IMAC

为了评价是否是功能性的蛋白质，很多研究者喜欢用small-scale简单地进行表达确认和纯化的方法。例如，在感兴趣的蛋白质上添加tag，导入大肠杆菌、无细胞系和培养细胞使其过度表达，注意His-tag蛋白质的提取和纯化。

 

在这个实验系统中，IMAC（Immobilised Metal Affinity Chromatography）特别是His-tag蛋白的亲和纯化是生命科学中通用的应用程序。

众所周知，组氨酸残基形成cluster后，显示出对金属离子的高亲和性。也就是说，让金属离子和组氨酸形成络合物，分离His-tag蛋白质。

 

经常使用的His-tag是6个相连的（6x），分子量为0.8kDa。这个tag被放置在感兴趣的蛋白质的N或C末端，作为recombinant proteins在细胞内被制作。根据这个技术，研究人员从来自细胞的lysate包含的数万的endogenous proteins只纯化「被tag了的」recombinant proteins变得可能。

 

对感兴趣的蛋白质添加His-tag的好处如下所示…、

 

1. 不制作特异性抗体，可以用市售的抗体检测靶点。
2. 由于在短序列中起作用，所以可以将tag序列导入引物中，用PCR简便地制作。
3. 不易抑制感兴趣的蛋白质的折叠和生理活性。
4. 即使在高浓度盐和改性剂的存在下也可以通过tag进行精制

我们Biotage是一款具有独特技术Dual Flow Chromatography的移液管芯片型PhyTip^®色谱柱上搭载了Ni-MIMAC亲和树脂。通过自由控制「吸引·喷出」的循环数和flow rate，探索适合His-tag蛋白质的精制的条件变得容易。IMAC PhyTip^®通过使用列，可以容易地实现以下3件事。

 

①Capture→Wash→Elution的各种步骤的条件研究（最优化的摸索）

②用于评价是否为功能性蛋白质的少量纯化

③通过安装在各公司的液体处理器上，使蛋白质纯化的high-throughput自动化

 

通过与凝胶过滤和离子交换色谱相结合，可以优化work-flow。成为在small-scale中处理很多样品的研究员们可靠的伙伴吧。

[示例信息]

用IMAC PhyTip柱纯化含有5µg His-tagged Fab和1mg BSA的样品溶液。

缓冲区信息

• Equilibration, capture & wash ; 5 mM imidazole in phosphate buffer
• Elution ;10 mM NaH₂PO₄, 0.3 M NaCl & 200 mM Imidazole (pH7.4)

[His-tagged Fab的纯化条件]

1. 1. Equilibration ; 使用平衡缓冲区，IMAC PhyTip 为了平衡色谱柱，重复2次“吸引·喷出”循环（flow rate；500µL/min）。
   2. Capture ; 为了有效地将靶从样品溶液吸附到树脂上，重复4次“吸引/排出”循环（flow rate；500µL/min）。
   3. Wash 1 & 2 (purify) ; 使用清洗缓冲液，为了去除非特异性地与树脂结合的蛋白质和其他垃圾，反复进行2次“吸引·排出”循环（flow rate；500µL/min）。更换清洗缓冲液，再重复2次同样的作业。
   4. Elution (enrich) ; 使用洗脱缓冲液，为了洗脱与树脂特异性结合的His-tagged Fab，反复进行4次“吸引·喷出”循环（flow rate；500µL/min）。

[实验结果的考察]

CBB染色的结果，可以检测出一条清晰的带。50%以上的His-tagged Fab的回收率为95%以上的纯度（参照图）。

车道1； 分子量标记
车道2-5；IMAC PhyTip柱纯化的His-tagged Fab