ZO-1控制内皮粘附连接、细胞-细胞张力、血管生成和屏障形成

内皮细胞（EC）覆盖血管和淋巴管的内表面，在血管的形成和功能中起着关键作用。内皮细胞-细胞连接的调节在炎症和血管生成中至关重要，不正确的连接通透性是急性肺损伤和败血症发病率和死亡率的主要因素(Weber等人，2007年；Haskard等人，2013年). EC稳态需要整合粘附部位与细胞外基质和邻近细胞的信号，以及循环因子和机械刺激的信号。我们才刚刚开始了解这些不同类型的信号如何相互影响，以及它们如何影响内皮细胞的行为和功能(卡瓦拉罗和德贾纳，2011年；Pulimeno等人，2011年). 粘附部位机械力的整合、传递和调节至关重要，因为它们推动血管的发展和疾病的进展，如动脉粥样硬化和高血压(Conway和Schwartz，2012年).

细胞间紧密连接对内皮屏障的形成至关重要，因为它们调节细胞旁扩散。它们也与血管生成和极化有关，它们的组成和完整性受到致癌和炎症的影响(巴佐尼，2011年；马丁，2014). 紧密连接由不同类型的跨膜蛋白和一组复杂的细胞溶质蛋白组成，这些蛋白将连接膜连接到细胞骨架，以调节内皮屏障功能(兰普格纳尼，2012年). EC中的紧密连接跨膜蛋白包括克劳丁-5、闭塞素和几个JAM。Claudin-5是小鼠血脑屏障通透性的关键决定因素(Nitta等人，2003年)和JAM家族粘附蛋白与血管生成、迁移以及与FGF-2和αvβ3整合素信号的串扰有关(Lamagna等人，2005年；Cooke等人，2006年；Severson等人，2009年；Peddibhotla等人，2013年).

ZO-1是一种连接衔接蛋白，与多种其他连接成分相互作用，包括克劳丁和JAM家族的跨膜蛋白(Bazzoni等人，2000年；Ebnet等人，2000年；Fanning和Anderson，2009年). 这种相互作用与结合伙伴的定位和功能的相关性尚不清楚，主要是因为在分析的上皮模型系统中由于ZO-2的功能冗余而缺乏明确的表型。同样，ZO-1结合F-actin并与肌动球蛋白细胞骨架的调节有关；然而，有关上皮细胞的报道结果是相互矛盾的，尚不清楚ZO-1对整体肌动球蛋白功能是否重要(Yamazaki等人，2008年；Van Itallie等人，2009年；Fanning等人，2012年). 这与EC形成对比，因为ZO-1基因敲除小鼠具有胚胎致死性（胚胎期9.5–10.5天），而ZO-1是卵黄囊中正常血管形成所必需的，这表明ZO-1可能对内皮组织组织具有重要功能。然而，ZO-1对卵黄囊血管形成的重要性及其对内皮通透性的影响的潜在细胞和分子机制尚不清楚(Katsuno等人，2008年).

在这里，我们询问了ZO-1是否对原发性人类皮肤微血管内皮细胞（HDMEC）的内皮完整性和功能很重要，以及它是否调节内皮细胞的血管生成特性。我们的结果表明，ZO-1确实在体内外调节血管生成，并且对内皮屏障的形成至关重要，空间肌动球蛋白组织、细胞-细胞张力以及细胞迁移。我们的数据表明，结合ZO-1的不同连接膜蛋白具有不同的用途，JAM-A与ZO-1和claudin-5形成一个协同单位，作为屏障形成所需的下游效应器。我们证明，ZO-1通过包含JACOP和RhoA激活剂p114RhoGEF的结合调控复合体的募集来调节VE-cadherin复合体中机械传感器的募集，从而调节结合张力。因此，我们的数据建立了一个分子调控网络，紧密连接通过该网络调节粘附连接以及内皮细胞的行为和功能。

我们利用HDMEC建立了一种损失函数方法来确定ZO-1在EC中的作用。之所以选择HDMEC，是因为我们发现它们能够形成坚固且规则的结合复合体。两种不同的siRNA被鉴定为有效下调ZO-1(图1、A和B).

ZO-1被认为调节上皮细胞中的肌动球蛋白细胞骨架；然而，其功能仍有争议，因为耗竭与结合肌动球蛋白的增加和减少有关(Yamazaki等人，2008年；Van Itallie等人，2009年；Fanning等人，2012年). 因此，我们询问了ZO-1的缺失是否对EC中结合肌动球蛋白的募集和活性有影响。在对照组HDMEC中，β-肌动蛋白和肌球蛋白IIA形成了一条连接带，对双磷酸化肌球蛋白轻链2（MLC2）呈阳性，这表明肌球蛋白是活性的(图1 C). 在去除ZO-1后，肌球蛋白IIA和β-肌动蛋白沿着细胞基底重新分布并形成应激纤维，这些细胞对双磷酸化MLC2也呈阳性反应。通过免疫印迹，双磷酸化的MLC2水平增加，而单磷酸化的MLC2水平保持相似(图1D). 当小鼠GFP标记的ZO-1在缺失ZO-1的人类EC中表达时，肌球蛋白的连接定位被挽救，应激纤维的形成被抑制，这表明在缺失细胞中观察到的表型是特异的(图1 E). 因此，ZO-1的缺失导致肌动球蛋白细胞骨架的重组。

接下来，我们询问这些变化是否导致接合复合体上张力的改变。我们使用了一种基于VE-cadherin的FRET生物传感器，该传感器在p120和β-catenin结合位点之间的细胞质域中携带一个弹性力传感器(Grashoff等人，2010年；Conway等人，2013年).图2（A和B）表明传感器对β-catenin结合位点的存在很敏感，这表明探针对作用于VE-cadherin的力作出了响应。ZO-1的耗尽也导致FRET效率增加，表明作用于VE-cadherin上的张力减小(图2，A和B). 因此，ZO-1表达降低刺激VE-cadherin张力降低，这表明ZO-1调节粘附连接的张力。

接下来，我们通过激光消融确定VE钙粘蛋白张力的降低是否真的转化为内皮细胞-细胞接触张力的降低。用编码GFP–α-catenin的慢病毒载体感染HDMEC以标记细胞-细胞边界，然后用siRNA转染HDMEC。在对照细胞中，细胞消融导致邻近细胞收缩，消融细胞覆盖的表面延伸(图2 C和视频1). 在ZO-1缺失的细胞中，消融细胞的伸展和邻近细胞的收缩均减少了>60%(图2，C–E; 和视频2). 因此，ZO-1调节内皮细胞-细胞接触的张力。

因此，我们的数据表明，ZO-1是内皮空间肌动球蛋白组织的重要协调器，并调节作用于粘附连接处的张力。

血管生成需要复杂的肌动蛋白重组和EC迁移来生成功能性新血管。因此，我们询问ZO-1是否调节EC的血管生成潜能。我们首先使用迁移试验来确定ZO-1能否影响集体细胞迁移。图3（A和B）显示缺乏正常ZO-1表达的细胞迁移较少。体外Matrigel小管生成试验进一步表明，ZO-1缺失导致体外网络形成减少(图S1、A和B). 在基于3D微载体（MC）的纤维蛋白凝胶血管生成试验中，也发现ZO-1缺失可以减少内皮细胞的发芽(图3，C–E). 因此，ZO-1调节HDMEC原代培养物的血管生成潜能。

接下来，我们测试了ZO-1下调是否抑制体内血管生成。为了抑制小鼠ZO-1的表达，我们设计并测试了特定的小鼠siRNA（图S1 C）。然后使用Matrigel plug模型将其中两个siRNA用于体内血管生成实验(Birdsey等人，2008年). 将含有siRNA、肝素和碱性FGF的Matrigel混合物皮下注射到C57BL/6小鼠体内。7天后，收集并分析塞子(图3F以及S1、D和E）。免疫荧光显示，在塞子的切片中，ZO-1特异性siRNA降低了ZO-1的表达（图S1 D）。苏木精和伊红染色对血管的定量显示，如预期的那样，FGF强烈刺激血管生长。对照siRNA对FGF的血管生成反应没有显著影响，而ZO-1 siRNA使血管数量减少了～50%(图3，F和G; 和图S1 E）。因此，ZO-1也在体内小鼠模型中调节血管生成。

这些数据表明，ZO-1不仅对皮质肌动球蛋白功能至关重要，而且还调节内皮细胞迁移和血管生成。

为了确定ZO-1缺失的分子后果，我们接下来询问ZO-1是否是细胞-细胞接触中结合蛋白和机械转导物招募所必需的。ZO-1的耗竭导致紧密连接的两个关键跨膜成分（第5条和JAM-A）的连接募集减少(图4，A和B). Claudin-5也在较低水平表达，至少部分是由于溶酶体降解(图S2 A). 相反，ZO-2的定位没有受到影响，ZO-1被认为与ZO-1有冗余功能。因此，这些实验确定了EC中不与ZO-2共享的ZO1特定功能。

生物传感器和消融实验表明，ZO-1的耗竭导致基于VE钙粘蛋白的连接上的张力降低；因此，我们检查了钙粘蛋白和相关连环蛋白的分布。然而，VE-cadherin、α-和β-连环蛋白或p120catenin的定位和总表达水平均未受到明显影响(图4、B和C). 由于ZO-1的下调影响细胞-细胞张力，我们接下来研究了vinculin的定位和表达，这表明通过与α-catenin结合与内皮VE-cadherin连接的力依赖性联系(Grashoff等人，2010年；Yonemura等人，2010年；Huveneers等人，2012年).图4（D和E）显示ZO-1的下调触发了从细胞-细胞连接处到局灶性粘连处的vinculin的重新分布，反映了活性肌球蛋白的变化，如图1GFP标记小鼠ZO-1的表达挽救了vinculin在耗尽细胞中的连接定位（图S2 B）。ZO-1的耗竭还导致免疫沉淀的α-连环蛋白和VE-cadherin复合物中的小病毒素选择性丢失，并增加与黏附蛋白talin的共沉淀(图4，F–H)这支持了ZO-1调控VE-cadherin基连接的力生成和传递机制的招募这一结论。

在ZO-1缺失的细胞中，维酮的重新分布表明，将肌动球蛋白生成的力耦合并调节到粘附部位的分子复合物可能与肌球蛋白IIA一起重新分布；因此，我们测试了这种超分子组装的其他成分。在对照细胞中，PAK2和磷酸化paxillin在细胞-细胞连接处富集，但在ZO-1缺失细胞中集中于局部粘连(图4 D). 局部粘连处ILK和活化FAK的染色也对ZO-1缺失作出反应(图4 D).

迄今为止的数据表明，ZO-1调控粘附复合物主要成分的空间分布，这些复合物调节细胞-细胞连接和局部粘附处的力产生和传递，对细胞-细胞张力、迁移和血管生成产生重大影响。

Claudin-5是连接膜内链的成分，是小鼠血脑屏障通透性的关键决定因素(Nitta等人，2003年); 因此，我们询问其在细胞连接处的消失是否与ZO-1缺失诱导的细胞-细胞张力、迁移和血管生成缺陷有关(图4，A和B).

靶向claudin-5的siRNAs诱导了蛋白质的有效消耗，并显著增加了内皮通透性，表明内皮屏障受损（图S2，C-G）。细胞数量、坏死或凋亡没有差异，这表明通透性的增加是由于细胞旁扩散屏障的缺陷所致（未发表的数据）。由于细胞旁扩散的增加与我们在ZO-1缺失时观察到的结果相当，ZO-1耗尽细胞中结合克劳丁-5的缺失足以解释屏障缺陷。相反，claudin-5缺失既不影响连接和细胞骨架标记，也不影响小管生成和迁移（图S2）。因此，claudin-5的缺失导致内皮通透性屏障的选择性缺陷，而不是ZO-1缺失引起的其他表型变化。

JAM-A调节内皮细胞迁移和血管生成，因为它同时影响FGF-2和αvβ3整合素信号(Nehls和Drenckhahn，1995年；Lamagna等人，2005年；Cooke等人，2006年；Severson等人，2009年；Peddibhotla等人，2013年). 因此，我们接下来询问第二紧密连接蛋白是否受到ZO-1缺失的影响(图4，A和B)对细胞骨架重排很重要。

JAM-A被两个siRNAs有效地耗尽，并影响claudin-5和ZO-1的定位，但不影响VE-cadherin(图5). 因此，JAM-A和ZO-1似乎是以双向合作的方式联系在一起的，因为它们都会影响对方的分布，并且都是紧密连接处第5条定位所必需的。JAM-A表达减少导致PAK2和vinculin从细胞接触到局灶性粘连的再分布和应力纤维的诱导(图5 C). 因此，ZO-1和JAM-A形成一个调节紧密连接装配和细胞骨架组织的功能单元。

ZO-1和JAM-A的耗竭刺激了肌动蛋白细胞骨架的显著重组。在受影响的细胞骨架蛋白中，PAK2被观察到调节内皮收缩性和连接完整性(Stockton等人，2004年). PAK2的耗尽对连接形态有显著影响(图6，A和B). 尽管ZO-1和claudin-5仍然是连接的，但它们的分布部分中断且不规则。VE-cadherin变得不规则，不再形成线性连接。因此，PAK2对于紧密和粘附连接的正常组织至关重要。

接下来我们分析了对肌动球蛋白细胞骨架的影响。肌球蛋白IIA重新分布，应激纤维以类似于ZO-1耗竭时的方式对PAK2耗竭作出反应(图1 C和6摄氏度). 文丘里也从细胞接触中消失，并与PAK2缺失引起的显著的局灶性粘连有关。磷酸化的MLC2从连接处丢失，并沿基底肌动蛋白纤维富集(图6、C和D). 因此，PAK2缺失导致肌动蛋白细胞骨架的重组类似于ZO-1或JAM-a缺失，这表明ZO-1–或JAM-a缺失细胞中结合蛋白PAK2的缺失与功能相关，并且激酶是维持内皮连接所必需的。ZO-1和claudin-5仍然是连接的，这表明PAK2在ZO-1下游起作用。

ZO-1或JAM-A的耗竭导致连接肌球蛋白IIA的损失，有利于应激纤维。这与vinculin的类似再分配相平行；因此，我们推测细胞骨架的重组和细胞连接的变形是由肌球蛋白生成的亚细胞张力分布不平衡引起的。为了测试这一点，我们测试了ROCK抑制阻止肌球蛋白激活的能力。

ROCK抑制对siRNA诱导的表型有显著影响(图7). 因ZO-1或JAM-A缺失而丢失的连接蛋白在细胞-细胞接触时再次累积（仅恢复了claudin-5的定位，而非表达水平；未公布的数据）。细胞-细胞连接处的肌球蛋白IIA、β-actin和vinculin增加，而局部粘连和应力纤维消失。也招募了PAK2；然而，在ROCK抑制剂存在的情况下，ZO-1缺失细胞的连接磷酸化MLC2仍然较低（未发表数据）。

ROCK被RhoA信号激活。因此，我们使用生物传感器测试了ZO-1缺失是否影响活性RhoA的分布。图S3显示ZO-1缺失导致细胞-细胞接触处RhoA活性降低，而其余细胞的活性增加。

因此，这些数据表明，内皮表型是通过细胞-细胞和细胞-基质接触处肌球蛋白生成张力之间的平衡来维持的，并且需要ZO-1和JAM-a来维持结合肌球蛋白活性，可能涉及RhoA调节器的结合招募。

钙粘蛋白通常被认为是细胞-细胞连接的主要组织者；然而，EC中关于VE钙粘蛋白在紧密连接成分募集中的作用的数据是相互矛盾的。VE-cadherin可以有效地被耗尽(图8 A)强烈影响核心粘附连接成分α-和β-连环蛋白的连接募集(图8 A). 肌动蛋白和肌球蛋白IIA从连接处重新分布到应力纤维，vinculin和PAK2重新分布到局灶性粘连，紧密连接被破坏。ROCK抑制并不能挽救α-和β-连环蛋白的破坏，但ZO-1、claudin-5和JAM-A重新定位到细胞-细胞连接处，应力纤维减少，管状蛋白和PAK2从局部粘连中消失(图8 C). 这些数据表明，VE-cadherin在ZO-1上游发挥作用，并通过调节肌动蛋白细胞骨架和肌球蛋白收缩性，部分地对其进行招募。再加上表型的重叠，这表明ZO-1是调控机制的一个组成部分，这些调控机制被VE-cadherin激活以刺激内皮连接形成，并介导肌动蛋白细胞骨架的重组以形成功能性内皮连接。

接下来，我们询问ZO-1和肌动球蛋白之间的联系是否可能涉及Rho信号调节器。RhoA激活剂p114RhoGEF通过与ROCK-II和肌球蛋白形成复合物，驱动上皮细胞中结合肌球蛋白的激活(Terry等人，2011年,2012). 它被扣带蛋白募集到上皮紧密连接处；然而，HDMEC仅表达少量的扣带蛋白，且呈异质性（未发表数据）。已经鉴定出一种扣带蛋白样蛋白，JACOP/副扣带蛋白，这两种蛋白似乎具有重叠的功能(Ohnishi等人，2004年；Citi等人，2012年).

抗JACOP抗体强烈染色HDMEC紧密连接，蛋白质的耗竭导致连接染色的丢失(图9、A和B). 然而，ZO-1仍被招募到紧密连接处。相反，ZO-1的缺失也导致JACOP的重新分布，JACOP沿着中央基底膜转移到应力纤维上，其周围的结构与细胞-细胞接触不同(图9 B). JACOP与ZO-1共免疫沉淀，而不是vinculin，这表明JACOP和ZO-1形成复合物(图9 C). 因此，ZO-1介导EC中JACOP的紧密连接募集。此外，ZO-1缺失还导致p190RhoGAP向粘附连接的募集减少，这是一种已知参与下调RhoA信号转导以响应钙粘蛋白结扎的蛋白质(图S4). 引人注目的是，JACOP的缺失也刺激了vinculin从连接处重新分布到局部粘连和应力纤维的诱导，这表明JACOP将ZO-1与肌动球蛋白系统的调节联系在一起(图9 B).

在上皮细胞中，扣带回蛋白可以将p114RhoGEF募集到紧密连接处(Terry等人，2011年). 由于扣带蛋白和JACOP是同源蛋白，我们询问JACOP是否与p114RhoGEF相关。事实上，p114RhoGEF和JACOP共同从内皮细胞提取物中免疫沉淀，并且ZO-1和JACOP都需要用于p114RhosGEF的结合招募(图9、B和E). 尽管JACOP与ZO-1共免疫沉淀，但我们无法在p114RhoGEF沉淀中检测到ZO-1。因此，这三种蛋白质似乎不太可能形成稳定的结合相关异源三聚体复合物，但全球环境基金的招募可能涉及短暂的相互作用。p114RhoGEF而非ZO-1免疫沉淀物中含有维酮的观察进一步支持了这一点(图9、C和E). 然而，p114RhoGEF的缺失导致结合管状蛋白的丢失，管状蛋白染色的局灶性粘连和应力纤维的诱导与ZO-1和JACOP的缺失相当(图9、B和D; 和图S5). 相反，GEF-H1也结合JACOP，在紧密连接处不起作用，其缺失并没有减少vinculin染色，也没有诱导应力纤维。因此，这些数据表明，ZO-1和JACOP将p114RhoGEF招募到内皮连接处，以刺激连接肌动球蛋白的激活，从而确保机械传感器与VE-cadherin复合体的耦合。

ROCK抑制逆转ZO-1缺失细胞表型的观察表明肌球蛋白活性参与其中。因此，我们将肌球蛋白抑制剂Blebbistatin添加到siRNA转染的细胞中，并测试F-actin和JAM-A的再分配。无论是否转染对照、ZO-1或p114RhoGEF siRNA，Blebistatin处理的细胞都具有相同的表型。F-actin和JAM-A染色连接处均呈波浪状，但仍保持组装状态，未诱导应激纤维，这表明肌球蛋白活性确实是ZO-1或p114RhoGEF缺失细胞表型所必需的(图10，A和B). 使用Arp2/3复合物抑制剂CK666或formin抑制剂SMIFH2抑制肌动蛋白聚合并不能阻止ZO-1或p114RhoGEF缺失表型的诱导(图10，A和B). 因此，ZO-1或p114RhoGEF缺失细胞的连接分离需要ROCK和肌球蛋白活性。

考虑到肌动球蛋白系统在连接组装中的作用，如果耗尽的细胞尚未形成完全成熟的连接，则可以假设ZO-1耗竭的效果不同。因此，我们用低密度的细胞板重复了siRNA实验。低密度细胞中ZO-1或p114RhoGEF的耗竭导致肌动球蛋白重组，细胞之间显示出类似于未开始形成线性连接的对照细胞的间隙(图10 C). 甚至VE-cadherin本身的分布也受到了影响，因为该蛋白只在斑点状细胞-细胞接触中检测到，而不是在耗尽细胞中的线性连接中检测到(图10D). 正如在正常细胞密度下观察到的紧密连接蛋白一样，抑制ROCK导致对照细胞和耗尽细胞中形成线性VE-cadherin染色。在没有细胞-细胞接触的细胞中，如果这两种蛋白质在细胞-细胞的接触中正常发挥作用，那么这两种蛋白中的任何一种的缺失都不会产生任何可检测的影响。因此，这些观察结果进一步支持了ZO-1指导内皮细胞中的空间肌动球蛋白组织调节连接组装和完整性的结论。

内皮紧密连接是血管通透性屏障的重要组成部分。紧密连接被认为受钙粘蛋白信号调节，但尚不清楚其调节粘附连接。在这里，我们发现，与上皮细胞相比，紧密连接接头蛋白ZO-1对人类微血管EC中的屏障形成至关重要，它调节钙粘蛋白介导的细胞-细胞张力和细胞骨架组织，以及血管生成潜力和细胞迁移。ZO-1在EC中起着主要的细胞骨架组织者的作用，不仅决定了F-actin的总体分布，而且还决定了向VE-cadherin复合物招募力刺激连接蛋白和力传递细胞骨架连接物，从而决定了作用于粘附连接的张力。紧密连接可以调节粘附连接。

小鼠ZO-1缺陷已被证明会导致卵黄囊血管缺陷，血管树改变与JAM-A定位错误有关(Katsuno等人，2008年). 然而，这种缺陷的潜在分子和细胞机制尚不清楚。此外，在该模型中，对渗透性的影响尚不清楚，因为卵黄囊血管已经对野生型动物中使用的示踪剂具有渗透性。上皮细胞中ZO-1缺陷的影响取决于实验条件，在连接形成方面，ZO-1和ZO-2似乎具有冗余功能。在Eph4乳腺上皮细胞和F9细胞中，ZO-1和-2的联合缺乏导致紧密连接的丧失，并形成E-钙粘蛋白和重组F-肌动蛋白阳性但肌球蛋白II阴性的粘附连接(Yamazaki等人，2008年). 相反，据报道，在MDCK细胞中，ZO-1和ZO-2的缺失会导致与粘连连接和顶端收缩相关的结合周肌动球蛋白环的扩张(Fanning等人，2012年). 目前还没有对这些显著差异的解释。此外，ARHGEF11也被确定为乳腺上皮细胞中结合相关肌动球蛋白的ZO-1结合调节因子，但只有同时敲除ARHGEF1和ZO-2才会导致TJ和结合周围肌动球球蛋白环的显著损伤，与ZO-1和ZO-2中都被耗尽时类似(Itoh等人，2012年). 相反，p114RhoGEF可以影响上皮连接组装而不消耗其他连接蛋白(Terry等人，2011年). 在我们的HDMEC实验中，仅消耗ZO-1或p114RhoGEF就足以诱导肌动球蛋白细胞骨架的戏剧性重组。与任何分析的上皮模型不同，ZO-1缺失导致沿基底细胞膜的肌球蛋白活化增加，并导致应力纤维形成。HDMEC表达ZO-2，不受ZO-1缺失的影响，表明这两种蛋白在EC中没有冗余。此外，我们的ROCK抑制实验表明，上皮细胞中观察到的相互矛盾的表型可能是由不同上皮模型系统中细胞-基质粘附位点产生的差异张力引起的。在极化的简单上皮细胞中，黏附物和紧密连接在外侧质膜顶端的空间上很好地分离。然而，在EC中，这种拓扑分离并没有明确定义，这可能是ZO-1对接头组装更为普遍重要的原因。然而，ZO-1的作用是否取决于上皮细胞和EC之间连接复合体的不同拓扑结构，还需要进一步分析。

EC和上皮细胞中的粘附连接被认为是张力的中心承载者，张力对组织发育、体内平衡和功能的调节至关重要(肖等人，2003；Birdsey等人，2008年；霍夫曼等人，2011年；Yonemura，2011年；Conway等人，2013年；Huveneers和de Rooij，2013年). 虽然很明显，这些力是由肌球蛋白马达产生的，并通过张力敏感的连接物（如vinculin）进行传递，但仍不清楚导致这些力的空间调节的信号通路是如何协调的。我们的数据表明，ZO-1是原发性EC中的一种调节因子，对维持粘附连接上的张力至关重要。ZO-1的耗尽不影响核心VE-cadherin复合物的组装；然而，vinculin和myosin II不再与该复合物相关，为张力降低提供了分子解释。此外，我们的数据进一步表明，连接和基础肌动球蛋白活性之间的平衡是连接组装的关键决定因素，因为抑制ROCK或肌球蛋白足以挽救紧密连接蛋白的募集。

VE-cadherin通过刺激RhoA调节细胞骨架张力、细胞扩散和局部粘附(肖等人，2003；Hu贴面和de Rooij，2013年)肌球蛋白II是产生肌动蛋白的主要肌动蛋白马达。因此，ZO-1调节VE-cadherin与力产生机械的功能耦合。肌球蛋白的抑制抵消了肌球蛋白和管状蛋白的重新分布，表明是局部粘连和连接复合体之间的力平衡对连接组装很重要，而不是力本身。抑制ROCK不仅影响细胞骨架，还逆转连接蛋白5和JAM-A的重新分布，表明连接张力的维持是ZO-1的主要功能。

我们的数据表明，ZO-1激活了对内皮连接稳态至关重要的多条通路。连接张力明显由肌动球蛋白细胞骨架调节，ZO-1缺失导致两条通路的放松，这两条通路可以影响肌动球素细胞骨架的活性。ZO-1缺失导致连接PAK2的丢失，激酶的缺失足以重演细胞骨架蛋白的重新分布。然而，PAK2对于claudin-5的连接募集并不重要；claudin-5的缺失足以破坏内皮屏障，但不影响肌动蛋白驱动的过程，如迁移。因此，PAK2和claudin-5代表了ZO-1调节的两条不同的途径。相反，对ROCK的抑制导致ZO-1缺失细胞中结合克劳丁-5的恢复，以及PAK2和肌动球蛋白细胞骨架成分的结合募集的恢复。因此，这些结果表明，ZO-1在连接组装中的主要作用是通过涉及ROCK的途径促进肌球蛋白激活，从而维持连接张力，从而整合不同的途径来协调连接内稳态和调节。

我们的数据表明，JACOP和p114RhoGEF是ZO-1激活的连接ROCK信号机制的主要成分。ZO-1与JACOP形成复合物，这两种蛋白都是p114RhoGEF结合招募所必需的。在小鼠心肌细胞中，ZO-1被证明能直接结合维酮(Zemljic-Harpf等人，2014年); 然而，我们无法在EC中检测到这种vinculin–ZO-1复合物，并且当ROCK被抑制时，在没有ZO-1的情况下，vincullin可以被招募到连接处。此外，我们的数据表明，p114RhoGEF和JACOP是一种生物化学复合物的一部分，该复合物也含有维库林，但不含ZO-1。因为ZO-1可以直接绑定JACOP(Citi等人，2012年)它可以作为JACOP结合招募的平台，然后JACOP与其他成分（如p114RhoGEF和vinculin）形成复合物来调节和介导机械传递。

Claudin-5和JAM-A是EC中ZO-1的主要伙伴。这两种跨膜蛋白以前都被证明与ZO-1直接相互作用(Bazzoni等人，2000年；Ebnet等人，2000年；Ooshio等人，2010年；Nomme等人，2011年). 根据我们的耗竭数据，JAM-A的功能与ZO-1的功能非常相似，这表明这两种蛋白质相互合作。JAM-A与细胞旁通透性、细胞极性、粘附、迁移和血管生成的调节有关，而血管生成与FGF-2和整合素信号传导有关(Nehls和Drenckhahn，1995年；奈克和奈克，2008年；Gutwein等人，2009年；Severson等人，2009年；Peddibhotla等人，2013年). 在这里，我们证明，JAM-A在原发性EC中的下调诱导肌动蛋白/肌球蛋白II应力纤维的形成，以及管状蛋白和PAK2从粘附连接到局灶性粘连的再分配，类似于ZO-1。在体外含VEGF-、FGF-2-和IGF-的培养基中，ZO-1缺失的细胞显示出血管生成潜能降低，在插管实验中，在体内由FGF-2诱导的血管生成潜能也降低。众所周知，JAM-A可以调节血管生成(Peddibhotla等人，2013年). 这表明ZO-1和JAM-A在EC中的协同作用不仅与屏障的形成有关，而且与血管生成等动态细胞过程有关，这可能是由于肌动蛋白细胞骨架的失调，从而导致空间张力分布。

ZO-1或JAM-A的耗尽导致连接子句5的重新分布。通过抑制ROCK可以恢复连接积累，这表明张力的分布调节细胞连接处的claudin-5积累（但不调节表达水平）。由于ROCKs已被证明能磷酸化克劳丁-5，差异克劳丁磷酸化也可能有助于调节连接募集(山本等人，2008年). ZO-1还通过转录后机制影响claudin-5的表达，因为mRNA水平不受ZO-1缺失的影响（未公布的数据）。然而，氯喹对溶酶体功能的抑制部分逆转了claudin-5的表达水平，这表明表达减少是由于紧密连接断裂后的降解所致。

总之，ZO-1是EC中细胞间连接的中央调节器，协调肌动球蛋白活性的空间组织，从而调节连接张力和VE-粘附蛋白连接与力生成机制的连接、紧密连接蛋白的招募和屏障形成以及内皮细胞动力学。我们的数据表明，ZO-1和JAM-A形成了一个协同单元，作为内皮紧密连接的主调节因子，通过JACOP和p114RhoGEF刺激连接肌动球蛋白激活，从而调节内皮屏障的形成、细胞-细胞张力，以及通过补充额外的肌动球蛋白调节剂，如vinculin和PAK2，具有血管生成潜力。

从PromoCell中获得人类皮肤微血管EC（HDMEC-c成人c-12212），将其固定在内皮细胞生长培养基MV2中0.5%明胶（G1393；Sigma-Aldrich）涂层的组织培养皿上，并补充c-39225补充剂混合物（PromoCel）。在第二代和第四代之间使用细胞。以下序列为siRNAs靶向序列：人类ZO-1，5′-GCAAAGACAUGAUAAA-3′和5′-CAAAAGAUGAUCCUUA-3′；小鼠ZO-1，5′-UAACGGAGUUUCAAUGGAU-3′和5′-GUAGGAGAUUCAUUCUAUA-3′；Cldn5，5′-CAAGAGAACUACGUCUGA-3′，5′-CAUGUCGUCCGGAGUUU-3′和5′-UGGCGUGGUGCGCUU-3′；JAM-A，5′-GCCUAUUUGUCUUCUACA-3′和5′-GUAGUGGAUGCUACGAAU-3′；PAK2，5′-GGAUUUCUUAAAUCGAUGU-3′和5′-GACAUAUGGUCUGGGUA-3′；和VE-Cadherin，5′-GUGGAUUACGACUUCCUUA-3′和5′-GGUAGGAUCGUGGGGGA-3′。GEF-H1（5′-GGACAGAGCCUUCAGUGUA-3′，5′-CAACAUGGACAUUUUC-3′，5'-GAAUAAGAGAGAGAUGUAGA-3′，和5'-GUGCGGAGAGUGUAA-3′）、p114RhoGEF（5′-UCAGGCUUGAGAUA-3′和5'-GGACGGACAAU-3′）、，和JACOP（CGNL1，5′-GCAGGAGCUCGCAGAAAU-3′，5′-CGGAGUACCUGAUGAUUUUU-3′，5’-CGAGUAAAGUGCUGAUGA-3′和5′-GGGAGAAAUACGACAGUA-3′）如前所述(Terry等人，2011年,2012；Elbediwy等人，2012年). 非靶向对照siRNA为5′-UGUUACAUGGUACUAA-3′和5′-UGUUUACAUGUUGUGUGA-3′。所有siRNAs均来自赛默飞世尔科技公司和Sigma-Aldrich公司。根据实验条件，HDMEC被镀在多孔培养皿中（例如，48孔培养皿的每孔30000个细胞，放置在10-mm的盖玻片上，之前用0.8 mg/ml Matrigel或140 mm NUNC板处理；500000个细胞）。第二天，根据制造商的说明，使用Lipofectamine RNAmax（Life Technologies）在无抗生素培养基中使用20–80 nM的最终siRNA浓度进行siRNA转染。24h后，更换培养基，2-3d后收集细胞进行免疫荧光、免疫印迹或免疫沉淀。为了进行DNA转染，将质粒与JetPei（Polyplus）混合并与细胞孵育2 h。GFP标记的小鼠ZO-1 cDNA由J.Ikenouchi（日本福冈九州大学）慷慨提供。以10µM的浓度使用ROCK抑制剂Y27632（研发系统）。Blebbistatin（100μM）、CK666（20μM）和SMIFH2（25μM）购自Tocris Bioscience。按照指示将抑制剂添加到培养基中24小时。如前所述，在100µM的浓度下使用氯喹（Sigma-Aldrich）10小时(肖等人，2003).

在−20℃下用甲醇固定电池^o个5分钟，95%乙醇在−20℃下10分钟^o个或在室温下用3%PFA培养20分钟，然后用0.3%Triton X-100渗透5分钟。然后用指示的一级抗体培养细胞，并用标记有Cy3、Cy5或Alexa Fluor 488的二级抗体标记细胞（Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.），如前所述，使用Hoechst 33258（Sigma-Aldrich）对细胞核进行可视化(Sourisseau等人，2006年). 使用ProLong Gold安装介质（Invitrogen）安装盖玻片，并将其储存在4°C下。使用荧光显微镜（DMIRB；徕卡）采集图像，使用63×/1.4 NA油浸物镜和相机（C4742-95；哈马松光电）以及简单PCI软件（哈马松光电（Hamamatsu Photonics）），或者使用倒置显微镜（Eclipse Ti-E；Nikon），使用60×/1.4 NA油浸物镜片和相机（CoolSNAP HQ2；Photometrics），和尼康软件。使用Photoshop CS4软件（Adobe）调整亮度和对比度。对于全细胞裂解物的免疫印迹，用PBS洗涤细胞两次，在SDS-PAGE样品缓冲液中裂解，并在70°C下变性10分钟(Sourissau等人，2006年). 然后用1毫升注射器和25克和3/4克的针头将样品均匀化，然后进行SDS-PAGE并在硝化纤维素膜上进行吸液。用溶于含有0.1%吐温-20的PBS中的5%脱脂奶粉封闭膜。使用了以下主要抗体：小鼠抗-ZO-1（Invitrogen）、小鼠抗-β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich）、兔抗-α-连环素（Sigma Aldrich，兔抗ILK（细胞信号技术）、鼠抗JAM-A（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、兔抗JAM-A（Invitrogen）、鼠对抗pMLC2（19；细胞信号技术，兔抗paxillin（细胞信号技术）、鼠抗p120Catenin（BD）、鼠反VE-Cadherin（BD）、兔抗VE-Cadherin（AbD Serotec）、鼠防Vinculin（Sigma-Aldrich）、兔反JACOP（Sana Cruz Biotechnology，Inc.）和羊抗p114RhoGEF（Everest Biotech Ltd.）。使用针对猪α-微管蛋白的11个C末端氨基酸产生的小鼠抗α-微管蛋白抗体(Kreis，1987年). 兔抗ZO-1（抗原：肽N-YTDQELDETLNDEVC-C）、抗ZO-2（抗原：肽类N-KMEGMDDDPEDRMSC-C）和GEF-H1（抗原：多肽N-CDFTRMQDIPEETES-C）已在前面描述过(Benais-Pont等人，2003年). 为了进行共免疫沉淀，将500000 HDMEC接种到用0.5%明胶处理过的140 mm NUNC细胞培养皿中。每次免疫沉淀使用三个培养皿。用RIPA缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCl，0.1%SDS，0.5%脱氧胆酸钠，和1%Triton X-100）在4°C下溶解细胞并提取，该缓冲液含有蛋白酶抑制剂混合物（50µg/ml PMSF，10µg/ml抑肽酶，10μg/ml亮氨酸肽和10μg/ml胃蛋白酶抑制素）。将全细胞裂解物与未结合的Sepharose珠在4°C下孵育30分钟。然后在10000下旋转提取物10分钟克在冷却的微型离心机中，将上清液装载到蛋白G–Sepharose上，该蛋白与兔抗α-连环蛋白抗体（Sigma-Aldrich）、小鼠抗碱性抗体（Simma-Aldrich）或小鼠抗VE-粘附素抗体（BD）结合。相应的阴性对照为兔或鼠IgG。在4°C的摇床上放置3.5小时后，用提取缓冲液清洗珠子，然后用PBS清洗。然后用免疫印迹法分析沉淀。

将涂有明胶的cytodex-3 MC（Sigma-Aldrich）悬浮在30%的PBS中并进行高压灭菌。MCs用EMB-2（Lonza）清洗，然后添加到EC中，最终密度为100个细胞/MC。siRNA转染后的第二天，HDMEC被胰蛋白酶化，并在37°C的1.5 ml培养基中附着到MCs 4小时。然后将MC重新悬浮，并在37°C的24孔培养皿中的1-2孔培养24-48小时（赛默飞世尔科技公司）。如前所述，将附着在MC上的HDMEC用于纤维蛋白凝胶血管生成检测(Nehls和Drenckhahn，1995年；Sun等人，2004年)进行了一些修改。纤维蛋白原（Sigma-Aldrich）的制备方法是将EBM-2中的纤维蛋白原储备溶液（PBS中的20 mg/ml）稀释至1.7 mg/ml的浓度，并分别以10 ng/ml和1.0µg/ml的浓度补充EGF（PeproTech EC Ltd）和氢化可的松（Sigma-Aldrich）。48-well板用于分析，每孔加入200µl含有～150 HDMEC涂层MC的纤维蛋白原溶液，并通过添加凝血酶（0.5 U/ml）诱导凝血。聚合30分钟后，将0.5 ml EBM-2补充10 ng/ml EGF、40 ng/ml bFGF（PeproTech EC Ltd）和VEGF-165（PeproTechn EC Ltd.）、1.0µg/ml氢化可的松和50 ml/L成人血清（Sigma-Aldrich）分层于凝胶顶部。为了防止纤维蛋白包埋细胞过度纤溶，仅在第一天将抑肽酶以200 KIU/ml的速度添加到生长培养基中。每隔2天更换培养基，并在纤维蛋白原培养4-5天后拍摄相位对比照片。然后用3%PFA固定细胞，并用1%Triton X-100在PBS和1%BSA中渗透，用Hoechst 33258染料染色DNA，用Cy3-phalloidine染色F-actin，以确认MC珠被细胞覆盖。

将冰冷的基质胶生长因子降低（BD；8-10 mg/ml，50µl/孔）加入平底96孔板中，并在37°C下固化1小时。将48小时前转染siRNAs的HDMEC（15000个细胞/孔）分两次接种到涂层孔中，并在37°C的ECGMv2中培养。在不同时间拍摄照片，并在实验结束时将毛细血管固定在磷酸盐缓冲福尔马林中。在每个条件下，在四个不同的领域和两个不同的实验中量化分支点。为了进行细胞迁移分析，将HDMEC涂布在48个培养皿上，并如上所述进行RNAi。40小时后，用黄色塑料尖端造成伤口并拍照。细胞在37°C下迁移。使用5×/0.12 NA物镜在倒置显微镜（DMIRB；徕卡）、相机（C4742-95；哈马松光电）和简单PCI软件（环境温度）上在不同时间拍摄照片。使用ImageJ在不同时间计算没有细胞的面积。

HDMEC接种在140 mm培养皿中，第二天用siRNA转染。24小时后，将细胞进行胰蛋白酶化，并将其置于Costar/Corning渗透性插件（直径6.5 mm，孔径1.0-µm）中，该插件预先涂有Matrigel（0.8 mg/ml；每个插件100000个细胞；BD）。24小时后，使用上皮伏特电阻计（EVOM）测定内皮细胞电阻（TER）。再过24小时，进行第二次TER测定，并通过向心尖侧分别添加4和70 kD FITC-和罗丹明结合葡聚糖（1 mg/ml；Sigma-Aldrich）来测定内皮细胞旁通透性。通过使用荧光阅读器（BMG Labtech；Steed等人，2009年).

将转染siRNAs 48小时的HDMEC接种到用0.8 mg Matrigel预处理的96个平板上，并在37°C的ECGMv2中培养24小时。然后，使用CyQuant测定总细胞数，并使用caspase-Glo 3/7测定法（Promega）测量caspase 3和7活性，分析同一平板的凋亡情况如前所述，通过测量乳酸脱氢酶释放（Promega）来检测坏死(Nie等人，2012年).

HDMEC被镀入涂层的8孔多室ibidi载玻片（40000个细胞/孔）中，然后在19小时后转染siRNAs。在镀后第3天，用编码基于VE-cadherin的FRET张力传感器的质粒转染细胞(Conway等人，2013年)或RhoA生物传感器（pRaichu RhoA；Yoshizaki等人，2003年；Terry等人，2011年)使用JetPei(Elbediwy等人，2012年). 转染混合物与细胞孵育2小时，然后用新鲜培养基替换。20小时后，使用SP2显微镜（徕卡；63×/1.4 NA物镜，37°C）和LCS FRET软件（徕卡）评估FRET，使用受体漂白后供体恢复方案，并根据方程式[（D_邮递-D类_之前)/D类_邮递]×100（其中D代表供体强度）。

如前所述，进行Matrigel塞试验并进行分析(Birdsey等人，2008年). 简言之，向C57BL/6小鼠腹腔中线附近注射Matrigel（BD）、肝素、FGF和2µM siRNAs的混合物（视情况而定）。7天后从小鼠体内取出塞子，在室温下用4%多聚甲醛在PBS中固定2小时，转移到70%乙醇中，包埋在石蜡中，并进行苏木精和伊红染色。为了量化，Matrigel塞中包含的血管通过包含红细胞的管腔周围存在有核细胞来识别。使用20倍物镜在四个视野中对血管进行计数。对于免疫荧光，对切片进行脱蜡处理，并在柠檬酸钠缓冲液（0.01M，pH 6）中在微波中提取抗原10分钟。使用60×/1.4 NA油浸物镜、相机（CoolSnap HQ2；Photometrics）和倒置显微镜（Eclipse Ti-E；Nikon）采集图像，和尼康软件在环境温度下。实验是根据1986年《动物（科学程序）法案》进行的。

用编码GFP–α-catenin的慢病毒载体转导标记HDMEC(Huveneers等人，2012年). 然后用ibidi 8孔多室玻片接种细胞并转染siRNAs。然后，在37°C下使用倒置显微镜（Eclipse Ti-E；尼康）进行消融实验，该显微镜配备有包含脉冲N₂激光。为了能够在404nm处观察GFP和烧蚀，使用了一个分束器，允许70%的激光传输。校准激光强度，以允许以最低能量烧蚀，将激光一次性射入目标细胞（激光功率的60-80%取决于染料的年龄）。所有实验均使用CFI Apochro纳米晶体60×油物镜（NA 1.2）进行。电影是通过每秒录制1帧，持续1分钟来制作的，显示的是每秒播放5帧。使用ImageJ对消融前、消融后30秒和45秒采集的图像进行分析。中的覆盖层图2用红色显示起始图像，用绿色显示30秒，用蓝色显示45秒。

图S1显示了Matrigel plug分析中对照组和ZO-1缺失组的ZO-1免疫荧光、使用不同siRNAs的小鼠EC中ZO-1的缺失以及Matrigel plug组的内切粘蛋白染色。图S2显示了ZO-1缺失对claudin-5表达的影响，结合管状蛋白对小鼠GFP-ZO-1在人类细胞中表达的拯救，以及claudin5缺失对紧密连接功能和体外血管生成的影响。图S3显示了对照细胞和ZO-1缺失细胞中活性RhoA定位的分析。图S4显示了ZO-1缺失细胞中p190RhoGAP结合招募的缺陷。图S5显示了活性肌球蛋白IIA在ZO-1、JACOP或p114RhoGEF下调后的重新分布。

这项工作得到了医学研究理事会（G0900098）、威康信托基金会（099173/Z/12/Z）和生物技术和生物科学研究理事会（BB/J015032/1和BB/L007584/1）的支持。M.A.Schwartz得到了美国国立卫生研究院RO1 HL75092的资助。

作者声明没有相互竞争的经济利益。