否显示出增强的免疫原性，我们用从存活和凋亡Jurkat细胞中分离的核小体来免疫BALB/c小鼠。成年雌性小鼠静脉注射核小体三次，不加任何佐剂。对照组注射PBS。用ELISA测定抗dsDNA、抗sDNA和抗组蛋白抗体的浓度。

与用活细胞核小体免疫的小鼠相比，注射凋亡细胞衍生核小体的小鼠显示出针对dsDNA和组蛋白的血清IgG抗体显著增加，这只显示出轻微或无抗dsDNA和抗组蛋白反应。没有一组显示出抗sDNA IgG滴度的相关增加(图8 A). 此外，还对血清进行了可提取核抗原的测试。用活细胞核小体免疫的小鼠，这些自身抗体没有相应增加，而用凋亡细胞核小体免疫的小鼠中有两个显示出高滴度的抗Scl70抗体。其中一只小鼠还产生了抗Jo-1、Sm、SSA/Ro和SSB/La的抗体。此外，大多数注射凋亡核小体的小鼠显示出抗U1-RNP、SSA/Ro和SSB/La抗体浓度增加的趋势。与用活细胞核小体免疫的小鼠相比，用凋亡细胞核小体免疫的小鼠中的lupus特异性Sm抗原抗体显著增加（图S4，可用；未描述）。来自凋亡MEF的核小体也在BALB/c小鼠中诱导抗dsDNA抗体（未发表数据）。

为了评估TLR2对体内凋亡细胞衍生核小体免疫原性的需求，向TLR2-和TLR2/4缺陷小鼠以及C57BL/6 WT小鼠静脉注射三次由凋亡细胞制备的单核小体。TLR2-和TLR2/4缺陷小鼠产生的抗dsDNA和抗组蛋白抗体浓度极低，明显低于C57BL/6 WT对照组(图8 B).

这些体内实验表明，与活细胞相比，来自凋亡细胞的核小体能更有效地诱导对dsDNA、组蛋白和各种可提取核抗原的抗体。此外，TLR2的参与对于小鼠体内抗dsDNA和组蛋白IgG自身抗体的诱导至关重要。

核小体是系统性红斑狼疮（SLE）的重要原发性自身抗原，抗dsDNA和核小体的自身抗体是SLE的特征性特征(30,45,46). 通常，纯化的dsDNA和核小体免疫原性较差(47,48). 核小体是广泛存在且丰富的自身成分，为什么核小体在SLE中具有免疫原性尚不清楚。单核小体和寡核小体是在细胞凋亡过程中通过染色质分裂形成的，可能出现在细胞表面和凋亡死亡过程后期的凋亡泡中(23,24,49). 正常情况下，在核小体释放之前，吞噬细胞会迅速清除凋亡细胞。然而，如果死亡细胞进入凋亡的晚期，核小体就会释放(28). 我们在继发性坏死而非原发性坏死细胞的上清液中检测到与HMGB1复合的核小体。因此，在凋亡细胞清除受损的情况下，正如在部分SLE患者中观察到的那样(18,19)和内源性佐剂HMGB1复合的核小体可能被释放并促进自身免疫反应。

事实上，在SLE患者的血液中经常可以检测到核小体，并被认为是体内细胞死亡的结果(30,50). 凋亡诱导剂处理的小鼠血浆中出现的核小体和DNA呈剂量依赖性(51). 在SLE中，核小体主要以免疫复合物的形式存在，因为存在各自的自身抗体(52). 我们在SLE患者的循环免疫复合物中检测到HMGB1，但在对照组中没有检测到。由于大量SLE患者中存在HMGB1自身抗体(22,53)也可能存在仅含HMGB1的免疫复合物。然而，共免疫沉淀实验显示，在SLE患者的血清和血浆中可检测到的HMGB1至少部分与dsDNA和核小体有关。健康人中未检测到HMGB1免疫复合物，尽管也存在HMGB1抗体(22,53). 最有可能的是，在健康受试者中，HMGB1通常不会被释放，因为死亡细胞被迅速清除；因此，不会形成免疫复合物。先前的研究表明，在凋亡细胞中，HMGB1与低乙酰化染色质紧密结合，即使在经历了继发性坏死之后。相反，HMGB1从原发性坏死细胞的染色质中快速丢失(17). 因此，SLE患者血液中HMGB1–核小体复合体可能主要来源于继发性坏死细胞，而非原发性坏死的细胞。

Bell等人的最新发现(54)表明HMGB1的释放可能不是原发性坏死的唯一特征。至少在某些细胞中，HMGB1的释放也发生在晚期凋亡细胞死亡期间，甚至在DNA释放之前(54). 在本文中，我们证明至少有一部分HMGB1是从次生坏死细胞释放出来的，它与核小体结合。活细胞的核小体几乎不含HMGB1。只有一小部分凋亡细胞衍生核小体含有HMGB1，这表明核小体和HMGB1之间形成的高亲和力复合物仅限于核小体的某些亚群和/或HMGB1。这些复合物的数量可能取决于细胞类型和不同的凋亡途径。

最重要的是，凋亡细胞衍生的核小体显示出强大的促炎作用。从HMGB1缺陷的凋亡MEF中纯化的核小体诱导了极少的TNF-α和IL-10分泌。HMGB的那些^低的HMGB1缺乏而HMGB2含量非常低的细胞，不会刺激任何TNF-α或IL-10的释放。这些数据表明HMGB1在来自凋亡细胞的核小体的促炎症特性中起着直接和关键的作用，并表明HMGB2具有类似的氨基酸序列，与HMGB1具有许多甚至全部的生化特性(5,55)也显示出促炎症的潜力。值得注意的是，由凋亡核小体诱导的TNF-α、IL-6和IL-10在SLE患者的血清中升高，可能参与SLE的发病机制(56,57). 然而，TNF-α在SLE中的作用似乎是矛盾的。一方面，可能参与SLE免疫发病机制的IFN-α/β的产生通常被TNF-α下调(58). 另一方面，在SLE患者的血清和炎症肾脏中发现TNF-α，可能会导致炎症过程和器官损伤(59). 在SLE中，TNF-α可能无法充分调节IFN-α的生成(56)两种细胞因子的联合增加可促进其发病。

HMGB1的大多数生物效应被认为是由多基因受体RAGE以及TLR2和4介导的(8,10,11,15,60). 最近的一项研究表明，HMGB1与CpG寡核苷酸复合，比HMGB1单独与RAGE结合更有效。HMGB1强烈增强了CpG寡核苷酸介导的B细胞和pDC依赖TLR9的细胞因子释放，并依赖RAGE和TLR9。然而，确切的机制尚不清楚(10).

与HMGB1–CpG寡核苷酸复合物的这些数据相反，凋亡细胞中含有HMGB1的核小体诱导巨噬细胞释放细胞因子，独立于RAGE、TLR4和TLR9，而只有TLR2信号是必需的。用凋亡核小体免疫TLR2缺陷小鼠，并没有显著诱导抗dsDNA或抗组蛋白抗体，这一事实证实了TLR2对HMGB1-核小体复合体在体内的免疫刺激作用的关键作用。有趣的是，发现Mal/TIRAP蛋白的单一功能缺失等位基因的存在对TLR2和TLR4介导的信号转导至关重要，对SLE具有保护作用，而对类风湿性关节炎的发生没有影响(61). 根据我们的结果，HMGB1可能代表TLR2信号与SLE发病机制之间的联系。如MRL/lpr小鼠所示(62)，dsDNA和核糖核蛋白颗粒自身抗体的形成可能另外分别需要TLR9和TLR7。

与CpG寡核苷酸和CpG–HMGB1复合物相比，HMGB1–核小体复合物本身不会导致pDC释放IFN-α。然而，在含有高浓度抗dsDNA抗体和核小体的血清中，IFN-α的诱导作用很强，可能在SLE的免疫发病机制中发挥关键作用（图S3）(63). 此外，初步数据表明，在用凋亡细胞的核小体而不是活细胞的核小体免疫的小鼠中，随后注射核小体在体内诱导IFN-α的释放。这些数据表明，凋亡核小体可能启动dsDNA自身抗体的形成。核小体的随后释放导致免疫复合物和IFN-α分泌的形成，然后作为自身免疫和炎症的放大环（图S5）。

DC是免疫反应的重要调节器。成熟DC对T辅助细胞的启动尤其必要。DC在识别病原体后成熟(64). 在没有病原体的情况下，也可能发生DC介导的自身免疫反应。在这种情况下，作为报警蛋白的内源性分子可能激活APC并增强共刺激分子和MHC II类分子的表达(65). 以前已经证明重组HMGB1和HMGB1 B盒(12)以及来自WT MEF但不是来自其嗯1^−/−对应物，诱导DC成熟(13). 此外，其他研究小组证明染色质/核小体免疫复合物(66)从小牛胸腺纯化的游离核小体直接与DC相互作用，并可通过TLR9依赖和独立的途径激活它们(46). 在这篇论文中，我们证明凋亡细胞衍生的核小体与来自活细胞的相比，诱导了明显更强的DC成熟。此外，来自凋亡HMGB的核小体^低的MEF没有诱导DC成熟，再次证明HMGB蛋白作为内源性佐剂在增强DC抗原提呈功能方面发挥关键作用。

虽然核小体被认为是SLE的主要自身抗原之一，但以前用活细胞纯化的核小体免疫非自身免疫小鼠的尝试未能触发相关自身抗体的产生(30). 与之前的研究一致，我们也没有观察到活细胞核小体免疫后抗dsDNA抗体的显著诱导。重要的是，用来自凋亡细胞的HMGB1核小体复合物免疫，激活巨噬细胞并诱导DC体外成熟，转化为显著增加非自身免疫小鼠的抗dsDNA抗体生成。Mevorach等人(67)用全凋亡细胞免疫非自身免疫小鼠，但不能检测到dsDNA抗体，只能检测到ssDNA抗体。在非自身免疫小鼠中，整个凋亡细胞未能诱导与疾病相关的抗dsDNA抗体，可能是由于凋亡细胞的快速清除及其抗炎和免疫抑制特性所致(68).

总之，含有HMGB1的凋亡细胞衍生核小体可能通过其对各种细胞类型，尤其是巨噬细胞和DC的促炎作用，严重破坏SLE患者对核抗原的外周耐受性。此外，我们的研究结果表明，拮抗HMGB1可能是一种新的SLE治疗策略。

为了制备血清，从健康献血者和SLE或其他疾病患者的静脉血中收集到不含抗凝剂的试管中（Monovett），并于2000年离心克在4°C下保持30分钟。收集血清并在−20°C下储存。该研究得到了爱尔兰根-纽伦堡大学医学院伦理委员会（Ethikcommission der Medizinischen Fakulta­t der Friedrich-Alexander-Unisita­t Erlangen-Nu­rnberg）的批准，并获得了献血者的知情同意。

如前所述培养Jurkat（TIB-152）细胞(22).嗯1^+/+和嗯1^−/−MEF是从来自嗯1纯BALB/c遗传背景上的杂合子（>10个回交），并根据3T3方案生长，该方案规定每3天将生长的细胞以1:3分裂3个月。在该程序结束时获得的成纤维细胞可以无限期地保持为完整DMEM中的单层培养物。以这种方式获得的成纤维细胞系表达低水平的HMGB2蛋白，除了HMGB1的KO外，没有检测到HMGB3 mRNA。然后我们称其为HMGB^低的，而WT对应物被称为HMGB⁺人单核细胞来源的巨噬细胞如前所述进行分化(69). 人类单核细胞衍生DC的产生如前所述(13). 根据Michl等人获得了巯基乙酸盐引发的小鼠腹腔巨噬细胞(70). 使用Pan T细胞分离试剂盒II（Miltenyi Biotec），通过负免疫磁选从健康供体的PBMC中分离T淋巴细胞。

动物实验得到了米特尔弗兰肯政府（Regierung von Mittelfranken）的批准。小鼠被安置在埃尔兰根-纽伦堡大学的动物设施中。BALB/c和C57BL/6小鼠从查尔斯·里弗实验室购买。愤怒^−/−小鼠由B.Arnold（德国海德堡德国癌症研究中心）提供(38)，TLR9^−/−T.Winkler（德国埃朗根大学生物系）(40)，TLR2^−/−，TLR4级^−/−(41)和TLR2/4^−/−M.Schnare（德国埃尔兰根大学医学微生物学和免疫学研究所）和MyD88^−/−(39)A.Gessner和J.Glaesner（德国爱尔兰根大学医学微生物学和免疫学研究所）的TLR4突变体（C3H/HeJ）和相应的WT对照（C3H/HeN）小鼠。

为了诱导凋亡，Jurkat细胞（2.5×10⁶细胞/ml）用1μM staurosporine（Enzo Biochem，Inc.）处理4-8小时以制备核小体，并处理48小时以进行共免疫沉淀。用于制备核小体，HMGB^低的用0.5μM staurosporine处理WT MEF 4–8 h。在56°C下加热细胞30 min，然后在37°C下再孵育1 h，诱导原发性坏死。通过碘化丙啶/膜联蛋白V-FITC染色确认细胞凋亡和坏死。

用1.5或2%PEG 6000（Carl Roth）沉淀血清样品中的循环免疫复合物。沉淀物在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离，HMGB1用多克隆抗HMGB1抗体（BD）通过Western blotting检测。

核小体由Jurkat细胞（5×10⁸每个制剂的细胞）和HMGB WT和HMGB^低的MEF（2×10⁸根据Vaux等人(71). 根据Suer等人描述的方法获得了含有单核小体的染色质组分(72). 简言之，用500 U微球菌核酸酶（S7；Roche）在37°C下消化分离的细胞核30分钟，用10 mM Tris和2 mM EDTA溶解，并将悬浮液分层到12 ml的10–50%蔗糖梯度上。梯度在SW41贝克曼转子中以34000 rpm在4°C下离心22小时。收集1.5 ml的馏分，在0.1%十二烷基硫酸钠存在下通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析DNA含量，然后用溴化乙锭进行可视化。采用15%SDS-PAGE、考马斯染色和Western blotting检测组蛋白和HMGB1。使用前，对核小体部分进行了广泛的PBS透析。为了排除LPS的污染，我们使用无菌无内毒素塑料器皿和试剂进行核小体制备。使用E-TOXATE试剂盒（Sigma-Aldrich）和QCL-1000显色内毒素检测法（Cambrex）对所有核小体制剂进行LPS污染检测。只有当鲎试剂（E-TOXATE）检测呈阴性且QCL-1000检测到内毒素浓度＜0.2 U/ml时，才使用核小体制剂。

将通过蔗糖梯度超速离心获得的等量的每个组分进行12%SDS-PAGE，并转移到PVDF膜（Millipore）上。如前所述对蛋白质进行可视化(22).

根据制造商的说明，使用Seize X哺乳动物免疫沉淀试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行协同免疫沉淀，并进行了微小修改。简言之，7.5μg的抗HMGB1（研发系统）、抗dsDNA（33H11；由德国埃尔兰根纽伦堡大学的T.Winkler提供）、抗组胺潘（罗氏）、抗组胺KM1和KM2（由荷兰奈梅亨奈梅亨医学中心的J.Berden提供）和抗组胺H3（Abcam）抗体和7.5μg/ml适当的同种对照抗体共价偶联到蛋白g–Sepharose珠，并与凋亡或坏死Jurkat细胞的血清样品或细胞培养上清液在4°C下孵育4小时。沉淀蛋白用多克隆抗HMGB1抗体（Millipore）进行Western blotting分析。

使用配对单克隆抗体（BD）测定人单核细胞衍生巨噬细胞细胞培养上清液中细胞因子TNF-α、IL-10和IL-1β的浓度。IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ和IFN-α根据制造商的说明通过流式细胞混合珠基分析（Bender MedSystems）进行测量。

单核细胞衍生DC（5×10⁵)在含2%FBS的PBS中，用抗CD83-PE（Beckman Coulter）、CD86-生物素（BD）、HLA-DR（Beckman-Coulter）或适当的同型对照的荧光铬结合单克隆抗体在4°C下孵育30分钟。标记的细胞清洗两次，并使用FACSCalibur（BD。使用Cell Quest软件（BD）分析数据。

第7天未成熟的单核细胞衍生DC未经处理，或在添加10%自体人类血清的RPMI 1640培养基中与20μg/ml来自存活或凋亡Jurkat细胞的核小体孵育。孵育48小时后，1×10^三辐照（30Gy）DC与1×10一起电镀⁵将最终体积为200μl的异基因T细胞置于96周的圆底平板中。细胞共培养5天并用1μCi脉冲^三培养最后16小时期间，每孔H胸腺嘧啶核苷（Amersham Biosciences）。成立^三在1205 Wallac Beta计数器上测量H胸腺嘧啶核苷（GE Healthcare）。胸苷掺入量报告为三倍±SD的平均cpm。

6周龄雌性BALB/c小鼠每隔3周静脉注射3次50μg从凋亡或存活Jurkat细胞纯化的核小体。对照组接受PBS，在免疫前和每次免疫后3周采集血清样本。

8周龄TLR2^−/−或TLR2/4^−/−老鼠(41)静脉注射75μg从凋亡Jurkat细胞纯化的核小体。C57BL/6小鼠作为对照。各组小鼠每隔2周注射三次凋亡核小体。

如前所述，通过ELISA测定血清中针对dsDNA、ssDNA和组蛋白的IgG抗体浓度(73,74).

使用双尾学生的t吨异方差样本或Mann-Whitney检验U型对未配对的样品进行测试，如图图例所示。

图S1显示了使用材料和方法中描述的蔗糖梯度超速离心法从早期和晚期凋亡Jurkat细胞中生化纯化的核小体刺激人类巨噬细胞分泌的类似细胞因子。图图S2显示，从晚期凋亡/继发性坏死细胞自发释放的核小体含有HMGB1，并诱导人巨噬细胞释放TNF-α和IL-10。图S3表明，从活细胞或凋亡细胞分离的核小体不刺激人pDC释放IFN-α。然而，核小体和含有血清的抗dsDNA抗体诱导了与CpG寡核苷酸相当的IFN-α的强烈释放。图S4显示了抗Sm抗体在用凋亡核小体免疫三次的BALB/c小鼠中的诱导，但在用活核小体免疫的那些小鼠中没有。图S5显示了HMGB1–核小体复合体在SLE免疫发病机制中作用的建议模型。

我们感谢本杰明·弗雷（Benjamin Frey）、达米安·马塞达（Damian Maseda）、伊娃·盖克尔（Eva Gueckel）和克里斯汀·诺伯特（Kirsten Neubert）对手稿的批判性阅读以及他们在编写手稿过程中的帮助。我们感谢Bernd Arnold（德国癌症研究中心[DKFZ]Heidelberg）慷慨提供缺乏RAGE的小鼠，感谢Andre Gessner和Joachim Glaesner为C3H/HeJ和C3H/HeN小鼠提供的药物，感谢Markus Schnare为TLR2-和TLR2/4缺乏小鼠提供的药物，以及向Thomas Winkler提供TLR9缺陷小鼠和33H11单克隆抗体（均为厄朗根大学-努恩伯格分校）。

这项工作得到了临床研究跨学科中心（跨学科临床研究中心[IZKF]，项目编号N2）、德国研究学会（合作研究中心SFB 643，项目B3）和MIUR（2004年和2005年普林）的支持。

潜在利益冲突：M.E.Bianchi是HMGBiotech的创始人和部分所有者，该公司是一家生物技术公司，为HMGB1研究提供材料和服务；M.E.Bianchi和A.A.Manfredi被命名为使用HMGB1的多项专利的创造者。其他作者没有其他相互冲突的经济利益。