一个新的B7家族成员与Pd-1免疫抑制受体的结合导致淋巴细胞活化的负调控

正负信号的平衡对于最大限度地提高适应性免疫反应保护宿主的能力，同时保持免疫耐受性和预防自身免疫至关重要。PD-1是一种I型跨膜蛋白，在活化的T细胞、B细胞中转录诱导1,2,三和髓细胞（Nishimura，H.和T.Honjo，未发表的数据）。PD-1的胞外区域由单个Ig样变量（IgV）结构域组成4，并且细胞质区域包含一个免疫受体酪氨酸基抑制基序（有关综述，请参阅参考文献5). 最近的研究表明，PD-1受体可下调免疫反应，其丢失会导致外周耐受性的破坏。小鼠缺乏产品开发-1随着年龄增长，发展成狼疮样增生性关节炎和肾小球肾炎，并伴有主要的IgG3沉积6此外，以与lupus易感MRL小鼠相似的方式，引入液化石油气突变会加速疾病的发病和症状的严重程度。此外，2C-TCR（抗-H-2L^d日)转基因小鼠纯合子产品开发-1自身反应性H-2的零突变^b/d日背景发展为慢性移植物抗宿主样疾病6在这个模型中，外周2C T细胞表现出记忆而非单纯表型，并渗入包括表皮在内的组织，尽管胸腺中存在有效的阴性选择。然而，这种调节是在激活期（淋巴结）、效应期（组织）还是两者都实现尚待确定。由于缺乏对PD-1配体身份的了解，对这个问题的直接方法以及对这种抑制途径的进一步表征受到了阻碍。

产品开发-1在结构上与CTL相关抗原4相似(CTLA-4型)结合B7-1和B7-2并在维持T细胞内环境稳定中发挥关键作用（有关综述，请参阅参考文献7和8). 虽然PD-1不具有对B7-1和B7-2结合至关重要的MYPPPY基序，但PD-1和CTLA-4的胞外区域均由单个IgV结构域组成，彼此具有23%的同源性。这与CTLA-4和CD28之间的～30%一致性相比9因此，我们推断PD-1的配体可能在结构上与B7-1和B7-2有关。我们通过寻找B7-like分子并测试其与PD-1的结合来实现这一假设。在这项工作中，我们确定了PD-1的配体，并证明这种受体-配体相互作用导致淋巴细胞增殖受到抑制。

国家生物技术信息中心人类表达序列标签（EST）数据库的BLAST搜索(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)鉴定出两个与B7-1号机组和B7-2号机组（AA292201和AA399416）。以5′-dCAGCTATGGTGCCGACTAA-3′和5′-dAGGTGCTAGGGAGAGTTAGACA-3′为引物，通过PCR扩增出389 bp的cDNA片段。PCR产物被生物素标记，并通过Cloncapture（CLONTECH Laboratories，Inc.）从pAXEF载体中的人胎盘cDNA文库中分离全长cDNA10对国家生物技术信息中心小鼠EST数据库的搜索发现与人类PD-1配体1同源的重叠序列(PD-L1型; AA896104和AA823166）。以5′-dgagagcctcgctccaaag-3′和5′-dGTGGTTTGCCCTGTGTGTGATCT-3′为引物，PCR扩增出409-bp片段。PCR产物被生物素标记，并用于克隆捕获（CLONTECH Laboratories，Inc.）从pAXEF载体中的小鼠活化T细胞cDNA文库中分离全长cDNA。

所使用的Ig融合蛋白由与铰链-C连接的受体的完整胞外区域组成_H（H）2-C型_H（H）人Igγ1的3个结构域或鼠Igγ2a的相同结构域（具有阻断Fc受体和补体结合的4个点突变）分别给出Ig（γ1）和Ig（α2a）融合11这些重组蛋白在用LipofectAMINE（GIBCO BRL）瞬时转染的COS细胞或稳定转染的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中产生，并使用蛋白A–Sepharose从条件培养基中纯化。

人类PD-L1型cDNA亚克隆到pEF6（Invitrogen）中，并用ScaI线性化。在磷酸甘油酸激酶基因启动子的控制下，用含有潮霉素B抗性基因的质粒构建物将该DNA与CHO-K1细胞共电穿孔。在800μg/ml潮霉素B中选择细胞，并通过限制稀释进行克隆。老鼠PD-L1型pAXEF中的cDNA用ApaLI线性化，并在磷酸甘油激酶基因启动子的控制下与嘌呤霉素抗性基因共电穿孔到CHO-K1细胞。在10μg/ml嘌呤霉素中选择细胞并通过限制稀释进行克隆。

通过抗IgM淘洗从2到3个年龄匹配的C57BL/6和C57BL/6–的脾细胞池中收集脾T细胞产品开发-1^−/−小鼠，纯度达80%。4 × 10⁴将96个U底板（岩崎）中的细胞/孔与指定浓度的试剂孵育。纯化抗鼠CD3（145-2C11)单独或联合hPD-L.Ig（γ2a）或小鼠IgG2a在4°C下预涂过夜。细胞培养72小时，然后用0.5μCi的[^三H] 胸腺嘧啶核苷（Amersham Pharmacia Biotech）每孔持续最后18小时，并测量掺入的标记物。

采用Ficoll-Hypaque梯度离心法分离PBMC。CD4细胞⁺使用单克隆抗体和免疫磁珠（PerSeptive Biosystems）的混合物通过阴性选择纯化T细胞群（纯度85-90%）。按照制造商的说明和前面的描述，将抗CD3、对照IgG和融合蛋白共价连接到涂有甲苯磺酸盐活化的代纳肽（Dynal）的聚氨酯涂层上12.将指示浓度的抗CD3抗体（UCHT1；BD PharMinen）添加到10⁷0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中的珠子/ml。将对照IgG添加到珠悬浮液中，以在结合期间保持总Ig浓度恒定为5μg/ml。类似地，用指示的抗CD3抗体浓度制备抗CD3/hPD-L.Ig（γ2a）微球，hPD-L1.Ig的恒定浓度代表总结合蛋白的40%（2μg/10⁷珠），或控制IgG以组成剩余的总结合蛋白。10⁵T细胞培养在96个平底平板中，在存在或不存在指示浓度的抗CD28 Ab（CD28.2；BD PharMinen）的情况下，以1:1的珠/细胞比率添加珠。通过用1μCi标记4-d试验最后6小时的培养物来确定增殖[^三H] 胸苷/孔。为了通过细胞因子ELISA进行分析，按照上述方法建立培养物，并在指定时间采集上清液。使用商用ELISA试剂盒（Genzyme）测定IFN-γ、IL-10和IL-2浓度。

人树突状细胞来源于外周血。在Ficoll梯度上分离单核细胞。去除非粘附细胞，将剩余细胞培养在150 ng/ml人类GM-CSF（R&D系统）和100 ng/ml人IL-4（R&D系统）中2 D。分离非粘附树突状细胞（CD80⁺CD86型⁺人类白细胞抗原-DR⁺CD54型⁺CD58型⁺CD1a公司⁺)并单独在GM-CSF中培养或用GM-CSF、2.5μg/ml LPS（Sigma-Aldrich）和10 ng/ml人IFN-γ激活。在激活后4和20小时，收集细胞并使用RNeasy试剂盒（QIAGEN）分离RNA。

小鼠骨髓单核细胞中粒细胞、淋巴细胞和Ia免疫耗竭⁺细胞通过磁激活细胞分选，并在含有GM-CSF和IL-4的培养皿中培养。在培养7天后，树突状细胞作为非粘附群体被收集，并证明其为75–80%CD11c⁺，高Ia⁺细胞。细胞被LPS和人IFN-γ激活。

对于定量PCR分析，细胞RNA经过脱氧核糖核酸酶处理、重新提取并转化为第一链cDNA。6-羧基荧光素（FAM）标记的hPD-L1、hB7-1、hB7-2和人甘油醛3-磷酸脱氢酶（hGAPDH）探针购自PE Biosystems（hPD-L1:5′-dGCCGAAGTCATCTGGACAAG-3′和5′-dTCTCAGTGCTGGTCACAT-3′，探针5′-FAM-dCACCACACACATCATA-3′；hB7-1:5′-dACGTGACCAAGAAGTGAAAGA-3′和5′-dTGCCAGCTCTCAACAAACAT-3′探针5′-FAM-dTGGCAACGCTCCTGGTCAC-3′；和hB7-2:5′-dGGGCCGCACA-AGTTTGAT-3′和5′-dGCCCTTGTCCTTGATCTGA-AGA-3′，探针5′-FAM-dCGGACAGTGGACCTCGA-CTTCACA-3′。

根据制造商的说明，使用PerkinElmer TaqMan™EZ试剂盒中的试剂在96个平板上建立PCR反应。为所分析的四个基因中的每一个建立标准曲线。在ABI Prism 7700序列检测器（PerkinElmer）中运行40个PCR周期，并使用GAPDH将PD-L1型,B7-1号机组、和B7-2号机组结果。

基因芯片使用Mu19KsubA芯片（Affymetrix）^®杂交分析。小鼠PD-L1的一部分序列由基因组研究所的EST TC17781表示(http://www.tigr.org网站)在这个芯片上。如前所述进行RNA分离、芯片杂交和扫描13.

对于RNA杂交，1.6-kb人类和3.6-kb小鼠PD-L1型cDNA用XbaI消化并用[γ]随机引物标记-³²P] ATP和DNA聚合酶I的Klenow片段。如前所述，将RNA印迹杂交14.

人类的染色体位置PD-L1型使用单色体细胞杂交DNA模板（Quantum Technologies）鉴定该基因，并使用PD-L1型–特异性引物。使用的寡核苷酸引物为：5′-dCCCAGGTAATATTCTGATGTGTC-3′和5′-dATTCATAAATATCTGAATGT-3′。每个PCR使用100 ng模板DNA，在94°C下30个周期，30 s；60°C，30秒；用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析PCR产物。

人类和老鼠PD-L1型在基于B7同源性的EST数据库搜索中鉴定出cDNA。对国家生物技术信息中心数据库的BLAST搜索显示，两种人类重叠的EST与B7-1号机组和B7-2号机组分子（登录号AA292201和AA399416）。利用这些序列，从人胎盘cDNA文库中分离出全长cDNA。同时，发现了两种小鼠EST，它们对应于PD-L1型（登录号AA896104和AA823166）。利用这些序列，从小鼠激活的T细胞cDNA文库中分离出全长cDNA。人和小鼠PD-L1分子是B7基因家族的成员，在细胞外区域共享由IgV和IgC结构域组成的共同结构组织15，具有疏水性跨膜结构域，其后是短的带电荷的细胞内区域(图1). 人类PD-L1型含有290个残基，与B7-H1相同，据报道B7-H11具有T细胞刺激活性16.小鼠PD-L1型cDNA编码一种与人类同源序列氨基酸同源性为70%的多肽(图1).PD-L1型氨基酸同源性分别为21、20和23%B7-1号机组,B7-2号机组和可诱导共刺激物配体(国际博协)分别为11,15,17,18.

PD-L1结合PD-1的能力已通过流式细胞术和BIAcore结合分析测定。与人和鼠结合的人和鼠PD-1.Ig融合蛋白PD-L1型流式细胞术检测CHO细胞表达(图2A） ●●●●。然而，无论是人CTLA-4.Ig、人CD28.Ig还是人ICOS。Ig与任一PD-L1表达系结合。PD-1融合蛋白不能与单独转染载体的CHO细胞结合。使用BIAcore仪器的表面等离子体共振进一步证实了PD-1–PD-L1相互作用。将人和小鼠PD-1.Ig蛋白和人CTLA-4.Ig固定在葡聚糖芯片的流动细胞表面上，并测试其与可溶性人PD-L1.Ig的结合。PD-L1.Ig与人和小鼠PD-1.Ig结合，但不与人CTLA-4.Ig结合(图2B） ●●●●。这种结合被与共注入可溶性PD-1.Ig竞争而非CTLA-4.Ig竞争所阻断。人B7-1和B7-2的可溶性形式不能结合固定化的人PD-1.Ig（数据未显示）。

接下来我们研究了PD-L1型抗原提呈细胞上的表达及其与B7-1号机组和B7-2号机组表达式。首先，我们通过RNA印迹杂交分析了人类血液单核细胞的表达，发现PD-L1型不由未刺激的单核细胞表达，但在IFN-γ治疗后迅速上调(图3A） ●●●●。用另一种促炎细胞因子TNF-α处理单核细胞，导致低水平诱导，类似于仅用培养基发现的诱导，可能是由于粘附塑料而激活的结果(图3A） ●●●●。除了主要的4.2-kbPD-L1型mRNA，我们还观察到一个小的1.8kbPD-L1型干扰素γ处理的单核细胞中的mRNA物种。Dong等人也报道了主要的4.2-kb mRNA物种。16。我们还检测到PD-L1型通过细胞表面Ig交联激活的人B细胞，但不通过Raji细胞系激活(图3A） ●●●●。同样，B7-1号机组不由未刺激的单核细胞表达，但对IFN-γ的反应上调，其动力学与PD-L1型表达式。相反，B7-2号机组mRNA在单核细胞中组成性表达，其水平不受IFN-γ或TNF-α的影响。

第二，PD-L1型,B7-1号机组、和B7-2号机组定量PCR检测人树突状细胞mRNA表达。人类外周血来源的树突状细胞单独用GM-CSF处理或用GM-CSF、LPS和IFN-γ激活。由于LPS和IFN-γ的激活，PD-L1型与未诱导细胞相比，mRNA在4h时快速诱导，增加16倍，在20h时增加34倍(图3B） ●●●●。B7-1号机组和B7-2号机组mRNA也在激活时被诱导：B7-1号机组4小时诱导21倍，20小时诱导22倍。B7-2号机组4h时诱导率低；然而，在20小时时诱导了5倍的表达(图3B） ●●●●。的表达式PD-L1型用基因芯片检测LPS和IFN-γ处理的小鼠骨髓衍生树突状细胞^®杂交。PD-L1型这些细胞中的表达遵循与人类树突状细胞上观察到的相似模式：五倍诱导PD-L1型诱导后6和20小时，mRNA相对于未诱导细胞（数据未显示）。这些数据表明PD-L1型由抗原提呈细胞和淋巴细胞表达，并在树突状细胞上以类似于的方式诱导B7-1号机组和B7-2号机组。我们还演示了PD-L1型用佛波酯和IFN-γ治疗人角质形成细胞(图3C） ●●●●。

在小鼠组织中，我们发现约3.7-kbPD-L1型通过Northern杂交检测mRNA转录。Dong等人。16已报告4.2kbPD-L1型(B7-H1型)正常人体组织中的信使核糖核酸种类。小鼠的分布PD-L1型mRNA与人类的mRNA非常相似，心脏、胸腺和肺部的mRNA水平较高，而肾脏、脾脏和肝脏的mRNA含量较低(图3D） ●●●●。

通过单倍体人体细胞杂种的PCR，我们证明PD-L1型该基因位于9号染色体上(图3E） ，不同于B7-1号机组和B7-2号机组聚集在第3染色体上的基因19因此，我们在活化的树突细胞上观察到的这些基因的平行上调并不是聚集在单个染色体位点的结果。此外，这也区分了PD-L1型来自人类6号染色体MHC基因复合体中的B7-like酪蛋白20.

为了研究PD-1–PD-L1相互作用的功能意义，我们比较了PD-L1 Ig对野生型和非野生型小鼠T细胞增殖的影响产品开发-1–缺陷小鼠21我们首先检测了来自野生型和产品开发-1^−/−小鼠抗CD3单克隆抗体，发现它们基本相同(图4A） ●●●●。因此产品开发-1不会削弱T细胞通过TCR对刺激作出反应的能力，也不会在初级刺激中产生过度增殖表型。为了检查PD-L1型、最佳浓度的抗CD3单克隆抗体和不同浓度的人PD-L1。Ig或IgG对照物预先涂于塑料板上。通过掺入[^三H] 胸腺嘧啶。如所示图4B、 人PD-L1.Ig抑制产品开发-1^+/+相对于IgG对照，T细胞呈剂量依赖性(图4B） ●●●●。相反，人PD-L1.Ig对产品开发-1^−/−相同条件下的T细胞。这些结果表明PD-L1型可以减弱TCR介导的T细胞增殖。此外，PD-L1未能抑制产品开发-1–T细胞缺陷表明PD-L1通过与PD-1的相互作用传递此信号。

PD-L1与其受体相互作用的功能后果也使用人类T细胞进行了检测。纯化CD4⁺用涂有抗CD3单克隆抗体和人PD-L1.Ig或对照Ig的珠激活从PBMC获得的T细胞。刺激96小时后评估增殖和细胞因子产生。如所示图4C、 用抗CD3单克隆抗体/PD-L1激活的细胞。与抗CD3抗体/对照Ig激活的细胞相比，Ig包被微球的增殖减少了69%。此外，PD-L1存在时激活细胞也会损害细胞因子的分泌。在PD-L1的存在下，IFN-γ和IL-10的分泌分别减少了～80%和60%(图4C） ●●●●。在24小时和96小时的这些激活条件下，IL-2的产生都低于检测。然而，在提供可溶性抗CD28形式的共刺激的条件下，PD-L1存在下的细胞激活也导致IL-2产生的减少（数据未显示）。因此，在PD-L1存在下激活小鼠和人类T细胞会导致增殖和细胞因子分泌受到抑制。

为了检测TCR-、CD28-和PD-1介导信号之间的关系⁺用次优或最佳浓度的抗CD3单克隆抗体、固定浓度的PD-L1.Ig和增加可溶性抗CD28单克隆抗体浓度刺激T细胞。使用抗CD3单克隆抗体包衣珠，确定了次优和最佳T细胞刺激所需的浓度（数据未显示）。在亚最佳TCR结合条件下（抗CD3单克隆抗体为1μg/ml），在没有协同刺激的情况下观察到最小增殖(图5A） ●●●●。增加可溶性抗CD28单克隆抗体的浓度会导致增殖增加30倍。在这些条件下，PD-L1存在下T细胞的活化导致增殖减少80%(图5A） ●●●●。需要最大程度的共刺激（250 ng/ml的抗CD28）来挽救PD-L1刺激介导的增殖抑制。相反，在TCR激活的饱和条件下（2μg/ml的抗CD3单克隆抗体），PD-L1介导的T细胞增殖抑制仅在没有CD28协同刺激的情况下观察到(图5B） ●●●●。

最近的研究产品开发-1–缺陷小鼠显示了该受体的关键免疫调节作用，因为它的缺失会导致自身免疫。作为产品开发-1结构类似于CTLA-4型，我们假设产品开发-1可能是B7基因家族的成员，并搜索新的B7同源物。其中之一，后来被称为PD-L1型发现，可特异性结合PD-1。这种相互作用的功能意义已在T细胞分析中得到证实，其中PD-L1与PD-1的结合导致TCR介导的淋巴细胞增殖和细胞因子分泌受到抑制。产品开发-1也由B细胞和髓细胞表达产品开发-1在这些细胞类型中，自身抗体的产生和骨髓增生证明了产品开发-1–缺陷小鼠6,21因此，预计PD-L1作用于比我们在本报告中演示的更广泛的细胞类型。

我们已经证明PD-L1信号传导可以抑制TCR介导的T细胞增殖。PD-1–PD-L1相互作用下调CD3/CD28刺激反应的能力表明，PD-1参与导致传递强烈的抑制信号。然而，PD-1–PD-L1相互作用的功能后果取决于通过TCR和CD28传递的信号的相对强度。增加TCR或CD28信号水平可以规避激活阶段PD-1结扎的抑制作用。在缺乏PD-1–PD-L1相互作用的情况下，T细胞激活所需的TCR信号阈值将降低，这与产品开发-1–缺陷小鼠6.

在我们的实验中，当PD-L1与抗CD3共固定时观察到抑制作用。这将允许TCR和PD-1的聚合，与PD-1的免疫受体酪氨酸基抑制基序一致，PD-1通过招募含有Src同源性2（SH2）结构域的酪氨酸磷酸酶来传递负信号。事实上，使用A20II1.6 B淋巴瘤细胞系，我们已经证明B细胞受体和PD-1的共交联减少了仅通过B细胞受体交联观察到的钙内流，并导致PD-1细胞质区域与SHP-2的相互作用（我们的未发表数据）。此外，多种信号分子的酪氨酸磷酸化受到抑制，导致增殖反应受到抑制。

Dong等人。16经PD-L1/B7-H1和低水平抗CD3刺激的T细胞增殖和IL-10分泌增加。以前的工作已经证明产品开发-1表达不是结构性的，而是由抗原受体交联诱导的2,三因此，产品开发-1在我们的检测中，T细胞被高水平的抗CD3刺激，预计将被表达并能够与PD-L1相互作用。尚不清楚Dong等人是否报道了PD-L1/B7-H1共刺激。16是PD-1依赖性的，或者它是否可以由PD-L1的替代受体介导。如果PD-L1存在第二个共刺激受体，这种情况将与共刺激/抑制CD28/CTLA-4受体-B7-1/B7-2配体对的情况平行。在我们的实验中，我们没有发现PD-L1诱导IL-10分泌。值得注意的是，Dong等人发现针对IL-2的中和抗体阻断了B7-H1介导的IL-10生成增加，表明IL-10的生成是IL-2依赖性的16因此，IL-10分泌增加可能是由于细胞群的扩增，而不是直接诱导。

这个产品开发-1基因类似于CTLA-4型因为它只在T细胞激活后表达。因此，我们预计PD-1–PD-L1相互作用在设定再刺激场所的TCR阈值要求方面可能是最重要的。迁移到外周的先前激活的T细胞可以在表达PD-L1型但很少或没有B7-1号机组,B7-2号机组或其他共刺激分子。这种相互作用不会导致T细胞膨胀，除非在强烈的TCR结扎条件下。在缺乏CTLA-4的情况下，小鼠会发展成一种快速而致命的T细胞增殖性疾病，导致多器官损伤22,23如果与CTLA-4结扎相比，PD-1结扎在免疫反应后期为T细胞激活提供了一个检查点，那么这可能解释了产品开发-1–与CTLA-4型-缺乏小鼠。或者，具有这些无效突变的小鼠之间的表型差异可能反映了它们各自配体表达模式的差异。

的表达模式B7-1号机组,B7-2号机组、和PD-L1型是不同的。B7-2号机组CD28的配体之一CTLA-4型，在单核细胞上组成性表达；然而B7-1号机组和B7-2号机组在任何器官中都看不到。B7-1号机组和B7-2号机组可在树突状细胞、巨噬细胞和B细胞中诱导表达15以及一些类型的成纤维细胞和上皮细胞。相反，PD-L1型由心脏、胎盘、骨骼肌和肺等非淋巴样实质器官组成，但不由小肠组成(16;图3D） ●●●●。PD-L1型也在一些癌症中表达，因为三种EST来自人类卵巢肿瘤。这增加了一些肿瘤可能使用PD-L1型抑制抗肿瘤免疫反应。我们发现了PD-L1型单核细胞和角质形成细胞的表达通过IFN-γ刺激而增强。活化后，角质形成细胞表达MHC II类，但不表达B7-1型或B7-2号机组24.诱导PD-L1型细胞因子如IFN-γ或其他炎症刺激的表达可能导致TCR/CD28介导的T细胞活化减弱。这在炎症或自身免疫反应的效应部位可能具有特殊意义。作为产品开发-1在活化的T细胞和B细胞上表达2，表达式PD-L1型在非淋巴样组织和树突状细胞中，可能允许在免疫激活位点和效应位点调节潜在的自身反应性淋巴细胞.这可能是限制心脏、肺、肾和胎盘中T细胞和B细胞活性的一个特别重要的机制PD-L1型高度表达。在这种情况下，配体是一种有效的免疫阴性调节物，也在包括小肠和睾丸在内的非淋巴样组织中表达25有趣的是PD-L1型和配体似乎通常是相互排斥的，表明Fas–Fas-L和PD-1–PD-L1通路对外周耐受的非冗余调节。

我们感谢M.Yamamoto女士和Y.Tabuchi女士的技术援助，感谢K.Saito女士的秘书帮助。我们感谢N.Minato博士的有益讨论。

这项工作得到了日本教育、科学、体育和文化部卓越中心拨款以及国立卫生研究院拨款AI39671、AI41584和CA84500（给G.J.Freeman）的支持。