内源性HMGB1调节自噬

在宏观自噬（后简称自噬）过程中，亚细胞膜发生动态形态变化，导致细胞蛋白质和细胞质细胞器的吞噬和降解(Maiuri等人，2007年;莱文和克罗默，2008年). 自噬途径的破坏与多种疾病状态有关，包括神经退行性疾病、癌症、感染和几种类型的肌病(莱文和克罗默，2008年;Livesey等人，2009年). 自噬也是饥饿细胞将营养物质从不必要的过程重新分配到更重要的过程中的一个主要机制(莱文和克罗默，2008年). 在自噬过程中，细胞溶质形式的轻链3（LC3；LC3-I）被裂解，然后与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-磷脂酰乙醇酰胺结合物（LC3-II），该结合物被补充到自噬体膜。通过免疫印迹或免疫荧光检测微管相关蛋白LC3已成为监测自噬和自噬相关过程的广泛使用方法(水岛和吉森，2007年).

高迁移率族盒1（HMGB1）蛋白是一种高度保守的核蛋白，作为一种结构染色质结合因子，可弯曲DNA并促进特定DNA靶点的蛋白质组装(洛兹和特蕾西，2005年). 除核内作用外，HMGB1在炎症、细胞分化、细胞迁移和肿瘤转移过程中也作为细胞外信号分子发挥作用(洛兹和特蕾西，2005年;Tang等人，2010a). HMGB1由坏死细胞释放，并由活化的巨噬细胞、自然杀伤细胞和成熟的树突状细胞分泌，在那里介导对感染、损伤和炎症的反应(Wang等人，1999年). 相反，在紫外线照射或铂化诱导DNA损伤后，HMGB1被隔离在细胞核中，这通常与凋亡而非坏死细胞死亡有关(Scaffidi等人，2002年).

虽然HMGB1在细胞凋亡和坏死过程中存在大量信息，但HMGB1对自噬的作用基本上没有特异性。在这里，我们证明HMGB1是自噬的关键调节器，因为HMGB1易位在细胞长期应激后诱导自噬。有趣的是，HMGB1易位需要一个氧化还原依赖信号。此外，靶向消融HMGB1通过维持Beclin1和Bcl-2之间的相互作用增加细胞凋亡并抑制自噬。HMGB1的半胱氨酸106（C106）突变促进了细胞溶质定位和自噬，但其邻近的C23和C45没有突变。此外，HMGB1的分子内二硫键（C23/45）是与Beclin1结合和诱导自噬所必需的。这些发现为HMGB1定义了一种新的生物学功能，即通过维持细胞自噬来应对细胞应激，从而促进细胞存活。

为了研究HMGB1在细胞受到促进自噬的刺激时的作用，我们首先分析了HMGB1的表达和位置。经典的自噬刺激，如饥饿（HBSS）或雷帕霉素处理，促进了培养的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中HMGB1从细胞核转移到胞质溶胶，人Panc2.03(图1 A)和其他细胞系，如小鼠Panc02、人类HCT116和小鼠RAW264.7（未描述）。雷帕霉素治疗或饥饿诱导HMGB1易位，但不伴有可测量的乳酸脱氢酶释放(图S1)是质膜破裂的标志。这表明HMGB1易位，在自噬增强的早期事件中观察到，是一个活跃的过程。此外，用标称的广泛磷脂酰肌醇-3激酶抑制剂（如沃特曼和Ly294002）对MEF和Panc02细胞系进行预处理，可以阻止饥饿诱导的LC3点带、LC3-II和HMGB1易位的积累(图1、B和C). 此外，ATG5的敲除，这是一种形成自噬体所需的基因产物(莱文和克罗默，2008年)，显著抑制饥饿诱导的LC3点数量、LC3-II表达和HMGB1易位(图1、B和C). 这表明自噬刺激调节HMGB1细胞质易位。相反，当比较Hmgb1时，在ATG5染色中没有观察到显著差异^−/−和Hmgb1^+/+永生化MEF(图1D)与ATG5不是HMGB1下游的概念一致。

活性氧是信号分子，在调节细胞存活和死亡的几种途径中起重要作用。事实上，许多诱导活性氧生成的刺激，如营养饥饿、线粒体毒素和缺氧，也会诱导自噬(图S2). 线粒体中ROS的形成是促进自噬的基本调节事件(Scherz-Shouval和Elazar，2007年). 内源性活性氧的主要来源是线粒体电子传递链（mETC；Scherz-Shouval和Elazar，2007年).

为了评估自噬过程中线粒体ROS产生和HMGB1易位之间的关系，我们用几种不同的mETC抑制剂处理细胞。鱼藤酮（Rot；复合物I抑制剂）、亚甲酰三氟丙酮（复合物II抑制剂）和抗霉素A（复合物III抑制剂）增加ROS生成、LC3点和LC3-II表达(图1、E和F). 通过亚细胞组分的成像细胞术和Western blot检测，这些mETC抑制剂还诱导HMGB1从细胞核转移到胞浆(图1、E和F). 在生理条件下，活性氧通过超氧化物歧化酶（SOD）家族成员、过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶的作用从细胞中清除(Scherz-Shouval和Elazar，2007年). 正如预期的那样，SOD1和SOD2的敲低增加了饥饿和雷帕霉素诱导的Panc2.03细胞自噬和HMGB1易位(图1、G和H；和图S3). 此外，N个-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种活性氧猝灭剂，其剂量依赖性抑制饥饿和雷帕霉素诱导的自噬和HMGB1易位(图1、G和H；以及图S3）。此外，饥饿和雷帕霉素增加了ROS/线粒体超氧化物水平，降低了SOD活性，但不影响过氧化氢酶活性或检测到的水平（图S2）。总之，这些结果与ROS信号是HMGB1易位和持续自噬所必需的概念一致。

为了评估HMGB1在自噬中的作用，我们首先评估了野生型和HMGB1的自噬通量^−/−MEF公司。嗯1^−/−MEF在几种自噬刺激（包括H₂O（运行）₂雷帕霉素和饥饿(图2，A–C). 溶酶体蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制素或E64D治疗(水岛和吉森，2007年)诱导野生型中LC3-GFP点和LC3-II的表达进一步增加，但Hmgb1没有^−/−，机械工程师(图2 C). 同样，HMGB1在HCT116和Panc2.03细胞中的敲除也降低了LC3点的积累和LC3-II的表达(图S4). 此外，HMGB1在HMGB1中的表达上调^−/−基因转染后的MEF恢复了LC3点的形成(图2 D). 抑制自噬导致p62小体的大小和数量以及p62蛋白水平的增加(Björkoy等人，2005年). HMGB1的缺失增加了p62小体的大小和数量以及p62蛋白质水平(图2 E)表明其降解依赖于HMGB1介导的自噬。超微结构分析表明Hmgb1^−/−与野生型MEF相比，MEF表现出更少的I型自噬体和II型自溶体(图2 F). 这些结果表明HMGB1确实是调节自噬的重要因素。

在正常条件下，HMGB1蛋白的5-10%位于胞浆中，具体数量取决于细胞类型(图1A和图3 A). 此外，自噬刺激促进HMGB1向胞浆的移位(图1 A和图3 A). 为了评估HMGB1在自噬形成中的作用，我们创建了细胞质（无核细胞）。为了应对饥饿（HBSS），Hmgb1^+/+MEF细胞质仍能积聚LC3点(图3，A和B;Tasdemir等人，2008年). 相比之下，Hmgb1^−/−MEF细胞质中LC3点状细胞的水平低于HMGB1^+/+(图3，A和B)，表明细胞质HMGB1是饥饿刺激的自噬所必需的。

饥饿和雷帕霉素治疗都会增强某些细胞系的自噬并诱导凋亡(Maiuri等人，2007年). 因此，我们评估了在这些条件下HMGB1与细胞凋亡之间的关系。Hmgb1中观察到细胞凋亡增加^−/−与野生型细胞相比，MEF通过使用膜联蛋白V染色的流式细胞术，通过发现增加的裂解聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）和增加的caspase-3活化(图S5). 总的来说，这些数据表明HMGB1在促进自噬和限制凋亡方面起着重要作用。

在自噬过程中观察到的一个重要分子事件是Bcl-2–Beclin1复合物的解离(Pattingre等人，2005年). 抗凋亡蛋白Bcl-2家族调节Beclin1依赖性自噬(Pattingre等人，2005年). 因此，我们确定了HMGB1对Bcl-2和Beclin1之间相互作用的影响。MAPK激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂PD98059和U0126抑制饥饿诱导的ERK磷酸化（p-ERK1/2）和Bcl-2(图4 A). 此外，HMGB1的敲除以及MEK/ERK抑制剂U0126的加入，在增强自噬的情况下阻断了Bcl-2–Beclin1的解离(图4、B和F)表明ERK1/2介导的Bcl-2磷酸化调节饥饿诱导的自噬。在MEFs、HCT116和Panc02细胞中，内源性HMGB1通过共免疫沉淀（IP[co-IP]）检测显示与Beclin1相互作用(图4、B、C和E). 敲除Beclin1抑制了未经处理的HMGB1野生型MEF中Bcl-2和HMGB1之间的相互作用(图4、B和D)表明HMGB1与Bcl-2的相互作用直接依赖于Beclin1。因此，通过与Beclin1结合并调节饥饿后细胞中Bcl-2的磷酸化，内源性HMGB1抑制Beclin1-Bcl-2之间的相互作用。

HMGB1中三种半胱氨酸的氧化对其功能很重要(Hoppe等人，2006年;Kazama等人，2008年). 这些半胱氨酸编码在位置23、45和106（分别为C23、C45和C106；图5 A). 在温和的氧化条件下，邻近的半胱氨酸C23和C45容易形成分子内二硫键，而C106保持还原形式(Hoppe等人，2006年). HMGB1氧化阻断位点阻止凋亡细胞诱导耐受(Kazama等人，2008年). 将组成活性氧化还原传感器HMGB1-GFP-C106突变（C106S）转染HMGB1敲除细胞后，HMGB1的核定位受损，从而增加HMGB1细胞质聚集(图5 A;Hoppe等人，2006年)和LC3点状构造(图5 B). 这表明HMGB1的C106可能在调节其细胞内易位以及随后的自噬中发挥作用。此外，自噬刺激（雷帕霉素或饥饿）促进野生型以及突变型C23S、C45S和C106S HMGB1易位到胞浆中(图5 A). 丙酮酸乙酯对HMGB1细胞质易位的抑制作用(Ulloa等人，2002年)阻断饥饿诱导的LC3点状聚集(图5 B)表明HMGB1调节自噬。因此，转染野生型HMGB1和C106S变异体，但不转染位于细胞核的突变C23S或C45S质粒，HMGB1的自噬上调，凋亡下调^−/−饥饿后的细胞(图5、B和C). HMGB1 C106S突变增加了Bcl-2和Beclin1的解离，并促进了HMGB1中的p-ERK1/2和Bcl-2^−/−饥饿后的细胞(图5D). C23S和C45S变异体，但没有C106S突变的变异体损害了HMGB1和Beclin1以及p-ERK1/2和Bcl-2之间的相互作用(图5D)表明与Beclin1结合需要分子内二硫键（C23/45）。为了进一步证实这一假设，我们在IP实验中使用了还原试剂（DTT）。如预期，使用DTT处理的样品(图5 EIP之前，+DTT）干扰了野生型/C106S HMGB1和Beclin1之间的相互作用。此外，Beclin1的siRNA敲除在诱导HMGB1从细胞核转移到胞浆的条件下抑制自噬，如H₂O（运行）₂、雷帕霉素、罗特、亚甲酰三氟丙酮和HBSS(图5 F). 此外，Beclin1的敲除抑制了外源性HMGB1处理诱导的自噬，以及在饥饿或不饥饿的情况下HMGB1的过度表达，这表明Beclin 1是HMGB1介导的自吞噬所必需的(图6，A–D).

为了进一步证实HMGB1的氧化调节自噬通量，我们分析了溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）和LC3在有无巴非霉素A1（一种自噬空泡和溶酶体融合抑制剂）存在下的共定位。Bafilomycin A1降低野生型MEF中饥饿介导的自噬后LAMP2/LC3共定位(图7，A和B). 此外，HMGB1或C106S突变体的表达，而不是C23S和C45S突变体，恢复了HMGB1的自噬通量^−/−MEF公司(图7，A和B).

总之，这些发现表明HMGB1的氧化促进其定位于胞浆并随后诱导自噬(图8). 我们的研究结果还表明，HMGB1的细胞质易位对于促进和维持自噬是必要的，但可能还不够。

多细胞生物对压力的反应和组织稳态的维持是所有真核生物中常见的生物学问题，这是由遗传和环境因素决定的。在许多生物体中发现了高度整合和定型的反应模式，但对细胞、组织和最终有机体生存至关重要的如此多的不同途径的协调方式尚未阐明。在这里，我们表明进化上古老且高度保守的HMGB1蛋白的缺失会抑制人类和小鼠细胞中的自噬。相反，抑制自噬限制HMGB1易位，表明HMGB1对自噬的调控至关重要。此外，我们已经证明，这种作用是由ERK1/2磷酸化和阻断Beclin1与Bcl-2的相互作用控制的。HMGB1 C106对其在细胞核和细胞质之间的易位很重要，氧化C23/45是与Beclin1结合所必需的。这些发现对HMGB1在细胞和组织内的时间和空间调节、HMGB1与自噬途径之间的联系以及HMGB1作为细胞生存的关键调节器的作用具有意义。

HMGB1蛋白既是核DNA结合因子，又是对细胞死亡和生存至关重要的分泌蛋白(Tang等人，2010b). 其活性由其细胞内定位和翻译后修饰（包括乙酰化、ADP-核糖基化、磷酸化和硫醇氧化；Scaffidi等人，2002年;洛兹和特蕾西，2005年;Hoppe等人，2006年;Kazama等人，2008年). HMGB1在坏死过程中释放，作为细胞死亡过程中内源性损伤相关分子模式分子或“危险”信号(Scaffidi等人，2002年). 晚期凋亡细胞确实可以释放HMGB1，HMGB1的氧化会干扰其促进免疫的能力(Kazama等人，2008年). 活性氧还作为信号分子在调节细胞存活和死亡的各种途径中发挥作用。活性氧可以通过几种不同的机制诱导自噬，包括Atg4的过氧化氢酶激活和mETC的干扰(Scherz-Shouval等人，2007年). 我们已经证明，饥饿和雷帕霉素治疗期间产生的活性氧是启动自噬的信号分子。重要的是，这些刺激导致HMGB1细胞溶质从细胞核移位，这表明HMGB1增强自噬所必需的功能和定位与在细胞凋亡中观察到的不同。此外，我们已经证明HMGB1在自噬中的易位是ROS依赖性的。事实上，氧化应激调节巨噬细胞、中性粒细胞和缺血组织（包括肝细胞）中HMGB1的释放和随后的炎症反应(Tang等人，2007c;Tsung等人，2007年).

这些发现(图2和图3)提示HMGB1直接参与应激细胞自噬的正向调节和维持。自噬最初被发现是一种细胞内成分降解的非选择性途径，在饥饿时被激活(Maiuri等人，2007年;莱文和克罗默，2008年). 现在很清楚，特定细胞器和蛋白质的选择性自噬降解是对多种刺激的反应，从促进生存的病原体清除，到受损细胞器和蛋白的降解，再到程序化细胞生存或细胞死亡(Scherz-Shouval和Elazar，2007年). 我们发现HMGB1的靶向缺失限制了饥饿诱导的自噬并增强了细胞凋亡。在癌症背景下，HMGB1的过度表达与多种癌症的异常生存相关，包括乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤和其他癌症(Tang等人，2010b). 因此，HMGB1在调节代谢应激反应中的自噬、氧化损伤和促进程序化细胞存活的基因组不稳定性中起着重要作用。

这项研究表明HMGB1促进和维持自噬，我们探索了这种发生的机制。HMGB1可能通过控制Beclin1–Bcl-2复合物的形成而产生促自噬活性。Bcl-2与Beclin1的分离是一种重要的机制，参与激活自噬和限制细胞凋亡，以应对饥饿和其他生理刺激(Pattingre等人，2005年). 在这项研究之前，不利的营养条件对Bcl-2和Beclin1之间相互作用的调节还没有彻底探讨。我们发现HMGB1通过在饥饿后与Beclin1竞争性结合破坏Beclin1-Bcl-2之间的相互作用。HMGB1的氧化敏感性C106（而非邻近的C23和C45）调节细胞溶质定位和自噬。C106S突变体具有更高的HMGB1细胞质水平，并显示与Beclin1的结合增强，导致Bcl-2随后从Beclin 1分离。C106S突变体能够像野生型HMGB1一样有效地启动饥饿诱导的自噬，而C23S和C45S突变则消除了这种作用。因此，在两个独立的实验中，C106S突变体的行为与野生型HMGB1相似。同时，C23S和C45S突变体失去了介导自噬的能力，因为它们不能结合Beclin1，因此不能破坏Bcl-2–Beclinl相互作用。这些发现表明HMGB1的氧化调节其定位和维持自噬的能力(图6). 因此，HMGB1的细胞质易位似乎是必要的，但可能不足以增强自噬。

抗凋亡分子Bcl-2参与细胞凋亡和自噬过程中细胞死亡和生存途径的调节。以前有报道称，Bcl-2的磷酸化可能通过JNK或ERK信号通路的激酶实现，是其抗凋亡活性所必需的(Subramanian和Shaha，2007年;Wei等人，2008年). 我们的研究结果表明，HMGB1也可能通过ERK/MAPK途径参与Bcl-2磷酸化的调节，因为HMGB1的消融减少了饥饿诱导的ERK1/2和Bcl-2的磷酸化，尽管这种作用的机制尚不清楚。最近的一项研究表明，晚期糖基化终产物受体HMGB1受体通过D结构域样对接位点直接与ERK结合，并调节p-ERK1/2(Ishihara等人，2003年). 细胞质HMGB1可能与晚期糖基化终产物受体的胞浆域相互作用，并介导伴随的ERK1/2和Bcl-2磷酸化。

根据本文报道的工作和先前的研究结果，HMGB1在凋亡中的核隔离，在炎症中的细胞外释放(Wang等人，1999年;Scaffidi等人，2002年;Kazama等人，2008年)及其作为通用DNA传感器的关键作用(Yanai等人，2009年;Sims等人，2010年)，我们提出了一个涉及HMGB1和细胞死亡的更精细的概念模型。在这个模型中，细胞应激产生的活性氧促进HMGB1易位到胞浆，从而诱导自噬，增强ERK信号传导并破坏Beclin1–Bcl-2复合物的形成(图6). 因此，内源性HMGB1在调节程序性细胞死亡（凋亡）和程序性细胞存活（自噬）中起着核心作用。这些发现将有助于开发更有效的慢性炎症疾病治疗方法，其中一些与损伤相关分子蛋白的释放有关(Zhang等人，2010年)包括神经退行性疾病、自身免疫和癌症。

HMGB1抗体来自Sigma-Aldrich和Novus Biologicals。半胱天冬酶-3、裂解半胱蛋白酶-3、裂解PARP、GFP、Bcl-2、p-ERK（Thr202/Tyr204）和ERK的抗体从细胞信号技术获得。微管蛋白和肌动蛋白抗体来自Sigma-Aldrich。抗磷酸丝氨酸、SOD1、SOD2、纤维素酶和过氧化氢酶的抗体来自Abcam。ATG5和Beclin1抗体购自Novus Biologicals。LC3抗体购自Novus Biologicals或AnaSpec。抗p62的抗体来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.。SOD活性检测试剂盒也来自Abcam。细胞核和细胞质提取试剂盒来自赛默飞世尔科技公司。其他试剂和试剂盒来自Sigma-Aldrich。

Panc2.03、Panc02、HCT116和Hmgb1^−/−和Hmgb1^+/+不朽的MEF(Scaffidi等人，2002年)细胞在添加10%热灭活FBS、2 mM谷氨酰胺和抗生素-抗真菌混合物（10000单位/ml青霉素和10000µg/ml链霉素；Invitrogen）的RPMI 1640、DME或McCoy's 5a培养基中培养，培养液中含有5%CO₂.

HMGB1-GFP或突变型（C23S、C45S或C106S；Hoppe等人，2006年)或pUNO1-HMGB1（InvivoGen）表达载体根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）转染到细胞中。结构物在匹兹堡大学核心测序实验室进行测序和确认。使用Lipofectamine RNAiMAX试剂（用于siRNA）或Lipofettamine 2000试剂（用于shRNA）将人SOD1/SOD2-siRNA、小鼠Beclin1–Bcl-2 siRNA（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、小鼠Beclin1短发夹RNA（shRNA）、人HMGB1 shRNA和小鼠ATG5 shRNA（Sigma-Aldrich）转染到细胞中根据制造商的说明（Invitrogen）。在基因转染和RNAi 48小时后，在随后的治疗之前改变细胞上的培养基。

将全细胞裂解物溶解在4-12%Criterion XT Bis-Tris凝胶（Bio-Rad Laboratories）上，并转移到硝酸纤维素膜上，如前所述(Tang等人，2007b). 封闭后，将膜在25°C下孵育2小时或在4°C下与各种初级抗体孵育过夜。在25°C下与过氧化物酶结合二级抗体孵育1小时后，根据制造商的说明，通过增强化学发光（赛默飞世尔科学公司）对信号进行可视化。使用凝胶电泳分析仪软件（媒体控制论）量化相对带强度。

细胞接种在96周的培养板中，并在给定的刺激下培养指定的时间。如前所述，ROS用细胞渗透染料CM-H2DCFDA（Invitrogen）和线粒体超氧化物（MitoSox）进行评估(Kang等人，2010b). 使用荧光板阅读器进行信号强度分析。

细胞在4°C的冰镇放射免疫沉淀分析裂解缓冲液（Millipore）中进行裂解，细胞裂解物在12000时通过短暂离心10分钟进行清除克上清液中的蛋白质浓度通过双钦酸测定法测定。在IP之前，将含有等量蛋白质的样品在4°C下用蛋白质A或蛋白质G琼脂糖/琼脂糖预先洗脱3小时，然后用2-5µG/ml各种无关的IgG或特定抗体在蛋白质A或G琼脂酶/琼脂酶珠存在的情况下孵育2小时或在4°C下轻轻摇晃过夜(Tang等人，2007a,b条). 孵育后，用PBS对琼脂糖/琼脂糖珠进行广泛清洗，在SDS-PAGE电泳前，在2×SDS样品缓冲液中煮沸洗脱蛋白质。作为对照，用50 mM DTT处理部分裂解液以减少样品，如前所述(Anathy等人，2009年).

将细胞接种在96周的平板中，在各种刺激下培养一定时间，然后用3%多聚甲醛固定，并用HMGB1或LC3抗体染色。二级抗体是与Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 647荧光色素结合的山羊IgG。用荧光染料Hoechst 33342（Sigma-Aldrich）观察细胞核形态。使用成像细胞仪（ArrayScan HCS 4.0；Cellomics）在25°C下以20倍物镜收集成像数据。ArrayScan是一种自动荧光成像显微镜，用于收集放置在96 well微量滴定板中的细胞中荧光标记成分的空间分布信息。优化后，使用斑点探测器BioApplication（Thermo Fisher Scientific）采集和分析图像。分析每个治疗组500–1000个细胞的图像，以获得平均核和细胞溶质HMGB1强度和每个细胞的LC3荧光斑点数(Tang等人，2009年).

如前所述，通过成像细胞术进行内源性LC3点的所有分析(Kang等人，2010a). 通过细胞系中GFP-LC3（宾夕法尼亚州匹兹堡大学X.-M.Yin的礼物）聚集的瞬时表达，进一步监测自噬小泡的形成。通过从三个单独的实验中随机选择的100个细胞中计算阳性染色细胞的数量来确定GFP-LC3点状细胞的百分比。根据建议，在存在或不存在溶酶体蛋白酶抑制剂（E64d/胃蛋白酶抑制素A）的情况下，通过Western blotting对饥饿后LC3-I/II的形成进行自噬通量测定(水岛和吉森，2007年).

对p62进行共焦显微镜分析，并对LAMP2/LC3进行共定位。使用激光扫描共焦显微镜（Fluoview FV-1000；Olympus），使用60x Plan Apo/1.45油浸物镜在25°C下采集图像，并使用Fluovie软件（FV10-ASW 1.6；Olympus）进行捕获和分析。随后通过Image-Pro Plus 5.1软件（媒体控制论）对图像进行水平和共定位分析。

如前所述，对自噬体和自噬溶酶体进行透射电镜评估(Shao等人，2004年). 简而言之，用2%多聚甲醛和2%戊二醛将细胞固定在pH为7.4的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中，然后在1%O中固定6 h_秒O（运行）₄用分级醇脱水后，将样品包埋在环氧树脂（epon）中。然后，用切片机（Ultracut R；Leica）切割薄片（70 nm），将其安装在铜网格上，用2%醋酸铀酰和1%柠檬酸铅进行后染色，干燥，并在25°C下使用透射电子显微镜进行分析（100CX；JEOL，Inc.）。厚切片切割（300 nm）并用1%甲苯胺蓝染色。在每种条件下，从随机选择的10-15个字段中采集数字图像。

使用FITC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒（BD；膜联蛋白V-FITC，碘化丙啶（PI）溶液和膜联蛋白V结合缓冲液）评估细胞凋亡。该试验包括用膜联蛋白V–FITC（一种与破坏的细胞膜结合的磷脂结合蛋白）和PI（一种能与穿透凋亡细胞的DNA结合的重要染料）对细胞进行染色。流式细胞仪分析（FACS）用于测定凋亡细胞的百分比（膜联蛋白V⁺/PI公司⁻). 用Western blotting分析测定裂解的PARP和裂解的caspase-3。

HMGB1标准^−/−和HMGB1^+/+如前所述，在胶原蛋白涂层的微型套圈上生长的MEF被去核，只需稍作修改(Goldman等人，1973年;米勒和鲁德尔，1974年). 为了将细胞剜除，将小盖片倒置（细胞侧朝下），放置在含有10µg/ml细胞松弛素B（Sigma-Aldrich）的1.5-ml Eppendorf试管的底部。12000离心后克在60分钟内，从试管中取出小盖片，将细胞侧朝上放置在含有2 ml不含细胞松弛素B的培养基的6孔板中，用于随后的研究和自噬染色。

数据表示为一式三份的三个独立实验的平均值±SEM。采用SPSS 12.0进行组间比较，采用单因素方差分析。当方差分析显著时，使用Fisher最小显著性差异检验对组间差异进行事后检验。p值<0.05被认为是显著的；在适用的情况下，报告了P<0.005和P<0.0005。

图S1显示，自噬刺激促进细胞溶质HMGB1易位，而不依赖于质膜破裂。图图S2显示自噬刺激增加ROS和线粒体超氧化物水平并降低SOD活性，而对过氧化氢酶活性水平没有直接影响。图S3显示，提供抗氧化剂或敲除SOD1和SOD2会增加雷帕霉素诱导的自噬和HMGB1易位。图S4显示HMGB1的敲低限制了HCT116和Panc2.03细胞中的自噬。图S5显示HMGB1缺失促进细胞凋亡。

我们非常感谢与匹兹堡大学的蒂莫西·比利亚（Timothy Billiar）和莎拉·伯曼（Sarah Berman）以及外部同事吉多·克罗默（Guido Kroemer）、道格拉斯·格林（Douglas Green）、马修·阿尔伯特（Matthew Albert）、伊娃·谢格兹迪（Eva Szegezdi）和贝斯·莱文（Beth Levine）对这项工作进行的深入讨论和审查。我们还感谢审查人员提出的建设性建议。

该项目由国家卫生研究院（国家癌症研究所向M.T.Lotze提供的将NK和DC纳入癌症治疗拨款[1 P01 CA 101944-04]）和意大利癌症协会（M.E.Bianchi）的拨款资助。