Streptavidin

为了评价是否是功能性的蛋白质，很多研究者喜欢用small-scale简单地进行表达确认和纯化的方法。例如，在感兴趣的蛋白质上添加tag，导入大肠杆菌、无细胞系和培养细胞使其过度表达，注意生物素化蛋白质的提取和纯化。

 

生物素与链霉抗生物素特异性结合，是生命科学中通用的应用之一。利用这个非共价键的测定，有免疫沉降和表面等离子体共振。后者检测分子间的相互作用，评价“是结合的强度和功能性蛋白质的复合体吗”等。有进一步发展这项技术的BioID。通过利用这项技术，可以将定位在细胞和生物体内感兴趣的蛋白质附近的endogenous proteins生物素化，网罗性地分析蛋白质。最近成为新的interactome解析的手法，在各种各样的场面活跃着。

 

为了标记生物素，一般使用以特定的官能团和残基为目标的试剂。另外，利用大肠杆菌的biotin ligase，将其识别序列导入感兴趣的蛋白质中，可以对1分子蛋白质修饰1分子生物素。通过将该识别序列放置在感兴趣的蛋白质的N或C末端，可以在细胞内生成recombinant proteins，而不会妨碍本来蛋白质的功能。根据这个技术，研究人员从来自细胞的lysate包含的数万的endogenous proteins只纯化「被tag了的」recombinant proteins变得可能。

 

将Biotin-Tag添加到感兴趣的蛋白质上的好处如下所示…、

 

1、强非共价性相互作用（K_d=10^-15）。

2、不易抑制感兴趣的蛋白质的折叠和生理活性。

3、极端pH值，不易受有机溶剂或改性剂的影响。

 

我们Biotage是一款具有独特技术Dual Flow Chromatography的移液管芯片型PhyTip^®该列包含Streptavidin树脂。通过自由控制「吸引·喷出」的循环数和flow rate，探索适合生物素化蛋白质的精制的条件变得容易。Streptavidin PhyTip^®通过使用列，可以容易地实现以下3件事。

 

①Capture→Wash→Elution的各种步骤的条件研究（最优化的摸索）

②用于评价是否为功能性蛋白质的少量纯化

③通过安装在各公司的液体处理器上，使蛋白质纯化的high-throughput自动化

 

通过与凝胶过滤和离子交换色谱相结合，可以优化work-flow。成为在small-scale中处理很多样品的研究员们可靠的伙伴吧。

[示例信息]

用Streptavidin PhyTip柱纯化含有10µg生物素化白蛋白的500µL样品溶液。

缓冲区信息

• Equilibration   ; PBS
• Wash              ; PBS
• Elution            ; Phosphate buffer solution (pH2.5)
• Neutralisation ; 1M Tris (pH9.0)

[His-tagged Fab的纯化条件]

1. 1. Equilibration ; 使用平衡缓冲液，为了平衡Streptavidin PhyTip色谱柱，重复2次“吸引·喷出”循环（flow rate；500µL/min）。
   2. Capture ;为了有效地将生物素化白蛋白从样品溶液中吸附到树脂上，重复4次“吸引·喷出”循环（flow rate；500µL/min）。
   3. Wash 1 & 2 (purify) ; 使用清洗缓冲液，为了去除非特异性地与树脂结合的蛋白质和其他垃圾，反复进行2次“吸引·排出”循环（flow rate；500µL/min）。
   4. Affinity pull-down ; 2（capture cycle）从不同的样品溶液中，为了有效地将感兴趣的蛋白质与生物素化白蛋白结合，重复8次“吸引·排出”循环（flow rate；500µL/min）。
   5. Elution (enrich) ; 使用洗脱缓冲液，为了洗脱与生物素化白蛋白特异性结合的感兴趣蛋白质，反复进行4次“吸引·喷出”循环（flow rate；500µL/min）。
   6. Neutralisation ; 将中和缓冲液加入到纯化溶液的1/4量，充分混合。

[实验结果的考察]

利用Streptavidin PhyTip色谱柱，成功捕捉到80%以上的生物素化白蛋白。捕捉到的生物素化蛋白质特异性结合的蛋白质pull-down的应用程序也能适用。