【vol.31】什么是分级梯度？为什么需要用那个？

September 27, 2022
Bob Bickler

我所知道的大多数使用快速色谱的化学家都使用线性梯度。这些梯度可以是常规的（在特定时间或体积下为X%到Y%），也可以是复杂的，包括多个梯度变化或同位素保持。这些复杂的梯度通常是在纯化过程中产生的，因为一般的梯度对需要纯化的化合物不能得到充分的分离。

化学家很少在快速色谱中设计和使用分步梯度。你可能会有疑问——什么是逐步梯度？

步进梯度是一种在垂直和水平隔开的单独步骤中设计的方法，如楼梯。这个台阶和台阶，短或高，短或长，不过，通过花费时间提高溶剂的强度，改善目标化合物的分离。步进梯度在天然物的研究中非常常用，模仿提取的方法。从弱溶剂（己烷）开始，切换到DCM、EtOAc、甲醇等其他溶剂，提高极性。

快速色谱的步进梯度通常不是很急剧，只是使用成对的两种溶剂来增加强度的溶剂极性变化。其理由是，由于化合物的混合物对溶出溶剂的溶解度不同，所以通过使用某个溶剂混合步骤，直到遇到更强的溶剂混合，某个化合物溶出，其他化合物不溶出（图1）。这个不管是顺相还是逆相都一样。

图1.线性梯度（上）和阶跃梯度（下）的比较。步进梯度是用圆形化合物少的溶剂实现更好的分离

步进梯度是怎么制作的呢？通常，使用以不同比例展开相同溶剂的2张TLC数据。Biotage快速色谱系统可以解释其数据并将其转换为分步梯度。

Biotage^®某些快速色谱系统，如Isolera，可将线性梯度法转化为分步梯度法，以色谱图中的特定峰或化合物为目标。在该系统中，我们将创建一个分步梯度，以便用更少的溶剂以更高的纯度分离目标（图2）。

图2。通过从线性梯度（上）变更为逐步梯度（下），目标化合物（+m/z314.8）及其后续副产物（+m/z298.6）的分离提高，溶剂消耗量减少了约30%。

步进梯度对改善合成反应和天然物的反相精制也有效。作为逐步梯度的应用例，众所周知的是从麻中提纯CBD（图3）。

这有几个原因。
1）在线性和同调法中，CBD和其他导航的分离不充分，2）步进梯度可以更有效地进行缩放，特别是在使用非梯度装置的情况下。

图3。使用70-100%乙醇/水线性梯度（上）和70-100%乙醇/水逐步梯度纯化麻。步进梯度降低了约50%的溶剂量，同时保持了比极性更高的CBD绿色峰更好的亲油性的大黄（蓝色、黄色、粉色峰）。

线性梯度可能是“简单的按钮”，但使用逐步梯度，可以在减少纯化所需溶剂量的同时最大限度地提高目标化合物的纯度。

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