UXT是NF-κB转录增强体中一种新的重要辅因子

核因子κB（NF-κB）是一种广泛表达的由异二聚体复合物（p65–p50）组成的初级转录因子。大量无关的外源性和内源性刺激能够诱导NF-κB活性。反过来，NF-κB调节同样多样的细胞基因的表达，这些基因在免疫、炎症和发育中起重要作用(Ghosh等人，1998年；Li和Verma，2002年). 其功能异常与癌症和异常发育等病理过程有关（综述见Rayet和Gelinas，1999年). 确定调节NF-κB活化的分子机制对于理解多个细胞内信号通路如何聚合以激活单个转录因子至关重要。

NF-κB通常通过与其抑制分子IκBα的物理结合而定位于细胞质中作为一种非活性复合物。已经进行了广泛的研究，以探讨各种刺激如何触发其从细胞质到细胞核的移位(海登和戈什，2004年). 几个实验室的精液研究已经确定了导致IκB蛋白泛素依赖性降解的一系列生化事件(Chen等人，1996年；Hatakeyama等人，1999年；Spencer等人，1999年). 因此，这会释放NF-κB进入细胞核并启动靶基因的表达(Ghosh和Karin，2002年；Li和Verma，2002年). NF-κB属于Rel同源域（RHD）转录因子家族，利用类似策略实现初始激活。最近，发现了一种替代途径来调节这个家族的另一个成员（p100）(Senftleben等人，2001年).

与有关细胞质中NF-κB活化的分子事件的丰富知识相比，对其活性调节以及与细胞核内其他蛋白质的功能相互作用的了解更少。最近的进展揭示了核事件在塑造NF-κB转录反应的强度和持续时间方面的重要性，这部分是通过翻译后修饰NFκB的转录因子复合体或围绕各种NF-kb B靶基因的组蛋白来实现的(陈和格林，2004). 例如，Iκ-B激酶α（IKKα）被证明可以加速NF-κB的转换和从促炎基因启动子中清除(劳伦斯等人，2005年). 这种激酶还可以磷酸化组蛋白H3，对NF-κB应答基因的表达至关重要(山本等人，2003年). 此外，p300/CREB-结合蛋白（CBP）的乙酰转移酶活性是激活NF-κB依赖性转录所必需的。p300/CBP蛋白也被发现与NF-κB直接相关，形成与基础转录机制的桥梁(Gerritsen等人，1997年；Chan和La Thangue，2001年). 虽然最近发现一些辅因子存在于NF-κB增强子小体中，但要了解它们的具体功能和调节机制还有很多工作要做。这表明NF-κB组装的转录复合物比预期的要高很多，并且NF-κ的B转录激活过程还有其他重要的调控层。

普遍表达的转录物（UXT）为～18 kD，主要定位于细胞核(Markus等人，2002年). 它被证明在人类和小鼠组织中广泛表达，在一些人类肿瘤中表达显著升高(Schroer等人，1999年；Zhao等人，2005年). 计算机模型预测UXT是一种α类前折叠蛋白（PFD）家族蛋白(Gstaiger等人，2003年). 该家族的大多数成员是小分子量蛋白质（14–23 kD），由线圈结构组成。此前发现酵母和人类PFD 1–6组装成一种六聚体复合物，作为一种新型分子伴侣发挥作用(Vainberg等人，1998年；Siegert等人，2000年).

到目前为止，UXT的功能特性还很少见。最近的一项研究表明，UXT与雄激素受体和调节雄激素受体应答基因的N末端结合，这些基因在前列腺生长抑制和分化中起重要作用(Markus等人，2002年；Taneja等人，2004年). 另一项研究表明UXT是中心体的一个组成部分(Zhao等人，2005年). 然而，关于UXT的体内功能及其在细胞过程中的调节作用，还有很多工作要做。

在系统筛选与NF-κB增强子体成分相互作用的蛋白质时，我们将UXT鉴定为一种新的p65相互作用蛋白。这种相互作用在体内外都得到了证实。在本研究中，我们表明，UXT的RNAi敲低导致NF-κB活性受损，并显著减弱NF-κ的B依赖基因的表达。这种干扰还通过TNF-α使细胞对凋亡敏感。此外，UXT与NF-κB形成一种信号依赖性复合物，并在刺激后被招募到NFκB增强体。有趣的是，在人类前列腺癌细胞系中，UXT蛋白水平与构成性NF-κB活性相关。受刺激或组成型活性细胞细胞核内NF-κB的存在随着内源性UXT蛋白水平的降低而显著减少。总之，我们的研究揭示了UXT是NF-κB增强子小体的一个组成部分，并且对其核功能至关重要，这揭示了NFκB调节的一种新机制。

为了鉴定NF-κB增强子的新成分，我们进行了系统的酵母双杂交筛选，其中携带p65（氨基酸1-312）RHD的cDNA片段被用作诱饵。几个阳性克隆被鉴定为编码全长UXT(图1A). 此外，筛选出先前确认的p65相互作用蛋白（例如IκBα和PIAS3）。

此前报道UXT几乎只在大多数细胞的细胞核内表达(Markus等人，2002年). 这在我们对内源性或过度表达的UXT的研究中得到了证实(图1B). 为了进一步证实其与p65的相互作用，应用了体外共免疫沉淀分析，其中产生了全长HA-p65和FLAG-UXT蛋白，并分别用[³⁵S] 蛋氨酸的体外翻译。将产物与对照IgG或抗HA抗体混合并免疫沉淀。如所示图1 C，UXT可以由HA表位抗体共同沉淀，但不能由对照IgG共同沉淀，这表明UXT确实与全长p65直接相互作用。

为了解决这种相互作用在哺乳动物细胞中的生理相关性，我们在293T细胞中表达HA-UXT，然后用TNF-α或不用TNF--α刺激细胞达到指定的时间。将分离的细胞质或细胞核提取物分别与抗p65抗体或IgG作为对照进行免疫沉淀。在TNF-α存在或不存在的情况下，未检测到与细胞质p65相互作用的UXT(图1D)这与UXT的独特亚细胞位置一致。此外，缺乏TNF-α治疗的细胞核中只有少量内源性p65。因此，即使存在大量的UXT，也没有从该核提取物中联合免疫沉淀出UXT。相反，在TNF-α刺激下，核p65和UXT之间表现出强烈的相互作用。此外，我们还测试了内源性UXT和p65是否会对TNF-α产生相互作用。如所示图1 E用TNF-α处理的细胞中的p65抗体共免疫沉淀内源性UXT。相反，未经TNF-α治疗的免疫沉淀物中几乎未检测到UXT。对此现象的一个可能解释是，只有在p65易位到细胞核后，UXT才能接触到p65。然而，我们不能正式排除两种蛋白质翻译后修饰是体内这种相互作用的先决条件的可能性。总之，这些结果表明，在TNF-α刺激下，UXT在体内与p65相互作用。

NF-κB的p65亚单位包含一个称为RHD的N末端保守区域（～300个氨基酸残基）和一个C末端反式激活域。为了探索p65中的UXT结合区，我们构建了一系列p65缺失突变体(图2 A). 研究发现，p65 N端氨基酸1-285的缺失导致其完全无法与UXT相互作用(图2 B，顶部）。相反，跨越氨基酸1-286、1-312或1-372的p65片段完全保留了它们的结合能力，并与UXT和野生型相互作用(图2 B，中间）。因为p65的RHD由两个Ig样结构域组成(Chen等人，1998年)，我们制作了两个额外的p65缺失突变体（氨基酸1-190和191-551），每个突变体仅包含一个Ig样结构域。免疫沉淀分析表明，它们都不能与UXT相互作用(图2 B，底部）。此外，我们产生了几个UXT的点突变，没有观察到UXT和p65相互作用的显著变化。我们还试图在哺乳动物细胞中表达UXT的截断突变体，但没有成功，这阻止了我们进一步解剖UXT。总的来说，这些数据表明p65的完整RHD对于介导与UXT的相互作用是必要的和足够的。

RHD结构定义了一个高度保守的转录因子家族（Rel家族），在免疫和炎症中起重要作用(Ghosh等人，1998年). 这让我们怀疑这种相互作用是否也适用于这个家族的其他蛋白质。为了探索这种可能性，我们将UXT与p50或c-Rel一起转染到293T细胞中。有趣的是，UXT还能够特异性和强烈地结合p50或c-Rel(图2 C). 相反，淋巴增强因子结合因子1是一种与Rel家族无关的转录因子，与UXT没有任何亲和力。这一现象表明，UXT认识到共识结构折叠，并且它与p65和Rel家族其他成员的互动可能有一个统一的主题。

由于UXT在细胞核内以信号依赖的方式与p65特异性相互作用，我们继续研究这种相互作用对调节NF-κB活性和对其作出反应的基因是否重要。我们用UXT或其他对照质粒转染293T细胞，制备核提取物，并如所示进行电泳迁移率偏移测定（EMSA）。一直以来，在没有TNF-α治疗的情况下，没有NF-κB与同源探针结合。值得注意的是，仅UXT的过度表达并未诱导任何可检测到的基础NF-κB结合活性。相反，在TNF-α刺激下，NF-κB结合活性增强。预期，这种活性会被A20严重破坏，A20是NF-κB信号的一种有效抑制剂(Wertz等人，2004年). 然而，在对TNF-α的反应中，我们观察到对NF-κB结合亲和力既没有抑制作用也没有协同刺激作用(图3 A).

另外，我们探索过表达UXT对受NF-κB调节的诱导基因如A20或白细胞介素-8（IL-8）是否有任何可测量的影响。仅转染UXT后，我们未观察到这两个基因的基础表达发生任何变化（未发表数据）。因此，我们用UXT或IκBα超阻遏物（SR）转染293T细胞，并通过实时定量RT-PCR分析TNF-α分别诱导的A20或IL-8 mRNA的数量。IκBαSR是一种公认的NF-κB活化的有效抑制剂(Diao等人，2005年). 一致地，在IκBαSR存在的情况下，TNF-α对A20或IL-8的诱导作用严重减弱。有趣的是，我们观察到在UXT存在下TNF-α对A20和IL-8的边际协同诱导(图3 B)这表明UXT可能调节NF-κB功能。

因为我们无法通过过度表达UXT来令人信服地证明UXT参与NF-κB调节，所以我们转而研究通过RNAi降低内源性UXT表达的影响。提取出两个UXT siRNA，分别命名为242和428。我们通过监测mRNA水平证实了它们对UXT的有效性(图4 A)，蛋白质水平(图4 B)和UXT的细胞免疫荧光(图4C). 428的重复性优于242，在以后的实验中使用得更频繁。此外，使用了两个阴性对照siRNA。一个是非特异性siRNA，命名为对照；另一种是siRNA 428（428m）的突变形式，可以部分结合UXT mRNA，但失去了干扰能力。

最初，我们使用κB-Luc报告基因来评估UXT敲除对NF-κB激活状态的影响。荧光素酶分析显示，内源性UXT的减少显著抑制了TNF-α、IL-1β诱导的NF-κB转录活性(图4 D)，或脂多糖(图4 H). 值得注意的是，这种现象也适用于基础荧光素酶的表达。同样，当细胞被过度表达MyD88或TRAF6刺激时，在UXT表达降低的细胞中也观察到类似的作用，众所周知，MyD88和TRAF6可诱导NF-κB活性(图4 E；Muzio等人，1997年；邓等人，2000). 此外，p65单独诱导的基因激活在内源性UXT表达降低的细胞中也显著减弱(图4 F).

我们的数据表明，UXT可以与其他Rel家族蛋白如c-Rel相互作用(图2 C). 先前发现c-Rel通过与其启动子的特异性相互作用来调节IL-12 p40亚单位的表达(Gri等人，1998年). 因此，使用了一个报告基因，该报告基因在小鼠p40启动子的控制下含有萤火虫荧光素酶。一直以来，在UXT表达量减少的细胞中，c-Rel活化严重受损。这种衰减与RNAi的强度成正比，寡核苷酸428与242证明了这一点(图4 G).

为了使其更具生理相关性，我们还研究了NF-κB依赖基因（IL-8、A20和IκBα）的诱导是如何受到内源性UXT表达下调的影响。对于转染对照siRNA或UXT siRNA的细胞，使用定量实时RT-PCR测量TNF-α诱导的IL-8、A20和IκBα的内源性mRNA水平。一直以来，当内源性UXT表达受到抑制时，这些诱导作用急剧减弱(图4 I). 总的来说，我们的数据强烈表明，UXT是诱导受NF-κB紧密调控的基因所必需的，并且它在NFκB功能中起着重要作用。

正如引言中所述，NF-κB激活涉及细胞质和细胞核中的一系列分子事件。为了排除UXT可能作用于NF-κB本身以外的其他过程的可能性，我们检测了UXT敲除对IκBα磷酸化和降解的影响。在TNF-α刺激期间，我们没有发现UXT缺陷细胞和正常细胞在这方面的差异(图5 A). IKK激酶活性在UXT敲除方面根本不受影响的观察结果进一步支持了这一点（未公布的数据）。鉴于UXT几乎只在细胞核内表达，并与NF-κB直接相互作用，这些数据强烈表明UXT通过靶向NF-κ的B本身来发挥其功能。

通过EMSA，我们分析了UXT表达降低的细胞中内源性NF-κB DNA结合活性。预期，TNF-α单独诱导内源性NF-κB与其同源探针强而特异地结合。在UXT特异性敲除细胞的核提取物中，这种相互作用显著减弱。此外，这种减少与所给siRNA的有效性相关(图5 B).

为了证实这一发现，我们利用染色质免疫沉淀（ChIP）分析来检测当UXT的表达减少时，NF-κB与其内源性启动子的结合是否在体内受到影响。一贯地，内源性UXT水平的缺乏导致在TNF-α刺激下与其内源性同源启动子相关的p65数量显著减少。此外，NF-κB转录增强体的其他组分，如p50和RNA聚合酶II，也是如此。可以理解，内源性UXT水平的缺乏对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）转录复合物没有影响(图5 C). 总之，这些发现表明UXT在NF-κB增强子体中起着重要作用。

此前的一项研究通过计算机建模预测UXT为α类PFD家族蛋白(Gstaiger等人，2003年). 该家族的一些成员以前被发现组装成一个六聚体复合物，在蛋白质折叠和稳定性中起到分子伴侣的作用(Vainberg等人，1998年). 因此，我们假设UXT通过作为核内NF-κB的特异性分子伴侣发挥其功能。

为了探索这个假设，我们研究了p65的核存在是否受到UXT的影响。因此，如图所示，293T细胞转染或不转染所示的siRNAs，并用或不用TNF-α刺激。有趣的是，即使用TNF-α刺激这些细胞，用抗UXT siRNA处理的细胞中核p65的数量也显著减少。值得注意的是，siRNA 428在引起核p65丢失方面优于siRNA 242。相反，对照siRNA对p65的核存在没有这种影响。作为阴性对照的转录因子sp1在细胞核内组成性表达，并在UXT敲除后保持完整。p65的细胞质库似乎不受抗UXT的siRNA的影响(图5D). 这表明UXT在细胞核内正向调节p65，其缺失影响了p65在细胞核中的持续作用，这导致了EMSA结果的减弱，如在图5 B此外，我们还进行了免疫荧光分析以支持这一推测。有趣的是，当用抗UXT的siRNA转染细胞并用TNF-α刺激细胞时，显示集中核p65的细胞百分比明显降低。大约90%的对照细胞在刺激后在细胞核内显示p65，而在UXT击倒标本中只有35-50%的对照细胞显示p65(图5 E). 总之，这些数据表明UXT是NF-κB转录增强体的稳定因子。

上述现象的一个可能机制是，UXT的缺失会从增强子体释放NF-κB，从而导致NF-kb B输出到细胞质中。为了解决这个假设，钩端霉素B（LMB），一种核输出的特异性抑制剂(Ullman等人，1997年；Ghosh和Karin，2002年)已使用。用抗UXT的siRNA转染细胞，并在有或无LMB的情况下用TNF-α刺激细胞。免疫荧光分析表明，即使内源性UXT被敲除，LMB仍显著增加了p65的核累积，这表明UXT有助于p65在细胞核内的持续存在。我们还测试了其他可能性，但目前无法得出明显的相关性（见讨论）。

我们以前的数据表明，p65的RHD对于调节p65和UXT之间的相互作用是必要的和足够的(图2 B). 我们想知道UXT的这种稳定作用是否适用于任何包含该结构域的蛋白质。为了解决这个推测，我们构建了两个融合蛋白，p65（1–312）-VP16和Gal4 BD-p65（285–551）：前者包含RHD，而后者跨越除RHD以外的所有p65。进行荧光素酶分析以监测UXT敲除对这些嵌合蛋白诱导的指示报告物激活的影响。有趣的是，敲除UXT抑制了p65（1–312）-VP16诱导的活性(图5 G)但不是由Gal4 BD-p65（285–551）诱导的(图5 H). 总之，这些数据表明UXT直接调节NF-κB的核功能。

为了排除siRNA对UXT可能产生的非靶向效应，产生了一种siRNA-resistant UXT（UXTr），在该UXT中，siRNA 428靶向序列中引入了沉默突变，并且没有改变所表达蛋白质的氨基酸序列。UXTr的有用性得到了证实，因此siRNA 428不再对UXTr产生任何影响，但siRNA 242仍然可以干扰UXTr表达(图6A). 如图所示，外源性野生型UXT或UXTr与siRNA 428一起转染，并分别用TNF-α刺激。用所示抗体探测细胞核和细胞质提取物。如所示图6 B，UXTr的表达挽救了内源性UXT损伤引起的核p65的丢失，而野生型UXT的表达却没有这样做。EMSA分析也证实了这种拯救作用(图6 C). 总的来说，这些数据表明p65核的缺失是由UXT功能受损直接引起的，并且p65和UXT之间存在直接的功能联系。

鉴于UXT与p65相互作用，并且对于维持核内NF-κB的存在至关重要，我们想知道UXT是否是体内NF-κ）B转录增强体的组成部分。为了解决这种可能性，我们将HA-UXT转染到293T细胞中，并按照材料和方法中的描述，对A20和IκBα的启动子进行系统的ChIP分析。结果表明，UXT确实存在于NF-κB转录增强体中。值得注意的是，它的存在在刺激后变得更加显著，这表明UXT被动态招募到增强子体上。此外，UXT与GAPDH启动子上的转录复合物无关，表明UXT作用的选择性(图7 A). 我们还刺激了293T细胞，并进行了类似的ChIP分析，以再次证实内源性UXT被招募到NF-κB增强子体上以响应刺激(图7 B).

此外，我们还进行了超位移分析，以进一步证实这一观察结果。TNF-α刺激293T细胞，导致由κB探针、NF-κB及其在EMSA中的辅因子组成的强NF-κB DNA结合带。有趣的是，当将抗UXT抗体引入反应混合物中时，EMSA谱带明显减少(图7 C)这强烈表明UXT是该条带中的一个组成部分，培养适合其结合的NF-κB构象至关重要。总之，这些数据表明，UXT在体内与p65形成动态复合物，并在刺激后被招募到NF-κB增强子体。

NF-κB增强子体由越来越多的转录辅因子组成。我们目前的研究发现，UXT就是其中之一，它能够维持NF-κB增强子小体的稳定性，这让我们不禁要问，其他因素是否也可以实现这一功能。已知辅活化因子相关精氨酸甲基转移酶1（CARM1）是NF-κB增强子体中的转录辅因子。CARM1表达减少的细胞在刺激后NF-κB依赖基因表达受损(Covic等人，2005年；Teferedene等人，2006年). 然而，免疫荧光和EMSA实验表明，CARM1的敲除并不影响p65的核存在(图7、E和F)这表明UXT对NF-κB功能起着独特的作用。

已经证实，NF-κB通过抗凋亡基因的转录诱导促进大多数细胞的存活(Barkett和Gilmore，1999年；Zong等人，1999年). 正常情况下，293T细胞在TNF-α的存在下不会出现凋亡现象（<3%）。然而，NF-κB功能的丧失会使细胞易于凋亡。这是通过在TNF-α刺激下敲低UXT来证实的（约15%；未发表的数据）。环己酰亚胺（CHX）是一种有效的蛋白质合成抑制剂。然而，当浓度≤10μg/ml时，CHX只会减少但不会完全阻断从头开始的蛋白质合成(Tang等人，2001). 有趣的是，低浓度CHX可显著增强凋亡效应(Yeh等人，1997年；Kelliher等人，1998年). 利用这种细胞模型，我们探讨了在TNF-α治疗反应中，UXT对细胞存活是否重要。如所示图8治疗18小时后，TNF加5μg/ml CHX导致约10%的细胞死亡。更重要的是，当阻断NF-κB活性的UXT siRNA与TNF和CHX联合使用时，我们在光学显微镜下检测到显著的形态学变化，约50%的细胞发生凋亡。或者，我们使用annexin V和TUNEL方法定量测量凋亡细胞的百分比。一贯地，在UXT降低的样品中观察到凋亡细胞显著增加(图8、B和C). 这些表明，UXT的敲除使293T细胞对TNF-α诱导的凋亡敏感。

前列腺癌最初是一种雄激素依赖性肿瘤，后来发展为雄激素依赖型肿瘤。在这个过程中，NF-κB活性开始失控(Chen和Sawyers，2002年；Zerbini等人，2003年). 在雄激素依赖性PC-3细胞中，更多的NF-κB定位于细胞核内，构成性地显示DNA结合活性，而在雄激素敏感性LNCaP细胞中几乎没有检测到活性(Palayoor等人，1999年). 我们确认了这些观察结果，如图9 B这表明这两种细胞是研究核内NF-κB调节的理想模型。

此外，之前的一项研究表明，与LNCaP细胞相比，PC-3中的UXT mRNA水平显著升高(Markus等人，2002年). 我们从UXT mRNA（未描述）方面证实了这一观察结果，并发现内源性UXT蛋白水平也是如此(图9 A). 考虑到UXT在刺激后被招募到NF-κB增强子小体上，并且保持核内NF-kb B的存在是必要的，这些结果表明UXT水平和NF-kb.B激活之间可能存在相关性。

为了进一步探讨这种可能性，我们确定抑制内源性UXT表达是否会影响PC-3细胞核NF-κB的构成量。如所示图9 C，这种干扰确实降低了该细胞中核NF-κB的数量，这与TNF-α刺激293T细胞中观察到的结果一致。此外，荧光素酶分析显示，UXT表达的减少抑制了PC-3细胞NF-κB的组成性转录活性(图9 D). 此外，EMSA证实，UXT的丢失也抑制了NF-κB的构成性DNA结合活性，但不抑制对照sp1(图9 E). 这些结果表明，UXT的高表达与前列腺癌细胞系中构成性NF-κB活性密切相关，再次证实了UXT对核内NF-κ·B功能至关重要的概念。

转录因子NF-κB家族对许多关键的细胞过程至关重要。最近，NF-κB活性的调节已成为人们关注的焦点(Dixit和Mak，2002年；Ghosh和Karin，2002年). 在这个过程中牵涉到一些转录辅因子。例如，p300/CBP在体内p65的乙酰化中起着主要作用(Chen等人，2002年). 相反，乙酰化的p65被HDAC3脱乙酰化(Chen等人，2001年). 最近的研究还表明，SIRT1与p65发生物理相互作用并促进p65脱乙酰化(Yeung等人，2004年). 此外，据报道，NF-κB在激活期间在多个位点被磷酸化。例如，IKKα被证明可以加速NF-κB的转换及其从促炎基因启动子中的清除(劳伦斯等人，2005年). 一个新出现的主题是，核NF-κB还有其他重要的调控层。

调节p65核存在的持续时间是调节NF-κB转录反应的另一种潜在机制。在这项研究中，我们将UXT描述为NF-κB在其增强子体中功能的一种新的重要辅因子。一些研究结果支持这一论点。（1） UXT在体外和体内均与p65直接相互作用。重要的是，这种相互作用依赖于外部刺激。由于UXT几乎只存在于细胞核内，我们推断只有在NF-κB转位到细胞核后，这种相互作用才能发生，这也被PC-3细胞中NFκB组成性地位于细胞核内并因此受UXT调节的观察所证实。（2） ChIP和EMSA分析表明，UXT在体内定位于NF-κB增强子体内，并在刺激后被招募到其中。（3） UXT的敲除并不影响核外NF-κB活化的分子事件。相反，它降低了细胞核p65的数量，并严重损害了NF-κB的活化。这种减少可以通过抗siRNA外源性UXT来挽救。（4） UXT的过度表达导致了A20和IL-8对TNF-α的边际协同诱导。我们推断，293T细胞的细胞核内有足够数量的内源性UXT，因此很难更显著地证明协同效应。令人信服的是，UXT的RNAi导致了各种刺激物对NF-κB反应性报告基因表达的明显减弱，并最终导致了NFκB紧密调控的基因的诱导表达。（5） TNF-α诱导的内源性UXT驯化细胞凋亡减少，这是NF-κB功能受损的已知指标。（6） PC-3细胞在细胞核内表现出结构性NF-κB活性。这与细胞核内NF-κB和UXT的升高密切相关，PC-3细胞内内源性UXT减少时NF-kb B的丢失及其活性也一致证实了这一点。因此，UXT可能发挥延长核内NF-κB或其增强子体持续时间的作用。

这一功能可能是通过在NF-κB的增强子体内培养一种有利的构象来实现的。UXT最近被预测为α类PFD家族蛋白的新成员。酵母和人PFD 1-6组装成六聚体复合物，在蛋白质折叠中起分子伴侣的作用。我们的初步数据还表明，UXT在体内形成低聚物（未公布的数据）。PFD家族蛋白的一些成员参与转录调控，例如c-myc转录中的PFDN5（MM1）(Satou等人，2001年)和URI在雷帕霉素敏感的转录反应中(Gstaiger等人，2003年). 然而，其具体作用机制尚不清楚。我们已经产生了UXT的几个点突变（C75A、L32P、L50P、L59P和L32P/L50P/L59P），并且没有发现UXT和p65相互作用之间的任何实质性相关性。我们推测，这种相互作用可能涉及一个三维并列的主题。我们的实验室正在对UXT和NF-κB相互作用进行结构分析，希望这能阐明UXT是如何发挥这种调节作用的。

最近，研究表明泛素-蛋白酶体降解途径也参与了启动子结合p65的严格控制(Ryo等人，2003年；Saccani等人，2004年). 发现NF-κB辅活化子Pin1结合p65并阻止SOCS-1介导的泛素化(Ryo等人，2003年). 我们已经尝试解决泛素-蛋白酶体途径是否对UXT背景下p65稳定性至关重要，但目前还无法得出结论。问题在于，大多数蛋白质在泛素化后立即降解，p65也是如此。为了防止这种障碍，蛋白酶体抑制剂被用来稳定泛素化蛋白质。不幸的是，NF-κB激活过程中的一个关键步骤涉及蛋白酶体功能（即iκBα降解），这使得探测细胞核内内源性p65降解变得不切实际。少数报道核p65泛素化的论文经常使用p65的过度表达来回答这个问题，这是一个有争议的方法。采用这种方法后，我们确实观察到了敲除UXT时p65泛素化的痕迹（未发表的数据），这与已发表的报告相当(Ryo等人，2003年). 然而，我们认为将UXT的缺失与p65泛素化联系起来还为时过早。实质上，我们发现，尽管内源性UXT被敲除，但核出口的特异性抑制剂LMB增加了p65的核积累。更有可能的是，UXT影响了p65核质穿梭。

鉴于这项研究的结果，我们支持UXT是一种核伴侣，可以促进NF-κB增强子体的形成。核伴侣通常介导核小体组装和重塑(Philpott等人，2000年；Loyola和Almouzni，2004年). 此外，它们被暗示直接调节转录因子。例如，名为FACT（促进染色质转录）的核伴侣可以通过核小体促进转录延伸(孤儿等，1998年). 另一种人类核伴侣（bZIP增强因子）促进了bZIP（碱性区-亮氨酸拉链DNA结合域）蛋白的转录活性(Virbasius等人，1999年). JDP2最近被证明是AP1的伴侣(Jin等人，2006年). 此外，核伴侣也能负调控转录。例如，核伴侣p23和Hsp90与糖皮质激素诱导的调节复合物结合，从而分解这些复合物(弗里曼和山本，2002年). 总之，核伴侣具有针对其特定客户蛋白质的调节功能，而不是蛋白质合成和成熟的经典功能。在充分理解UXT动作的功能和机制之前，还需要做更多的工作。

许多报告记录了NF-κB活化与特定类型癌症之间的显著相关性（综述见Rayet和Gelinas，1999年). 通过促进增殖和抑制凋亡，NF-κB可以使肿瘤细胞增殖和凋亡之间的平衡朝着恶性行为倾斜（综述见Rayet和Gelinas，1999年). 前列腺癌始于雄激素依赖性肿瘤，发展为雄激素依赖型肿瘤。在这个过程中，NF-κB活性上调(Chen和Sawyers，2002年；Zerbini等人，2003年). 在本研究中，我们为这种相关性提供了一种新的解释思路，并证明UXT对前列腺癌细胞NF-κB的组成活性至关重要。

总之，我们的研究表明，UXT是NF-κB增强子小体的一个组成部分，对其在细胞核中的功能至关重要。在这一过程中，UXT可能作为NF-κB的特异性分子伴侣发挥作用。未来的研究将集中于UXT如何与NF-κB相互作用，以及如何调节核内NFκB的动态过程。

单克隆UXT抗体6D3和105.128分别由M.I.Greene（宾夕法尼亚大学，宾夕法尼亚州费城）和W.Krek（瑞士苏黎世Eidgeno­ssische Technische Hochschule Honggerberg）提供。基因制药公司化学合成了UXT-siRNA双工体。UXT siRNA序列如下：242，AGCACUCGGAGUUAUAUdTdT；428，CCAAGGACUCCAUGAAUAUdT；和428M1，CCAACCCCUCCAUGAAUdTdT。对照siRNA序列为UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT，CARM1 siRNA序列是GCAGUCCUUCAUCAUCCdTd。使用的其他商用试剂和抗体如下：HA、p65、p65，p50、IκBα和RNA聚合酶II抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.。Flag、sp1和β-actin抗体购自Sigma-Aldrich。Anti-myc是从Wolwobiotech购买的。rhTNFα和RhIL-1β购自R&D Systems，脂多糖购自Sigma-Aldrich。

通过PCR从人类胸腺文库中构建UXT及其缺失突变体，然后克隆到哺乳动物表达载体中，如图所示。通过在siRNA 428靶序列中引入四个沉默突变（373 ACAAAAAGATAGC 384），产生了UXT siRNA-resistant形式。前面已经描述了Flag-IκBαSR、Flag-TRAF6和报告基因（3×κB-luc和pRL-SV40）(刁等人，2005年). pcDNA3-HA-p65是G.Pei（中国上海生物化学与细胞生物学研究所[SIBCB]）的礼物，其缺失突变体是通过PCR构建的。MyD88从人类胸腺文库中扩增并亚克隆到pcDNA3.1-Flag载体中。HA–淋巴增强因子结合因子1由L.Li（中国上海SIBCB）提供，HA-p50和mp40-luc由B.Sun（中国上海上海SIBCB）提供，myc-cRel由B.Huang（中国长春东北师范大学）提供，A20由L.Guo（中国上海SABCB）提供。

将编码人类p65残基1–312的cDNA片段插入到Gal4 DNA结合域载体pGBKT7的框架中。根据制造商推荐的方案筛选人类胸腺cDNA文库（CLONTECH Laboratories，Inc.）。

293T和RAW264.7细胞在添加10%FBS（Hyclone）的DME（Invitrogen）中培养。PC-3细胞在添加10%FBS的RPMI 1640培养基（Invitrogen）中培养，LNCaP细胞在添加10%FBS的Ham’s F12培养基（Invitrogen。

细胞接种在24孔板中，并用40 pmol siRNA转染，结合报告物和其他结构物，如图所示。通过补充pcDNA3，DNA总量保持不变。共转染pRL-SV40（Promega）以使转染效率正常化。转染后48小时，用指定的试剂处理细胞或不处理细胞。使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）分析荧光素素酶活性。

UXT和p65在体外翻译并标记为[³⁵S] 根据制造商的说明，使用TNT快速耦合转录/翻译系统（Promega）的蛋氨酸。

根据制造商的说明，用TRIzol（Invitrogen）分离总RNA。使用寡核苷酸dT引物对纯化的RNA进行逆转录。使用SYBR绿色I染料（Invitrogen）通过实时PCR对基因转录物进行定量。用对照β-肌动蛋白标准化表达值。所使用的引物如下：IL-8、正义（AGGTGCAGTTGCCAAGGA）和反义（TTTCTGTTGGCCAGTG）；IκBα，正（CTGAGCTCCGAGACTTTCAGG）和反（CACGTGGCACATTGTGG）；A20，正（GCGTTCAGGACACACTTG）和反（GCAAAGCCCGTTTCAACAA）；UXT，正（TTTGGGCTGTAACTTTCTTCGT）和反（ATATTCATGGAGTCTTGGTG）；CARM1，正（TGCCGACCGCCTATGACT）和反（CCCGTGTTGGCTAAGGAA）；β-肌动蛋白，正（AAAGACCCTGTACGCCAACA）和反（GTCATACTCTGCTCTGAT）。

如前所述进行EMSA(Yang等人，2006年). 使用的探针如下：野生型κB探针（AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC）、突变型κB探针（AGttGAGGCGACTTCCCCAGGCC）和sp1探针（ATTCGATCGGGGGCGAGC）。

根据制造商的说明使用ChIP检测试剂盒（Upstate Biotechnology），但有一些变化。在室温下进行甲醛交联10分钟，然后将甘氨酸添加到最终浓度为125 mM的溶液中5分钟。快速收集细胞并在SDS裂解缓冲液中进行裂解。通过超声波将悬浮染色质剪切至平均大小200–1000 bp，离心至颗粒碎片，并用稀释缓冲液稀释10倍。将提取物与鲑鱼精子DNA和BSA-饱和蛋白A/G珠预先分离2 h。使用IgG作为阴性对照的抗体在4°C下过夜进行免疫沉淀。收集免疫复合物并依次用Tris-SDS-EDTA缓冲液I、II和III洗涤，然后用Tris-EDTA缓冲溶液洗涤两次。然后用洗脱缓冲液提取免疫复合物，并通过在65°C下加热过夜来破坏DNA:蛋白质复合物。蛋白酶K消化1h后，用酚氯仿提取DNA并在乙醇中沉淀。每次PCR反应中，约二十分之一的沉淀DNA用作模板。使用了以下启动子特异性引物：人类A20、正义（CAGCCCACCAGAGAGTCAC）和反义（CGGGCTCGCTT）；人类GAPDH、正义（AGCTCAGGCCTCAAGACTT）和反义（AAGAAGATGCTGACTGT）；以及人类IκBα、正义（TAGTGGCTCATCGCAGGGAG）和反义（TCAGGCTCGGGAATTTTCC）。

盖玻片上生长的细胞用4%的PFA固定，在0.1%的Triton X-100中渗透，用1%的BSA封闭，用指示的一级抗体染色，然后用FITC-结合的抗鼠IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories）染色。用DAPI（Sigma-Aldrich）对细胞核进行复染。幻灯片由Aqua-Poly/Mount（Polysciences）安装。使用共焦显微镜（TCS SP2 ACBS；徕卡）和63×NA 1.4油物镜（徕卡）在室温下拍摄图像，但图2 C使用显微镜（BX51；Olympus）上的相机（DP70；奥林巴斯）和10×NA 0.3物镜拍摄。采集软件为TCS（徕卡）或DPcontrol（奥林巴斯）。

用指示的siRNA转染293T细胞。转染后48小时，用50 ng/ml TNF-α和5μg/ml CHX处理细胞或不处理18小时。使用膜联蛋白V–藻红蛋白凋亡检测试剂盒I（BD Biosciences）和原位细胞死亡检测试剂盒（TUNEL；Roche）收集并分析漂浮和粘附细胞根据制造商的说明。使用的流式细胞仪为FACSCalibur（BD Biosciences）。

我们感谢Mark I.Greene博士和Wilhelm Krek博士提供单克隆UXT抗体，并感谢Baiqu Huang博士提供c-Rel质粒。

C.Wang是中国科学院改造项目（KSCX1-YW-R-06）的学者。本研究得到了中国科学技术部（2006CB504301和2006AA02Z121）和国家自然科学基金（30225013、30570378和30623003）的部分资助。