新型冠状病毒中和抗体简便快速测定新方法的开发成功

成功开发出一种简便、快速测定新型冠状病毒中和抗体的新方法

以横滨市立大学研究生院医学研究科微生物学的梁明秀教授、宫川敬讲师为中心的共同研究小组，对新型冠状病毒（SARS-COV-2）的中和抗体^*1不使用感染性病毒，简便且迅速地能测定的新方法的开发成功了。这次开发的方法，因为不使用含有具有感染性的活病毒和基因组的疑似病毒，所以不需要危险的操作，可以在3小时内测定中和抗体的量。到现在为止对多检体的分析困难的新型冠状病毒的中和抗体的测定，简便且短时间成为可能的事被期待。

本研究成果为预打印服务器的medRxiv^*2发布地图册。（7月22日）

※拒绝：现在，向学术杂志投稿的关于COVID-19的论文被推荐在审查前登录预打印服务器并公开。根据学术杂志的审查论文内容有被修正的可能性。

※本研究成果现在Journal of Molecular Cell Biology doi: 10.1093/jmcb/mjaa047中所述修改相应参数的值。(2020.9.25)

研究成果

・新型冠状病毒感染症（COVID-19）恢复期患者血清中含有的新型冠状病毒（SARS-COV-2）感染防御抗体（中和抗体）的快速测定法“hiVNT（HiBiT-tagged Virus-like particle Neutralizing antibody Test）”确立

・HiBiT标识^*3病毒样颗粒^*4可以在3小时内检测血清中中和抗体

·由于不使用活病毒，可在BSL2水平的实验室安全且简单地测定

・可以认为有助于区分具有感染防御免疫的人的快速筛选检查、流行病学研究、疫苗评价等

研究背景

新型冠状病毒感染症（COVID-19）的感染人数在全世界超过1000万人，死亡人数超过50万人，作为世界公共卫生上的非常大的问题，要求尽快采取对策。随着流感的发展，群体中的一部分获得了感染防御免疫，因此需要明确个人免疫状态的检查。目前，在鉴定抗SARS-COV-2中和抗体（nAb）的存在时，大多采用病毒中和试验。但是，为了使用试验期间需要4~5天的低吞吐量性和实施中有感染力的活病毒，除了需要具备生物安全水平3（BSL-3）设备的特殊实验室之外，还存在多检体的分析伴随危险等问题。

为了克服这些问题，使用基因重组扳手病毒载体的中和试验作为替代方法使用，但该方法也需要至少2~3天的判断，因此快速性低，使用基因重组病毒需要特别的实验室和熟练的检查员。因此，需要开发代替上述中和试验的高通量功能性抗体检查。

研究内容

以梁明秀教授为中心的共同研究小组，构建了COVID-19恢复期患者以及不显性感染者的血清中含有的中和抗体能够定量且迅速测定的“hiVNT系统”（图1）。不使用实际的感染性病毒和基因重组病毒，使用只由病毒的壳构成的病毒样粒子（VLP），不需要特殊的实验室和设备。

图1新中和测定hiVNT系统

本研究小组开发了的hiVNT系统，表面SARS-CoV-2尖峰蛋白，与HiBiT标记了的VLP组合利用。如果侵入了稳定表达LgBiT的VeroE6/TMPRSS 2细胞，可以很容易地定量该VLP（hiVLP）。当VLP表面上的尖峰蛋白与人细胞的血管紧张素转换酶-2（ACE2）受体结合时，VLP膜和宿主细胞的膜融合，构成VLP的辣椒素蛋白被导入细胞内。于是，HiBiT和LgBiT相互作用形成NanoLuc发光酶。因此，以NanoLuc酶的发光为指标，仅仅3小时就能测定VLP的细胞侵入量。如果同时添加含有中和抗体的血清和VLP，这种发光就会减少。实际使用COVID-19的恢复期患者血清11例的验证，全部的例子NanoLuc发光显著地减少了（图2）。

图2使用患者血清的验证数据

并且hiVNT系统，能得到与以前的检查法大体同样的中和活性数据（图3）。使用这个检查法的话，可以进行对SARS-COV-2的免疫应答动态和地区感染扩散方法的多检体分析。同时，可以选择对血清疗法有贡献的恢复期患者，确认防御免疫保持等，扩大感染的风险的降低措施。

图3与现有方法的比较数据

今后的发展

本研究建立了高通量中和试验法hiVNT系统。本手法，是为了从症状性或无症状性COVID-19感染的恢复期血清中的SARS-COV-2中和抗体的迅速定量的单纯，高吞吐量分析系统。今后，本方法对具有防御免疫的个人的鉴定，关于集体感受性研究的流行病学的研究，治疗效果和疫苗评价也有用。

术语说明

*1中和抗体
具有病毒感染抑制能力的抗体。一般来说，它常常阻碍病毒和细胞的吸附和融合。

*2 medRxiv
在由冷弹簧哈佛研究所（CSHL）和医学系杂志出版社BMJ、美国耶鲁大学3家机构共同运营的医学领域的预打印服务中，接受了审阅前的医学领域的论文免费提供一个平台来快速分享和反馈新知识。

*3HiBiT标识
HiBiT system是利用11个氨基酸的肽标签（HiBiT）和与其结合的约18KDa的NanoLuc荧光素酶片段（LgBiT）和底物，通过发光法检测目标蛋白的技术。

*4病毒样颗粒
与病毒相似，但不在内部保持病毒核酸。可以通过将被称为辣椒素的病毒骨架蛋白导入细胞来制作。

刊载论文

Rapid quantitative screening assay for SARS-CoV-2 neutralizing antibodies using HiBiT-tagged virus-like particles
Kei Miyakawa, Sundararaj Stanleyraj Jeremiah, Norihisa Ohtake, Satoko Matsunaga, Yutaro Yamaoka, Mayuko Nishi, Takeshi Morita, Ryo Saji, Mototsugu Nishii, Hirokazu Kimura, Hideki Hasegawa, Ichiro Takeuchi, Akihide Ryo
medRxivpreprint doi:https://doi.org/10.1101/2020.07.20.20158410.

※本研究成果现在Journal of Molecular Cell Biology doi: 10.1093/jmcb/mjaa047中所述修改相应参数的值。(2020.9.25)

※本研究是国立研究开发法人日本医疗研究开发机构（AMED）对新兴·复兴感染症的革新性医药品等开发推进研究事业“有助于新型冠状病毒感染症（COVID-19）的诊断法开发的研究（研究代表者：国立感染症研究所感染病理部铃木忠树部长）”的支持。

刊载论文

咨询处

研究・产学联合推进课
E-mail:kenkyupr@yokohama-cu.ac.jp