高迁移率族盒1促炎性细胞因子活性的结构基础

摘要

高迁移率族蛋白盒1（HMGB1）是一种普遍存在的DNA结合蛋白，被认为是致死性内毒素血症的促炎细胞因子和晚期介质。HMGB1由活化的巨噬细胞释放。它通过诱导细胞因子释放和介导急性肺损伤、厌食症和组织坏死的炎症反应来放大和扩大炎症反应。HMGB1释放动力学为内毒素血症提供了一个广阔的治疗窗口，因为HMGB1的细胞外水平在暴露于炎症刺激后12至24小时开始增加。在这里，我们证明HMGB1的DNA结合域，即B盒，概括了全长HMGB1细胞因子活性，并有效激活巨噬细胞释放肿瘤坏死因子（TNF）和其他促炎细胞因子。B盒的截短显示TNF刺激活性定位于20个氨基酸（HMGB1氨基酸89至108）。用B盒抗体对小鼠进行被动免疫，可显著预防盲肠穿孔引起的致死性内毒素血症或败血症。这些结果表明HMGB1的一个促炎性结构域映射到高度保守的DNA-结合B盒，使该初级序列成为治疗药物设计的合适靶点。

介绍

高迁移率族蛋白B1（HMGB1，前身为HMG-1，两性霉素）是一种丰富的核和细胞质蛋白，20世纪70年代首次鉴定为与核染色质相关的30-kDa蛋白(1,2). 研究了HMGB1/DNA相互作用在促进核蛋白复合物的形成和稳定性、促进糖皮质激素受体的基因转录和介导RAG重组酶活性方面的作用(三–7). HMGB1有3个主要结构域：2个DNA结合基序，称为HMG A和HMG B盒，以及一个酸性羧基末端。2个HMG盒是70到80个氨基酸L形结构域，由3个α螺旋段形成，对DNA结合很重要(8,9). HMGB1通过疏水性氨基酸与DNA的小沟槽结合，这些疏水性氨基酸可以扩张沟槽并促进DNA的解舒和弯曲，从而形成核蛋白复合物，增强几种转录因子的活性(8,10). 体内HMGB1基因的破坏与产后第2天的存活率不兼容(11).

我们最近发现HMGB1是延迟内毒素致死的晚期细胞因子介体(12–14). HMGB1由内毒素或促炎细胞因子刺激的单核细胞/巨噬细胞释放(12,15). 患有致命败血症或出血性休克的危重患者的血清HMGB1水平升高。最高水平出现在死于疾病的患者中(12,16). 针对HMGB1的抗体可显著保护机体免受内毒素诱导的致命性，即使在早期促炎细胞因子反应得到解决后才给予抗体(12). 直接气管内注射HMGB1会导致急性肺损伤，抗HMGB1抗体对内毒素诱导的肺损伤具有显著保护作用(14). 脑内HMGB1水平升高介导发热和厌食症(17). 与其他促炎细胞因子（例如肿瘤坏死因子[TNF]和白细胞介素[IL]-1）一样，HMGB1是一种有效的单核细胞激活剂，可刺激TNF和活化巨噬细胞的其他产物的释放(13). HMGB1通过与组织纤溶酶原激活因子的相互作用促进纤溶酶的形成，是神经元培养的生长因子，并介导增强的平滑肌细胞趋化性(18–20). 单核细胞通过炎症刺激激活的非典型内溶酶体样途径释放HMGB1(21). HMGB1也可由受损或坏死细胞释放，并作为坏死诱导炎症的主要刺激物(22).

我们最近启动了实验，以阐明HMGB1炎症活性的分子基础。令人惊讶的是，HMGB1的B盒被证明足以诱导小鼠类巨噬细胞（RAW 264.7）细胞培养物释放TNF(23). 基于这些初步发现，我们探讨了重组B盒对人小肠细胞系的生物学效应和体内回肠粘膜通透性(24). B盒在体外以时间和剂量依赖的方式诱导人肠上皮细胞Caco-2的可逆通透性，并在体内改变胃肠粘膜屏障功能。之前还不清楚B盒是否足以刺激巨噬细胞中细胞因子的合成。

在这里，我们报告了HMGB1细胞因子活性的结构基础。对嵌套在DNA结合域周围的截短HMGB1肽的巨噬细胞刺激活性的比较表明，HMGB1的促炎活性定位于B盒，最显著的细胞因子功能映射到该域的前20个氨基酸残基（HMGB1氨基酸89到108）。在注射脂多糖（LPS）或诱导细菌性腹膜炎后，针对B盒的抗体对小鼠的致命性具有显著保护作用。HMGB1炎性结构域一级结构的鉴定现在为针对HMGB1过度释放的疾病设计新的基于结构的治疗药物提供了机会。

材料和方法

材料

重组小鼠TNF来自R&D System Inc（美国明尼阿波利斯）。异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷购自皮尔斯精细化工公司（美国伊利诺伊州罗克福德）。多粘菌素B，^d日-氨基半乳糖HCL、脂多糖（内毒素，大肠杆菌.0111:B4）和非免疫兔IgG购自Sigma Chemical（美国密苏里州圣路易斯）。DNase I和2×YT培养基来自Life Technologies（美国纽约州格兰德岛）。抗核因子κB（NF-κB）亚单位p50和p65抗体购自Santa Cruz Biotechnology Inc（美国加州圣克鲁斯）。用于激酶分析的一级抗体、磷酸化应激活化蛋白激酶（SAPK）/Jun N末端激酶（JNK）（Thr183/Tyr185，Cat#9251）和磷酸化p38 MAP激酶（Thr180/Tyr182，Cat#9211）均来自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州贝弗利）。HRP相关二级抗兔IgG购自Amersham Pharmacia Biotech（Cat#NA 934，Uppsala，Sweden）。

肽合成

在犹他州立大学生物技术中心（美国犹他州洛根）合成肽并进行HPLC纯化，纯度为90%。通过鲎试验测定，合成肽制剂中未检测到内毒素。

细胞培养

小鼠巨噬细胞样RAW 264.7细胞和小鼠成纤维细胞L929细胞（美国类型培养收藏馆，马里兰州罗克维尔，美国）在添加了10%热灭活胎牛血清（Gemini，Catabasas，CA，USA）的RPMI 1640培养基（RAW 2647cells）或DMEM（L929 cells）（美国纽约州格兰德岛生命科技公司）中培养，青霉素（50单位/mL）和链霉素（50µg/mL）（Life Technologies）在具有5%和95%室内空气的加湿培养箱中。细胞在90%的汇合处使用，并在无血清Opti-MEM I培养基（Life Technologies）中进行处理。如前所述，用5 mL HEPES缓冲RPMI培养基进行腹腔灌洗，获得C3H/HeJ小鼠的硫乙醇酸合法腹腔巨噬细胞(13). 细胞在含有10%胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基中培养，如上所述。

聚合酶链反应（PCR）

通过PCR扩增，从人脑快速克隆cDNA（Clontech，Palo Alto，CA，USA）中克隆出重组人HMGB1（651bp），使用以下引物：正向引物5′GATGGCAAAGGATCCTAAG 3′和反向引物5’GCGGCCGC公司TTATTCATCATCATCTTC 3′。一个非I站点被添加到了带下划线的反向引物中。通过PCR扩增从人脑快速克隆cDNA（Clontech）中克隆人HMGB1的截短型。引物为B盒（233bp）、5′AAG TTC AAG GAT CCC AAT GCA AAG 3′和5′GCG GCC CAA TAT GCA ATA TCC TTT TC 3′；和一个盒子（261 bp），5′GAT GGG CAA AGG AGA TCC TAA G 3′和5′TCA CTT TTT TGT CTC CCC TTT GGGG 3′。每个突变体都添加了一个终止密码子，以确保蛋白质大小的准确性。

蛋白质表达与纯化

按照制造商的说明，使用TA克隆方法将PCR产物亚克隆到pCRII-TOPO载体EcoR I位点上（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。扩增后，用EcoR I消化PCR产物，并将其亚克隆到带有谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签的表达载体（pGEX）中（美国新泽西州皮斯卡塔韦市法玛西亚）。阳性克隆的正确定向通过两条链的DNA测序得到证实。重组质粒转化为蛋白酶缺陷型大肠杆菌菌株BL21（美国威斯康星州麦迪逊诺瓦根），在含有氨苄西林（50µg/mL）的2×YT培养基中37°C下培养5至7小时，剧烈摇晃直至A处的光密度₆₀₀达到1至1.5。通过在37或25°C下添加1 mM异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷3 h（对于B盒）诱导融合蛋白表达。细菌在冰镇磷酸盐缓冲盐水（PBS）加1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma Chemical）和1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）中进行超声处理。离心后（8000×克)为了去除细菌碎片，使用谷胱甘肽Sepharose树脂柱（Pharmacia）对细菌裂解液进行亲和纯化。表达、纯化GST载体蛋白，并使用重组GST-HMGB1蛋白作为实验对照。蛋白质洗脱液经PBS大量透析以去除多余的还原型谷胱甘肽，通过多粘菌素B柱（Pierce，Rockford，IL，USA），冷冻干燥，并在使用前在无菌PBS中再溶解。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证蛋白质的完整性。纯度主要超过85%。

HMGB1或B盒GST标签的裂解

HMGB1-或B含盒细菌裂解物与谷胱甘肽-Sepharose亲和柱结合后，用10柱体积的冷冻PBS清洗柱，以去除未结合蛋白，然后用10柱容量的蛋白酶缓冲液（50 mM Tris HCl，pH 8，150 mM NaCl和1 mM EDTA）平衡。对于每毫升谷胱甘肽Sepharose珠，在含有1 mM二硫苏糖醇的1 mL蛋白酶缓冲液中添加80单位的精密蛋白酶（2000单位/mL，Pharmacia）。在室温下以温和的旋转方式消化3h。消化完成后，将悬浮液离心500倍克5分钟，使Sepharose珠颗粒化；收集含有HMGB1或B盒蛋白的洗脱液。

DNase I处理

在含有HMGB1突变蛋白的细菌裂解物与GST柱结合后，以80单位/mL谷胱甘肽Sepharose珠添加DNase I，并在室温下在含有100 mM NaAc（pH 5）和5 mM MgCl的缓冲液中培养20 min₂用5个柱体积的冰冷PBS洗涤柱；然后用制造商（法玛西亚）描述的还原型谷胱甘肽洗脱蛋白质。DNA酶I处理前后，对含有HMGB1蛋白的琼脂糖凝胶进行溴化乙锭染色，以验证DNA降解。

LPS含量

蛋白质洗脱液通过多粘菌素B柱去除任何污染的LPS。细胞培养中使用的蛋白质的LPS含量通过显色鲎阿米巴细胞裂解物分析测定（美国马里兰州沃克斯维尔BioWhittaker公司）。HMGB1中LPS含量为219 pg/µg蛋白质，B盒中为19 pg/µg/µg，A盒中为16 pg/¦Μg，GST载体中为4 pg/Μg。为了进行刺激实验，将多粘菌素B添加到6单位多粘菌毒素B/pg LPS的细胞培养基中。

RNA提取和核糖核酸酶保护试验

为了进行mRNA测量，将RAW 264.7细胞置于100-mm板中，并在含有B盒或载体的Opti-MEM I培养基中处理0至24小时。根据制造商的说明，从板上刮下细胞，并使用RNAzol B方法分离总RNA（Tel-Test“B”Inc，Friendswood，TX，USA）。TNF mRNA（287 bp，BD PharMinen，San Diego，CA，USA）通过RNase保护试验（Ambion，Austin，TX，USA。琼脂糖甲醛凝胶上RNA样品的溴化乙锭染色验证了RNA的等负荷和完整性（数据未显示）。

核提取物制剂

10岁时对RAW 264.7细胞进行电镀⁶每个6厘米培养皿中培养细胞，并单独用培养基（对照）或B盒培养不同时间段，如图所示。用冰镇PBS清洗细胞两次，并在含有2%FBS的1mL PBS中从平板上刮下。将细胞转移到1.5mL微滤管中，在14000×克持续10s，去除上清液。将细胞颗粒悬浮在缓冲液I中（10 mM KCL，1.5 mM MgCl₂，0.3 M蔗糖，500µM PMSF，1.0 mM原钒酸钠，1 mM DTT，10 mM Tris HCl，pH 7.8），并在室温下培养15分钟。添加Nonide®P40至最终浓度10%后，通过310×离心分离细胞核克3分钟后，将上清液丢弃。将核颗粒轻轻悬浮在缓冲液II（500µM PMSF、1.0 mM原钒酸钠、1 mM DTT、420 mM KCl、1.5 mM MgCl₂，20%甘油，10 mM Tris HCl，pH 7.8），并在室温下培养15分钟。在14000×克培养10分钟，将上清液转移到新鲜试管中；蛋白质浓度通过Bradford分析测定（Bio-Rad，Hercules，CA）。核提取物在使用前保存在−80°C。

电泳迁移率变化分析（EMSA）

双链核因子NF-κB寡核苷酸序列如下：5′AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C 3′；反义，3′TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G 5′（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。寡核苷酸末端标记有α-³²PATP（New England Nuclear，Boston，MA，USA）使用T4多核苷酸激酶（Promega）。核蛋白（3µg）与α-³²在2µg poly[d（I-C）]（美国印第安纳州印第安纳波利斯市博林格曼海姆）存在下，在带移缓冲液（65 mM NaCl，1 mM DTT，0.14 mM EDTA，8%甘油和13 mM HEPES，pH 8.0）中的P标记NF-κB探针溶液中，在室温下保持20分钟。对于竞争实验，通过将核提取物与100倍摩尔过量的未标记寡核苷酸同时添加到标记探针中，或在添加放射性标记探针之前与非免疫抗体（2µg/mL）预孵育1h，进行超移分析。结合反应混合物在含有5%甘油和0.25×TBE缓冲液的4%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳。PAGE后，使用增感屏将凝胶干燥并在−80°C的温度下暴露于Biomax-5膜（美国纽约州罗切斯特市伊士曼柯达公司）中过夜，并进行密度分析。

激酶分析

将来自C3H/HeJ小鼠的硫代乙醇酸合法的初级巨噬细胞以2×10的比例接种⁶/在6厘米的培养皿中，用B盒或HMGB1（10µg/mL）刺激0至60分钟。刺激后，用冰镇PBS清洗细胞，并用含有钒酸盐和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）的SDS样品缓冲液进行裂解。对样品进行超声处理，煮沸5分钟，然后离心（10000×g，5分钟，4°C）；然后进行Western免疫印迹分析。

抗体生产

在兔子（Cocalico Biologicals，Inc，Reamstown，PA，USA）或母鸡（Aves Labs，Tigard，or，USA，美国）中培养抗B盒的多克隆抗体，并通过Western blotting检测效价。根据制造商的说明（美国伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯），使用蛋白A琼脂糖从抗-B盒抗血清中纯化IgG。IgY是从B盒免疫蛋黄中分离出来的，由Aves Labs（Tigard，OR，USA）提供。抗-B盒兔抗体按照标准程序使用氰溴化物活化的Sepharose珠进行亲和纯化，可从Cocalico Biologicals Inc.获得。在暴露于重组HMGB1的巨噬细胞培养物中证实了HMGB1抗体的中和活性，并检测了抗体抑制TNF释放的能力。

动物实验

雄性Balb/C和C3H/HeJ小鼠（6至8周）购自Harlan Sprague-Dawley（印第安纳波利斯，印第安纳州，美国），在实验中使用之前允许其适应7天。小鼠被安置在北岸大学医院动物设施内，处于标准的温度、光照和黑暗周期。所有动物程序都经过北岸大学医院动物设施IACUC的审查和批准。

LPS杀伤能力

Balb/C小鼠被给予LD₇₅腹腔注射LPS的剂量（15 mg/kg），并用纯化的兔抗-B盒IgG抗体（非免疫兔IgG作为对照，每次腹腔注射600微克）或纯化的抗-B盒子IgY，每次注射60或600微克。LPS给药后0、12和24小时注射。每天监测死亡率，持续2周。

盲肠结扎和穿刺（CLP）

CLP的执行如前所述(25). 简单地说，Balb/C小鼠通过肌肉注射75 mg/kg氯胺酮（美国伊利诺伊州道奇堡，道奇堡）和20 mg/kg甲苯噻嗪（美国密苏里州圣约瑟夫，博林格·英格尔海姆）进行麻醉。进行15 mm中线切口，暴露盲肠。在离盲肠尖端5 mm处，离回盲瓣5 mm处放置6–0 prolene缝合带。然后用22号针头刺穿结扎的盲肠残端一次，不直接挤压粪便。盲肠被替换回正常的腹内位置。腹部伤口用两层连续缝合线闭合，腹膜和筋膜分开，以防止液体泄漏。所有动物均以20 mL/kg体重皮下注射生理盐水进行复苏。每只小鼠在手术后30分钟接受皮下注射亚胺培南（0.5 mg/只小鼠在200µL无菌盐水中）（Primaxin，Merck&Co Inc，West Point，PA，USA）。CLP后12、24或36小时开始，每天两次腹膜内给予抗B盒兔IgG（60或600µg/小鼠，在400µL无菌PBS中），持续3天。对照组注射相应剂量的非免疫IgG。术后1周内记录死亡率；对幸存者进行了2周的随访，以确保没有发生晚期死亡事件。

B盒毒性

描述了D-氨基半乳糖致敏模型(26,27). 小鼠腹腔注射20 mg^d日-200µL PBS和B盒、A盒或载体蛋白中的半乳糖胺-HCL/小鼠，剂量为200µL PBS中规定的剂量。注射后72小时内每天记录死亡率；对幸存者进行了2周的随访。

组织学评价

D类-半乳糖胺致敏小鼠用B盒处理7h后处死；器官被收获并固定在10%甲醛中。组织切片用苏木精和伊红染色以进行组织学评估（加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市标准公司）。

细胞因子测量

如前所述，使用标准L929细胞毒性生物测定法测定TNF浓度(28). IL-1β、IL-6和IL-10水平由制造商（美国明尼阿波利斯R&D System Inc）提供的商业ELISA试剂盒测定。

统计分析

数据以平均值±SEM表示。治疗组之间的差异由Student’st吨检验，单因素方差分析，然后进行最不显著差异检验或Fisher精确检验；P（P）值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

HMGB1的B盒对促炎细胞因子功能至关重要

为了阐明HMGB1促炎细胞因子刺激活性的最低一级序列要求，表达、纯化了全长和截短形式的HMGB1，并将其添加到小鼠巨噬细胞样RAW 264.7培养物中。全长（野生型）和HMGB1 B盒构建每个刺激巨噬细胞TNF释放，表明删除的序列对促炎细胞因子刺激活性不是必需的（图1). 没有B盒的A盒截断物没有显著刺激TNF释放，表明HMGB1的TNF刺激功能位于B盒的初级序列中（HY和KJT，提交）。去除GST标签或DNA酶处理后，我们通过HMGB1或B盒观察到类似的TNF刺激活性（数据未显示），表明细胞因子刺激活性存在于蛋白质本身。为了确定B盒中的较短结构域是否能够刺激细胞因子释放，将重叠的合成20-残基肽与RAW 264.7细胞培养物孵育。对培养基的分析显示，B盒的前20个残基（B1-B20，对应于HMGB1残基89-108）特异性刺激TNF释放（见图1). 其他20-残基肽，对应HMGB1的109-153残基，未能刺激TNF的释放，直接证明显著巨噬细胞刺激活性的最低一级序列要求映射到B盒结构域的前20个氨基酸。B盒还剂量依赖性地刺激巨噬细胞培养物中IL-1β和IL-6的释放，这种活性与全长HMGB1相同（图2安培, 13). 有趣的是，B盒未能诱导抗炎细胞因子IL-10的释放，这表明B盒选择性地触发巨噬细胞释放促炎细胞因子。巨噬细胞培养物暴露于B盒显著增加TNF mRNA的积累；将B盒添加到培养物中后，浓度增加了8小时以上（见图2B型). 我们观察到，重组B盒和全合成B盒（Innovagen AB Inc，S-223 70 Lund，Sweden）均通过RAW 264.7细胞培养刺激TNF，表明重组B盒的巨噬细胞刺激作用是特定的（数据未显示）。使用亲和纯化的兔抗B盒抗体获得了进一步的特异性证据，该抗体显著抑制了暴露于全长HMGB1或B盒培养物中的TNF释放（见图2摄氏度). 在另一项研究中，我们还检测了LPS抗性C3H/HeJ小鼠原代腹腔巨噬细胞诱导释放TNF的情况。C3H/HeJ小鼠是一种近交系，由于编码Toll样受体4的基因突变，对LPS的促炎作用具有抗性(29). HMGB1和B盒均刺激C3H/HeJ巨噬细胞释放TNF（数据未显示），表明HMGB1与B盒在缺乏LPS受体信号转导的情况下有效。总的来说，这些数据表明HMGB1的促炎域映射到B盒内的一级序列，并且仅B盒就足以具体地再现全长HMGB1对细胞因子的刺激作用。

图1

HMGB1蛋白和肽的TNF刺激活性。24孔培养板中的小鼠巨噬细胞样RAW 264.7细胞用HMGB1或B盒以1µg/mL或合成肽以10µg/mL处理8 h；通过小鼠成纤维细胞L929细胞毒性生物测定测定上清液中TNF的释放。所示数据为平均值±SEM，n个=3至10个单独的实验；每种方法重复进行，并使用3批不同的合成肽进行验证。

图2

B盒在体外刺激细胞因子释放。A： B盒刺激巨噬细胞培养物中TNF、IL-6和IL-1β的释放。将24孔培养皿中的RAW 264.7细胞以0至10µg/mL的B盒刺激10 h；收集条件培养基进行细胞因子分析。B盒刺激TNF、IL-1β和IL-6（但不是IL-10）的释放呈剂量依赖性。所示数据为平均值±SEM，n个=5个独立实验。B： B盒以时间依赖的方式刺激TNF和TNF mRNA。用B盒或GST载体（10µg/mL）刺激RAW 264.7细胞的上清液0至24小时后，通过L929细胞毒性试验分析TNF水平。与载体蛋白相比，B盒以时间依赖的方式诱导TNF释放。n个=3到5个独立实验。从RAW 264.7细胞中分离出总RNA，如材料和方法中所述，仅用B盒或载体刺激。采用RNase保护试验（材料和方法）测定TNF mRNA水平。数据代表了3个单独的实验。C： 抗B盒抗体特异性抑制HMGB1和B盒依赖性TNF刺激。将24孔培养皿中的次级融合RAW 264.7细胞用HMGB1（1µg/mL）或B盒（10µg/mL）处理10 h，添加或不添加亲和纯化兔抗B盒抗体或非免疫IgG。TNF诱导活性表示为单独刺激所获得活性的百分比，其他蛋白的活性表示为HMGB1或B盒单独刺激所达到的百分比。仅HMGB1（1µg/mL）的TNF释放=10592±3210 pg/mL，B盒（10µg/mL）的TNF-释放=7828±3953 pg/mL。n个=3到5个单独的实验。

B盒概括了全长HMGB1在体内的致死性，抗-B盒抗体可降低内毒素和败血症致死性

为了评估B盒本身是否能在体内介导致死性，在标准化的d日-半乳糖胺致敏小鼠致死模型(26,27). B盒给药在Balb/C小鼠中引起了显著的剂量依赖性致死，而HMGB1 A盒或从缺乏B盒的载体纯化的对照蛋白没有引起致死（表1). B盒的全身给药对D类-半乳糖胺致敏、内毒素抵抗（C3H/HeJ）小鼠（数据未显示）。暴露于B盒后7h，小鼠血清IL-6和IL-1β水平显著升高；此时血清TNF没有增加（图3A级). 服用B盒7小时后采集的心脏、肾脏、肝脏和肺的苏木精和伊红染色切片显示，肺或肾没有明显异常形态学变化（未显示）。然而，对心脏切片的检查显示，有证据表明缺血，心肌纤维中的横纹和无定形粉红色细胞质消失。肝脏切片显示轻度急性炎症反应，部分肝细胞脱落和凋亡，偶尔出现多形核白细胞（见图3B公司). 这些特定的病理变化与服用全长HMGB1后观察到的变化相当（数据未显示），证实B盒本身再现了体内对HMGB1的致命病理反应。

表1 B盒的毒性d日-半乳糖胺致敏Balb/C小鼠^一

图3

B盒在体内有毒。A： 用B盒治疗的小鼠血清IL-6和IL-1β水平升高。每只Balb/C小鼠腹腔注射20 mg D-氨基半乳糖-HCL（在200µL PBS中）和1 mg B盒或载体蛋白（在200μL PBS内）。7小时后采血；用ELISA法分析血清中的TNF、IL-1β和IL-6（每组4至7只小鼠）*P（P）与对照组相比<0.05。B： B盒处理Balb/C小鼠的组织病理学。小鼠（每组3只）接受D-氨基半乳糖（20 mg/只）和B盒或载体（1 mg/只，腹腔注射）。7小时后将小鼠斩首处死。组织被采集并固定在10%的缓冲甲醛中。制备石蜡包埋组织切片，并用苏木精和伊红染色以进行组织学评估（加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市标准公司）。与对照组小鼠相比，B盒治疗导致心肌缺血改变和心肌纤维横纹丢失（箭头所示）。如急性活动性肝炎所示，B盒对肝脏的损害最大。可见凋亡肝细胞被多形核白细胞包围（箭头所示）。

为了确定靶向B盒的抗体是否能保护Balb/C小鼠免受延迟内毒素致死，用中和性抗B盒IgY抗体或无关对照IgY被动免疫Balb/C小鼠。注射抗B盒抗体可显著和剂量依赖性地预防致命内毒素血症（图4)，使用无关IgY治疗的小鼠存活率从31%提高到使用抗B盒抗体治疗的73%(P（P）< 0.05). 使用中和抗-B盒兔IgG也获得了类似的结果（抗-B盒子存活率=62%，而非免疫兔IgG=27%；n个=每组26只小鼠，P（P）< 0.05). 在盲肠结扎和穿刺诱导的小鼠败血症中，HMGB1水平也显著增加，并且与内毒素诱导的反应相比，HMGB1释放的动力学延迟（HY和KJT，提交的手稿）。为了确定抗-B盒对主动感染诱导的脓毒症啮齿动物模型是否有效，对小鼠进行盲肠结扎和穿孔诱导腹膜炎和脓毒症，并被动免疫抗-B盒子抗体。盲肠穿孔发生12小时后，注射IgG纯化的抗-B盒兔抗体显著提高了存活率（对照IgG治疗的小鼠存活率=22%，而抗-B盒子IgG的小鼠生存率=65%；n个=每组18至20人，P（P）<0.03，表2). 手术后24小时开始抗体治疗时也获得了类似的结果（非免疫IgG组生存率=27%，而抗-B盒生存率=72%；n个=每组18人，P（P）< 0.03). 盲肠结扎和穿刺后将第一次抗体注射延迟36小时未能提供保护，这表明抗B盒抗体可以在脓毒症发作后至少24小时内有效靶向HMGB1。抗体剂量反应研究表明，针对B盒的中和抗体在内毒素血症和败血症期间可特异性保护全长HMGB1的毒性（见表2).

图4

抗-B盒抗体可保护小鼠免受LPS致死。雄性Balb/C小鼠（每组10至18只）接受LD治疗₇₅LPS剂量（15 mg/kg，腹腔注射）。在LPS给药后的第0、12和24小时给予IgY纯化的抗-B盒抗体或非免疫IgY（每次腹腔注射60或600微克/小鼠）*经Fisher精确检验，与对照组相比，P<0.05。

表2抗-B盒抗体对CLP致死性的保护^一

HMGB1和B盒的信号转导途径

为了确定B盒作用的分子机制，我们研究了HMGB1和B盒的信号转导途径。HMGB1和B盒对巨噬细胞的刺激与从LPS抗性C3H/HeJ小鼠获得的巨噬细胞培养物中包括p38MAP和SAPK/JNK激酶在内的信号介质的激活有关（图5A级). HMGB1和B盒刺激p38 MAP和SAPK/JNK激酶的磷酸化，在培养物暴露于HMGB1后15分钟内开始。通过电泳迁移率变化分析核提取物³²P标记的NF-κB探针我们观察到，B盒显著刺激NFκB的核移位。NF-κB的核转位在10分钟内被激活，并保持激活至少24小时（见图第5页). 该动力学曲线与其他细胞因子激活的反应相似(30,31)并对应HMGB1或B盒诱导的TNF mRNA表达和TNF释放的时间范围（见图2B型). 为了鉴定参与B盒诱导的细胞内信号传导的NF-κB亚单位，用超移分析法对B盒刺激的RAW 264.7细胞的核提取物进行分析³²P标记的寡核苷酸，包含NF-κB与DNA结合所必需的一致序列。未标记的NF-κB特异性DNA探针，但与低氧诱导因子1的DNA结合共识序列相对应的未标记无关寡核苷酸取代了NF-κ的B-DNA复合物，表明NF-κ子B共识序列的特异性（见图第5页). 抗-p65 IgG导致蛋白质/DNA复合物迁移率显著超移，表明p65亚单位是HMGB1和B盒激活的复合物的组成部分（见图第5页). 因此，B盒通过2种途径（应激激酶和NF-κB）激活巨噬细胞信号转导，而这2种途径以前曾参与控制急性炎症反应(30–32).

图5

B盒介导细胞因子释放的信号转导途径。A： HMGB1和B盒对激酶活化的影响。C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬细胞（2×10⁶/用B-box或HMGB1（10µg/mL）刺激指定时间。分析细胞裂解液中的激酶（材料和方法）。所示数据代表了3个单独的实验。B： B盒对NF-κB活化的影响。将6厘米培养皿中的RAW 264.7细胞与对照培养基或含有1µg/mL B盒的培养基孵育不同时间。孵育后，制备核蛋白并进行电泳迁移率变化分析。B盒孵育增加了NF-κB DNA结合。所示结果来自重复3次的典型实验。B盒刺激的RAW 264.7细胞的核提取物通过超移分析使用³²P标记的NF-κB。在使用放射性标记探针和EMSA进行（抗体）或同时（寡核苷酸）检测前1 h，添加针对NF-κB亚单位p65或p50（2µg/mL）的IgG、100倍摩尔过量的未标记HIF-1（低氧诱导因子1）或NF-κ的B。结果代表了3个单独的实验。

讨论

HMGB1（或B盒）刺激促炎细胞因子如TNF的释放(13)并增加Caco-2上皮细胞的通透性(24)和培养内皮细胞的发炎活性(33). 气管内注射HMGB1也会引起急性肺部炎症(14)并诱导大脑中释放促炎细胞因子，并减少脑室中的食物摄入量(17). 暴露于内毒素（LPS）、TNF或IL-1β的单核细胞/巨噬细胞释放HMGB1，其动力学反应与其他细胞因子相比明显延迟(12–15). 在体内，HMGB1的循环水平在内毒素血症发病约8小时后开始显著升高，10至12小时后达到一个升高、延长的稳定期(12)，34，HY和KJT，提交）。服用HMGB1本身是致命的(14)当最晚在疾病发作后24小时给药时，HMGB1活性的抑制将动物从致命的全身炎症中拯救出来（HY和KJT，提交，34）。总之，这些研究表明HMGB1可能在更广泛的治疗窗口中成为脓毒症和其他急性全身炎症性疾病的临床治疗靶点。

本文所述研究的目的是探索HMGB1的一级氨基酸序列和细胞因子功能之间的关系，预期由此产生的结构和功能数据将有助于开发特定HMGB1拮抗剂。我们现在已经证明，B盒概括了HMGB1的炎症活性，主要炎症作用映射到全长蛋白的20个残基片段（HMGB1残基89到108）。这些结果表明，功能性促炎细胞因子结构域位于HMGB1 B盒的一级氨基酸序列中，并且B盒作为细胞因子和DNA结合蛋白向HMGB1传递双重功能(8,9). 在许多蛋白质中发现了与HMGB1 B盒同源的初级氨基酸序列(三,7,35–38); 虽然这些蛋白的功能尚不完全清楚，但有意思的是，HMGB1残基89至108或B盒结构域可能定义了一个以前未被识别的细胞因子家族。

B盒的管理d日-半乳糖胺致敏小鼠诱导了显著的致死性，独立于内毒素诱导的信号传导，这表明B盒或B盒内的序列或基序足以在全身炎症期间产生致命作用。B盒引起死亡的机制尚待阐明。然而值得注意的是，B盒诱导小鼠胃肠道粘膜屏障功能明显紊乱，并增加培养的人Caco-2肠细胞样单层的通透性(24)表明HMGB1/B盒诱导的肠道或其他器官上皮细胞功能改变可能导致致命的全身炎症。B盒介导的死亡的病理结果，包括肝细胞凋亡增加，与致死性死亡相似d日-半乳糖胺/LPS模型，与大剂量全身TNF的病理学有显著差异(39). 有趣的是，在所研究的时间段内，全身注射致死剂量的B盒并没有诱导显著的TNF释放，这表明B盒介导的致死性可能与D-氨基半乳糖致敏小鼠的TNF无关。本研究表明HMGB1在刺激巨噬细胞中起着重要作用，但未定义该途径对致死的贡献。

大量HMGB1释放到血清室中可能是致命的，但控制HMGB1的释放机制仅部分被描述(21,40). HMGB1缺乏一个经典的信号序列，可能通过巨噬细胞和血小板中非典型的内溶酶体样分泌途径释放(12,20,21). HMGB1也可以从受伤或死亡的体细胞和免疫细胞中释放出来(22). 迄今为止，没有证据表明B盒本身是作为一种孤立的内源性介质在体内产生或释放的。然而，针对B盒的中和抗体在体外可有效抑制HMGB1的细胞因子活性，并降低内毒素血症和脓毒症的致死率。因此，本文提供的数据确定了一种潜在的治疗策略，通过靶向B盒来抑制HMGB1的炎症活性。