本文在以下内容中提到：

介绍

虽然酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）彻底改变了慢性粒细胞白血病（CML）的治疗，一些慢性粒细胞白血病患者出现TKI耐药性(1,2)、TKI不容忍(三)或经济困境(4). 因此，仍然需要确定CML治疗的新方法。

尽管治疗方面有了巨大的进步策略，基于DNA损伤的化疗药物目前仍然存在治疗大多数白血病的首选药物。DNA损伤可诱发细胞周期阻滞和激活修复途径，这是对这些首选化疗药物的耐药机制。因此，结合DNA损伤反应（DDR）途径抑制剂基于DNA损伤的化疗是一种潜在的新策略用于治疗白血病，包括CML。

一般来说，DNA损伤通过以下途径诱导细胞周期阻滞激活细胞周期检查点，使细胞有足够的时间修复损坏。癌细胞主要依赖G2/M（M）修复因失活突变或p53缺失(5,6). 因此，我们受到启发G的重要组成部分2/M检查点待处理癌症，尤其是p53突变癌。两条主要信号通路参与DDR:ATM/检查点激酶2（CHK2）和ATR/CHK1(7——9). 研究表明，在恶性肿瘤中细胞，参与ATR/CHK1通路的成分通常是上调，而ATM/CHK2组件通常不足(10). 因此，ATR/CHK1信号通路，也参与G2/M（M）检查点是癌症治疗的潜在靶点。

CHK1是一种Ser/Thr蛋白激酶1993年在裂变酵母中发现(11). 在许多不同的癌症中，耐药性化疗和放疗与CHK1相关过度表达。CHK1被ATR磷酸化以响应DNA损伤并随后磷酸化其下游底物诱导细胞周期阻滞(12——14).随后的研究证实，G2/M（M）检查点和CHK1在S期和有丝分裂中起关键作用检查点(15,16). CHK1途径可以直接通过调节相关蛋白的表达、活性或定位(17,18).因此，CHK1是一个很有吸引力的抗癌候选基因治疗。

迄今为止，已经开发了几种CHK1抑制剂单独或与其他药物联合用药临床前或临床试验中的化疗药物(19——25).其中CCT245737((R（右）)-5-（（4-（（吗啉-2-基甲基）氨基）-5-（三氟甲基）吡啶-2-基）氨基）吡嗪-2-腈）是一种选择性CHK1抑制剂，具有口服生物利用度(26,27). 以前的研究表明CCT245737可以增强吉西他滨和卡铂治疗非小细胞肺癌（NSCLC）和B细胞淋巴瘤小鼠模型(26).然而，没有研究测试这种抑制剂对提高化疗疗效或阐明其机制通过这种抑制剂增强化疗效果CML公司。

在本研究中，CHK1被RNA抑制干扰（RNAi）或CCT245737检测K562细胞CML细胞化疗敏感性的作用。我们确认CHK1抑制显著且特异性地增强了消除K562细胞对足叶乙甙（VP16）的敏感性VP16诱导的G2/逮捕和压制人力资源效率。此外，我们还初步研究了其治疗效果CCT245737在伊马替尼处理的K562细胞中的表达，并表明该方法可能适用于慢性粒细胞白血病的TKI治疗未来。

材料和方法

细胞系

购买K562（人类CML）和293T/17细胞来自中国科学院细胞库（中国上海）；KCL22（人类CML）细胞系来自德国细胞培养物收集（德国布伦瑞克）；和CAM191（人类正常淋巴细胞）细胞购自细胞库，中国科学院（中国昆明）。K562和KCL22细胞在IMDM（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）、CAM191细胞在RPMI-1640培养基（Gibco；Thermo FisherScientific，Inc.）和293T/17细胞在DMEM（Gibco；赛默飞世尔科技公司）。所有媒体都补充了100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素和10%胎牛血清（FBS、Gibco、赛默飞世尔科技公司）。这些细胞是在37°C，含5%的湿润气氛中培养一氧化碳2并用于对数实验生长阶段。

试剂

VP16、伊马替尼和CHK1抑制剂CCT245737从Selleckchem（美国）获得并溶解在DMSO中（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）在体外研究。在shRNA-介导的CHK1敲除研究，细胞接种于105/ml，然后用5µM VP16处理4.5小时至诱导DNA双链断裂（DSB）。培养后，细胞用PBS清洗，并在IMDM中保持48小时，以便在进一步分析之前修复VP16诱导的DSB(28,29).在伊马替尼实验中，K562细胞接种于105/ml，然后用1µM伊马替尼处理24小时。培养后，用PBS和再培养24小时，然后收集细胞随后的实验。在大多数CCT245737诱导的CHK1抑制中研究，以诱导细胞和更有效地检测CCT245737在CHK1激活中的作用并在在未来更方便的临床中，用VP16（5µM）和CCT245737（500 nM）单独或组合使用密度为105/ml，持续24小时，如前所述研究(22). 在下一步之前分析，用PBS清洗细胞pSer296 CHK1（目录号2349）、pSer317 CHK1、pSer345CHK1（产品目录号2341）、CHK1总量（产品目录编号2360）、H2AX总量（产品类别。编号7631），pSer139 H2AX（目录编号9718），cleaved-PARP（目录编号。5625），总H3（分类号4499），pSer10 H3（类别号53348），pSer216 CDC25c（分类号4901），总CDK1（分类号9116），pTyr15CDK1（目录编号4539）、Rad51（目录编号8875）、Rad50（目录编号。3427）、BRCA1（目录编号9010）和GAPDH（目录编号2118）分别是从Cell Signaling Technology购买，以及针对总CDC25c（产品代码32444），MRE11（产品代码208020），Ku70（产品代码92450）、Ku80（产品代码80592）和Lig4（产品代码193353）是从Abcam购买的。

RNAi介导的基因敲除

shRNA序列GCAACAGTTATTCGGTATAAT用于敲下CHK1（shCHK1-KD），而序列GCGCTTTGTAGGATTCG与人类的任何序列无关，作为阴性对照（shRNA-NC）。pLVX-shRNA载体含有嘌呤霉素抗性盒或ZsGreen的系统（Clontech Laboratories）用于携带这些序列。在除了shRNA-NC外，空的pLVX-shRNA载体也被用作a控制（shRNA-Vector）。为了产生慢病毒颗粒这些质粒（两个包装质粒的比例为4:3:2）通过磷酸钙共转染293T/17细胞沉淀法。用10µg/ml进行病毒感染通过一个48–72小时后的荧光显微镜。阳性细胞进行分类、qPCR和western blotting检测击倒效率。靶基因敲除显著的细胞用于随后的实验。

RNA提取和qPCR

使用MiniBEST Universal提取总RNARNA提取试剂盒（Takara），通过PrimeScript RT主混音（Takara）。TB绿色预混料Ex Taq™II（Tli RNaseH Plus）试剂盒（Takara）用于检测相对mRNA通过LightCycler 96系统（Roche）和40个PCR周期进行表达热循环。引物序列如下：β-actin正向，5′-GGATTCCTATGTGGGGCGACGA−3′和反向，5′-GCGTACAGGAGAGCACAGC-3′；CHK1向前，5′-CCAGATGCTCAGAGATCTCTCCA-3′和背面，5′-TGTTCAACAACGCTCACGATTA-3′。靶基因的mRNA表达与β-actin表达相关的基因通过2-ΔΔCq方法(30).

蛋白质提取和蛋白质吸墨剂

收集细胞并在RIPA裂解缓冲液中进行裂解（Thermo Fisher Scientific，Inc.）含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Epizyme Scientific，中国）。裂解物为离心以获得蛋白质提取物进行western印迹。这个使用BCA方法（Beyotime生物技术研究所）检测蛋白质浓度。SDS-PAGE凝胶（10%凝胶）（Epizyme，中国）用于蛋白质电泳（每个样品20–40µg），以及将分离的蛋白质转移到PVDF膜上（密理博）。接下来，在5%脱脂牛奶中封闭膜室温下2小时，用TBS-T清洗3次。然后膜与特定的一级抗体在在4°C下稀释1:1000过夜。第二天清洗膜，然后在室内培养2小时HRP偶联抗兔或抗鼠次级温度稀释度为1:1000的抗体（分类号7074和7076；均来自细胞信号技术）。检测到蛋白质条带用ECL溶液培养后（赛默飞世尔科技公司）在黑暗中持续2分钟。GAPDH作为负载对照Amersham成像仪检测带强度的密度测定600（GE Healthcare）。

细胞周期分布分析

将细胞清洗两次并收集到100µl预冷PBS，用95%乙醇固定过夜温度为4°C。第二天，收集细胞并用在用FxCycle PI/RNase处理PBS之前对其进行预冷染色液（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。这个用流式细胞仪（BD）测定细胞周期分布生物科学）并由ModFit LT 3.2（Verity Software）进行分析房屋）。

碱性彗星试验

用预冷PBS和稀释至1.5×105/毫升。进行彗星试验使用CometAssay HT套件（Trevigen）。50µl细胞的等分样品（共7500个细胞）与500µl LM-Agarose和在彗星载玻片的整个样品区快速移液然后在4°C的黑暗中放置30–45分钟琼脂糖凝固，载玻片浸入冰溶溶液在黑暗中4°C下放置2小时。排出多余的缓冲液裂解后，将载玻片浸入新制备的载玻片中室温下碱性解卷溶液30分钟黑暗。载玻片放在电泳载玻片托盘中，用滑动托盘覆盖并在21 V下电泳25电泳后，用去离子水，在黑暗中浸泡在70%乙醇中10分钟，并置于干燥箱中30分钟，以去除多余的缓冲液。SYBR Gold被移液管移到每个样品上，载玻片在室温下黑暗中孵育30分钟由奥林巴斯显微镜和电荷耦合器件（CCD）收集最终放大倍数为×200的相机。尾部时刻使用彗星分析软件项目4（CASP 4；Perspective Instruments，Ltd.）作为DNA损伤的指标。

集落形成分析

K562细胞以200个细胞/孔均匀接种于24孔板。采用两层软琼脂糖试验底层为0.6%琼脂糖，顶层为0.3%琼脂酶。接种细胞后，将100µl培养基添加到每2天一口井。10天后，菌落数量和大小分析，并通过显微镜捕获代表性图像（尼康）和电荷耦合器件（CCD）相机。

CCK-8分析

将细胞接种在96周的平板中，并作为表明。然后，将10µl CCK-8试剂（Dojindo）添加到每个然后将平板在37°C的黑暗中培养2小时。使用SpectraMax微孔板检测450 nm处的吸光度读卡器（分子设备）。组合指数（CI）介于CCT245737和VP16通过Chou-Talalay方法计算CompuSync软件（美国CompuSyn公司）。

统计分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism 6.0（GraphPad-Software，Inc.）。数据表示为平均值±标准偏差。所有定量实验均为至少进行三次独立实验。安非配对双尾t检验或单因素方差分析，然后是土耳其，Dunnett T3或Dunnett博士后测试适用于确定统计显著性（*P<0.05，**P<0.01，以及***P<0.001）。使用IBM SPSS进行统计分析统计数据19.0（SPSS Inc.，美国）和GraphPad Prism 7（GraphPat软件，美国）。

结果

CHK1在K562细胞

KCL22和K562细胞系是两个最多的细胞系实验中使用的常见CML细胞系。测定CHK1 mRNA我们用CAM-191进行qPCR细胞作为对照，因为它们具有最低的CHK1 mRNA表达测试的三个细胞系（虚线）。如所示图1A，CHK1 mRNA表达为K562细胞明显高于KCL22细胞。一致地，western blot分析表明CHK1蛋白K562细胞的表达也显著高于KCL22细胞(图1B和C). 因此，选择K562细胞进行后续实验。

图1。 CHK1在K562中的表达较高细胞。（A） 与β-肌动蛋白相关的CHK1 mRNA水平（负荷控制）用qPCR、CAM-191细胞检测KCL22和K562细胞的水平作为对照组，用虚线表示。（B）KCL22和K562中CHK1蛋白水平的Western blot分析细胞。（C） CHK1表达的相对量化标准化为基于带密度分析的GAPDH表达式KCL22和K562细胞。CHK1，检查点激酶1。

shRNA-介导的CHK1击倒有效抑制细胞增殖

确定CHK1在K562细胞中的作用增殖，我们用慢病毒载体转导K562细胞含有特异性靶向CHK1（shCHK1-KD）的shRNA阴性对照序列（shRNA-NC）或空pLVX-shRNA载体（shRNA-Vector）。shCHK1 KD在mRNA和蛋白质水平(图。2A和B). 与shRNA-NC和shRNA-Vector相比，shCHK1-KD显著抑制K562细胞增殖(图2C). 因此，CHK1是一个潜在目标用于CML的治疗。

图2。 shRNA-介导的CHK1击倒有效抑制细胞增殖。（A） CHK1 mRNA水平与感染K562细胞的β-actin（负荷控制）水平相关使用三种不同的慢病毒（shVector、shNC和shKD）作为qPCR检测。（B） 进行蛋白质印迹以确认shCHK1（shKD）有效地抑制CHK1蛋白的表达在K562细胞中。（C） 通过以下方法检查不同日期的细胞活力在Chk1敲除（shKD）后进行CCK-8分析。OD450 nm值为根据时间进行测量和绘制（*P<0.05，**P<0.01）。CHK1，检查点激酶1。shKD、Chk1击倒细胞。

CHK1击倒增强了VP16对K562细胞的细胞毒性

研究沉默CHK1是否会增加VP16对K562细胞的细胞毒性，用shCHK1-KD、shRNA-NC或shRNA-Vector，然后用5µM处理VP16；然后我们分析了DSB、细胞凋亡和集落形成。第一，我们研究了磷酸化H2AX（γH2AX）的水平，这是一种蛋白质DSB标记。结果表明CHK1敲除与两个对照组相比，γH2AX水平增加，尤其是当与VP16治疗结合时(图。3A级). 随后，我们进行彗星分析并分析使用CASP的不同参数。橄榄尾矩（OTM）是用于描述细胞中DNA损伤的程度。类似于彗星实验显示CHK1在γH2AX积累中的变化轻微击倒，但不明显，OTM值增加正常生长和二甲基亚砜处理条件。然而，在VP16治疗后，CHK1敲除组表现出显著的DNA损伤增加(图3B和C类). 这些结果表明CHK1敲除可以增加VP16诱导K562细胞DNA损伤。接下来，如所示图3D，CHK1击倒没有显著增加裂解聚（ADP-核糖）的表达聚合酶（c-PARP），一种凋亡标记生长或DMSO处理条件。然而，在与VP16，CHK1敲低的细胞表达水平明显升高表明细胞凋亡水平升高。此外，我们进行了菌落形成分析，以确定CHK1在细胞增殖中的作用。CHK1静音与菌落形成能力的显著下降有关在所有条件下，无论是否存在VP16(图3E和F). 这些结果表明CHK1下调增强VP16对K562细胞。

图3。 CHK1击倒增强了VP16对K562细胞的细胞毒性。（A） 蛋白质印迹分析DSB标记γH2AX和总H2AX的表达。（B） 安碱性彗星试验是使用转导正常条件下的shVector、shNC或shCHK1（shKD）（CON）或用二甲基亚砜或VP16治疗后评估DNA水平损坏。shRNA沉默CHK1增强DNA诱导VP16造成的伤害。（C） 中尾部力矩的图形表示B中描述的碱性彗星试验（***P<0.001）。（D）裂解PARP（c-PARP）的蛋白质印迹分析，一种细胞凋亡标记。shRNA-介导的CHK1抑制显著增加VP16诱导细胞凋亡。（E） 进行菌落形成分析在感染三种不同慢病毒的K562细胞中正常情况（CON）和使用DMSO或VP16治疗后。（F）E中描述的菌落数量的图示（**P<0.01，***P<0.001）。NS，不显著；CHK1，检查点激酶1；DSB，双绞线断裂；VP16，依托泊苷。

shRNA-介导的CHK1敲除减少K562细胞G2/M阻滞与HR修复

准确及时的DNA损伤修复对于细胞在化疗诱导的DNA损伤中存活。正如我们所展示的那样CHK1敲除使K562细胞对VP16敏感，我们旨在确定CHK1基因敲除是否损害DNA损伤修复途径K562细胞。首先，我们分析了细胞周期在shRNA-NC和shCHK1-KD组发现CHK1敲除消除G2/M在两种情况下被捕，尤其是VP16处理后(图4A和B类). 与细胞周期分布结果一致，VP16治疗增加了G水平2/M逮捕标记物pS216 CDC25c和pY15 CDK1，以及shRNA-介导的CHK1敲除通过以下途径抑制pS216 CDC25c和pY15 CDK1的诱导第16版(图4C). 此外，CHK1击倒逆转了VP16诱导的有丝分裂标记pS10 H3(图4D).这些结果表明shRNA-介导的CHK1敲除减轻了化疗诱导的G2/M逮捕并强迫牢房以未修复的DNA损伤进入有丝分裂。HR和非同源端连接（NHEJ）是修复受损DNA的两条主要途径。尽管之前的研究表明，HR需要CHK1修复途径(17)，详细信息机制尚不清楚。在这里，我们检查了与NHEJ和HR相关的蛋白质，以确定哪种途径是受CHK1沉默的影响。CHK1击倒对NHEJ相关蛋白Ku70/80和连接酶4（Lig4）的表达(图4E和F). 相比之下由于VP16诱导的抑制，HR通路受损BRCA1标高，表示Rad51至DNA损伤位点。然而，shRNA-介导的CHK1消融没有对VP16介导的HR相关基因诱导的直接影响蛋白质MRE11、Rad50和Rad51(图。4G和H). 综合起来，结果表明CHK1击倒取消G2/M逮捕并减少人力资源维修效率；因此，击倒细胞被迫进入有丝分裂伴未修复的DNA损伤。

图4。 shRNA-介导的CHK1敲除减少K562细胞G2/M期阻滞与HR修复。（A） 细胞shNC或shCHK1转导K562细胞的周期分布用二甲基亚砜（对照）或VP16.（B）G2/M期统计分析百分比（%）如A所示（*P<0.05，**P<0.01）。（C） 西部G2/M阻滞标记pS216CDC25c的印迹分析，感染K562细胞的pY15CDK1和总CDC25c及CDK1正常情况下携带shVector、shNC或shCHK1（shKD）的慢病毒在DMSO或VP16存在的情况下。（D） 蛋白质印迹K562细胞有丝分裂标志物pS10-H3和总H3的分析感染携带shVector、shNC或shCHK1（shKD）的慢病毒在正常条件下，在DMSO或VP16的存在下。（E）NHEJ通路相关蛋白Ku70的Western blot分析，shVector-、shNC-或shCHK1-转导的Ku80和连接酶4（Lig4）（shKD）K562细胞在正常条件下和用DMSO或VP16。（F） Ku70（a）、Ku80（b）和密度分析显示Lig4（c）在E中的表达；目标带强度归一化为GAPDH的带强度。（G） 蛋白质印迹HR通路相关蛋白BRCA1、Rad50、MRE11和shVector-、shNC-或shCHK1-转导（shKD）K562细胞中的Rad51在正常条件下，用DMSO或VP16处理后。（H）BRCA1（a）、Rad50（b）、MRE11（c）和密度分析显示的Rad51（d）表达式（G）；乐队强度标准化为GAPDH的强度（*P<0.05）。NS，不是重要。CHK1，检测点激酶1；HR，同源重组；VP16，依托泊苷。

CCT245737有效抑制CHK1磷酸化并促进DNA损伤的积累

CCT245737是一种有效的CHK1抑制剂，口服效果良好生物利用度。如之前的研究所示(26,27),CCT245737是一种选择性CHK1抑制剂抑制浓度（IC50)1.4±0.3 nM的值和>比CHK2和CDK1高1000倍的选择性。

确认CCT245737抑制CHK1，我们首先分析了细胞中CHK1蛋白的总表达用不同浓度的CCT245737处理。如所示图5A和B，增加CCT245737的浓度并没有显著降低总浓度CHK1蛋白水平和CHK1仅在高水平时被抑制CCT245737的浓度（5µM）。然后，我们用VP16和CCT245737浓度增加联合调查CCT245737是否影响磷酸化CHK1水平。VP16明显诱导CHK1Ser296的自磷酸化和Ser317的磷酸化序列345(图5C). 在场的情况下在CCT245737中，VP16诱导的Ser296自身磷酸化在0.05µM下显著抑制，在0.5µM时完全消除微米。相反，CCT245737对其他CHK1的影响磷酸化位点（Ser317和Ser345）和总CHK1水平为最小值。同时，CHK1自身磷酸化在Ser296与γH2AX的积累相一致。因此，这些结果表明CCT245737能有效抑制通过抑制VP16诱导的CHK1激活CHK1Ser296的自动磷酸化和促进DNA积累VP16对K562细胞的损伤。

图5。 对CCT245737对VP16诱导CHK1和DNA水平变化的研究K562细胞中的损伤生物标志物。（A） 总蛋白的Western blot分析治疗后K562细胞CHK1表达增加24小时CCT245737的浓度（B）相对定量密度分析显示的CHK1总表达量（A）；乐队强度归一化为GAPDH（*P<0.05）。（C） 西部VP16（5µM）、CCT245737（5µM）或VP16与增加浓度CCT245737.Ser296处CHK1的自磷酸化和磷酸化Ser317和Ser345被用作CHK1活性的生物标志物，并且γH2AX被用作DNA损伤的生物标记物。NS，不显著。CHK1，检测点激酶1；VP16，依托泊苷。

CCT245737使K562细胞对第16版

测定CCT245737、K562的细胞毒性用增加浓度的CCT245737处理细胞24h，通过CCK-8分析测定细胞活力。我们的结果结果表明，K562细胞的活力因CCT245737呈剂量依赖性(图6A). 此外，我们证明了CCT245737和VP16对K562和伊马替尼治疗的K562细胞（K562-IM）的CI为有效剂量为50%时为0.35和0.15（ED50)作为通过Chou-Talalay分析计算(图6B和C) (31). 为了澄清这种药物组合是针对癌细胞的，我们对正常人淋巴细胞系CAM191。CCT245737弱CAM191细胞与VP16的协同作用伊马替尼处理K562细胞，在预计起飞时间50(图6D).此外，与图中所示的γH2AX积累一致图4C，彗星实验证明CCT245737明显增加了VP16诱导的DNA损伤水平(图6E和F). 此外联合治疗组c-PARP水平升高提示细胞凋亡上调(图6G). 这些数据表明CCT245737可能具有相当大和特定的协同作用VP16对K562细胞的抗癌作用伊马替尼。

图6。 CCT245737使K562细胞对VP16.（A）K562细胞存活率%的图示增加CCT245737浓度处理24天后h.（B）（a）生存率%和（B）Chou-Talalay治疗后K562细胞Fa-CI分析使用指定药物24小时（C）（a） 生存率%和（b）Chou-Talalay分析后的Fa-CI伊马替尼处理的K562（K562-IM）细胞在用指示药物24小时（D）（a）%的图示生存能力和（b）CAM191的Chou-Talalay分析后的Fa-CI用指定药物处理24小时后的细胞（E）进行碱性彗星试验以评估DNA的范围CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）持续24小时（F）E中描述的碱性彗星试验（***P<0.001）。（G） 西部K562细胞凋亡标志物裂解PARP的印迹分析用CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理24小时VP16与CCT245737联合使用可增加c-PARP水平。NS，不显著；VP16，依托泊苷；c-PARP，劈开聚（ADP-核糖）聚合酶。

CCT245737废除G2/MK562细胞HR修复能力的抑制和降低

阐明抗癌协同作用的机制在白血病细胞CCT245737和VP16之间，我们首先分析了细胞周期分布。CCT245737废除G2/M逮捕在正常条件下和急性VP16暴露后K562细胞中（5µM持续1.5小时）(图7A和B).western blot结果显示CCT245737可有效降低VP16诱导的G增加2/M逮捕标记pS216 CDC25c和pY15 CDK1(图。7摄氏度). 此外，VP16诱导有丝分裂标记物减少pS10 H3被CCT245737救出(图。第7天). 接下来，与对NHEJ和HR途径进行了研究，以阐明其潜力CCT245737增强化疗敏感性的机制。一致shRNA诱导CHK1沉默的结果表明，CCT245737没有对NHEJ相关蛋白表达有明显影响(图7E和F). 然而，与shCHK1 KD实验的结果，两种Rad51的诱导并且VP16的BRCA1被CCT245737显著抑制(图7G和H). 该结果表明CCT245737不仅降低了Rad51的本地可用性，而且也直接抑制DSB后Rad51的表达。由于上述结果中，BRCA1和Rad51被选为最重要的K562细胞CHK1相关DNA损伤修复途径相关蛋白野生型（K562-WT）细胞。因此，我们优先考虑Rad51和BRCA1伊马替尼处理的K562（K562-IM）细胞中的表达高于其他证明CCT245737抑制CHK1也可以下调K562-IM细胞的HR效率这两种蛋白的表达和类似的结果在K562-IM细胞。与K562-WT细胞相比，预处理的K562细胞使用伊马替尼后，VP16诱导的Rad51和BRCA1的表达，也许是因为这种预处理可以诱导这些细胞大量表达Rad51和BRCA1。CCT245737也明显抑制Rad51和BRCA1在伊马替尼处理K562细胞，表明CCT245737也可以有效抑制TKI处理的CML细胞的HR效率(图7I和J). 总之，这些结果表明CCT245737可以消除VP16诱导的G的激活2/M检查点，有效抑制HR修复途径，并促进具有未修复的DNA损伤进入有丝分裂。

图7。 CCT245737废除G2/M抑制并降低K562细胞的HR修复能力。（A） 的影响CCT245737（500 nM，24 h）对K562细胞的细胞周期阻滞作用急性VP16（5µM，1.5小时）。（B） 统计分析A中描述的G2/M相位百分比（%）（**P<0.01，***P<0.001）。（C） G2/M的Western blot分析逮捕标记pS216CDC25c、pY15CDK1和总CDC25c和CDK1用CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理K562细胞24 h（D）有丝分裂标记pS10-H3和CCT245737（500 nM）和/或VP16处理的K562细胞中的总H3（5µM）24小时（E）NHEJ的Western blot分析K562中的通路相关蛋白Ku70、Ku80和连接酶4（Lig4）用CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理细胞24小时。（F） Ku70（a）、Ku80（b）和Lig4（c）的相对定量带强度密度分析的表达式（E）与GAPDH标准化。（G） HR的Western blot分析K562中的路径相关蛋白BRCA1、Rad50、MRE11和Rad51用CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理细胞24小时。（H） BRCA1（a）、Rad50（b）、MRE11（c）和通过波段密度分析显示的Rad51（d）表达式（以G表示）强度归一化为GAPDH强度（*P<0.05）。（一） 西部BRCA1和Rad51蛋白表达的blot分析暴露于CCT245737（500 nM）后伊马替尼处理的K562细胞和/或VP16（5µM）24小时（J）Rad51的相对定量（a） 和BRCA1（b）表达，如密度分析所示带强度归一化为GAPDH的带强度（*P<0.05，**P＜0.01、***P＜0.001）。NS，不显著；HR，同源重组；CHK1，检测点激酶1；VP16，依托泊苷。

讨论

尽管各种化疗的发展药物大大改善了癌症治疗，仍有患者对某些疗法有抵抗力的人。由于化疗耐药中的DNA损伤反应（DDR），阻断这一途径已成为解决这一问题的新途径。检查点激酶1（CHK1），众所周知的细胞周期检查点蛋白质与DDR途径相关，尤其是在p53突变细胞，占癌细胞的很大一部分(6,32). CHK1不仅参与细胞周期调控，也包括同源重组（HR）途径通过直接或间接调节Rad51(图8). 因此，CHK1可能是理想的治疗化疗耐药癌症的候选药物。

图8。 CHK1介导的原理模型G2/M细胞周期检查点和HR的调节修复途径。BRCA1，乳腺癌基因易感性1；BARD1、，BRCA1-相关环域蛋白1；CDC25c，细胞分裂细胞周期蛋白25同源物C；CDK1，细胞周期蛋白依赖性激酶1；CHK1、，检查点激酶1；Lig4，连接酶4。

CCT245737是一种选择性CHK1抑制剂选择性是CHK2和CDK1的1000倍以上，具有口服生物利用度接近100%(26).本研究证明CCT245737抑制CHK1通过取消Ser296的自磷酸化而激活，但对Ser317和Ser345磷酸化或总CHK1的影响最小水平。由于pSer317 CHK1和pSer345 CHK1水平受以下因素的影响我们利用DNA损伤水平和PP2A磷酸酶活性pSer296 CHK1作为CHK1活性的特定生物标志物，一致之前的研究(19,33). 因此，CCT245737可以被视为候选CHK1抑制剂，以增强化疗。

在本研究中，我们首先下调CHK1shRNA在CML细胞中的表达并发现CHK1沉默显著增加DNA损伤，促进细胞凋亡，减少细胞的增殖和集落的形成。随后，CCT245737具有良好的特异性协同作用在CML细胞中与VP16的作用。为了揭示潜在的机制，我们进行了相关实验来研究CHK1对细胞周期的抑制与DNA损伤修复通路。

VP16是一种DNA拓扑异构酶II（TOP2）抑制剂可以通过以下方式诱导和稳定DNA双链断裂（DSB）在DNA连接步骤中破坏TOP2催化循环通常包括在抗癌治疗方案中(34). 之前的一项研究表明VP16介导的DSB诱导G2/通过激活G公司2/修复DNA损伤的M细胞周期检查点(35). 在我们的研究中，我们发现RNAi介导的CHK1沉默和CCT245737有效消除VP16诱导的G激活2/M细胞循环检查点，通过以下方式消除DNA修复所需的时间推翻G2/M被捕。因此，单元格可能会进入有丝分裂并累积未修复损伤。

非多孔端接（NHEJ）和HR是两种修复DSB的主要机制(36). NHEJ可能发生在整个细胞周期，而HR只发生在S/G中2阶段在DNA复制之后。在NHEJ维修中，DSB端被产生微同源性的各种内切酶或外切酶序列（<4个核苷酸）(37).然后，Ku70和Ku80异二聚体（Ku70/80）识别并结合DSB招募核酸酶、连接酶和聚合酶，如DNA连接酶四、 修复断裂。我们发现shRNA-介导的CHK1敲除或CCT245737显著影响表达Ku70/80或DNA连接酶IV，表明NHEJ修复该通路可能不受CHK1抑制的影响。

与NHEJ相反，NHEJ会引起容易出错的问题修复，HR修复是修复DNA损伤的更精确方法。一旦出现DSB，Mre11-Nbs1-Rad50（MRN）复合体将DSB末端为单链DNA（ssDNA）。随后，一个键HR途径的组成部分Rad51被招募用于复制蛋白A（RPA）包被的单链断裂（SSB）并诱导形成D型环以修复断裂。BRCA1参与了各种生物过程，包括mRNA剪接(38)，DNA损伤信号(39)和人力资源维修(40,41).BRCA1可以与BRCA1相关的环状结构域形成稳定的复合体蛋白质1（BARD1）(42)、和一个研究表明，它与Rad51共免疫沉淀(43). 最近的一份报告表明BRCA1-BARD1复合物可以直接与人Rad51相互作用，增强Rad51对DNA损伤位点的亲和力并促进D回路形成(44). 在我们的研究表明，shRNA-介导的Chk1沉默显著抑制BRCA1VP16后表达但不表达MRE11、Rad50和Rad51治疗。因此，shRNA-介导的CHK1下调可能抑制HR通过降低BRCA1诱导的Rad51定位和D回路形成，而不是直接抑制Rad51表达。然而，与shRNA-介导的CHK1抑制相反，仅抑制VP16、CCT245737诱导的BRCA1显著降低了VP16引起的Rad51和BRCA1级别。伊马替尼治疗组也有类似结果K562细胞。这些结果表明CCT245737可能阻断通过直接抑制Rad51表达和间接抑制BRCA1介导的Rad51在DNA损伤和D-loop形成。这些结果与最近的一项研究发现选择性CHK1抑制剂，抑制Rad51和BRCA1在泛素介导的三阴性乳腺癌细胞蛋白酶体降解，但RNAi仅诱导CHK1下调影响Rad51的成焦能力(45). 然而，通过CCT245737抑制CML细胞中Rad51和BRCA1的表达这些影响是否取决于药物的时间给药方式尚待后续实验确定。根据在K562-IM细胞中的CCK-8和western blot结果，我们推测伊马替尼（IM）可能会迫使K562细胞处于应激状态有助于细胞对其他物质产生更强抵抗力的状态药物刺激。因此，进行更深入的比较CCT245737和VP16的药理组合就DNA损伤修复而言，K562-WT和K562-IM细胞也会在我们未来的研究中进行调查。

除了CHK1在细胞中的关键作用外循环和DNA损伤修复途径，最近的一项研究表明CHK1抑制剂还可以触发CML中Bcr-Abl蛋白的降解(46). 这是另一个潜力靶向CHK1治疗CML的机制。

总之，CHK1对于CML疗法的发展。CHK1抑制能有效损害DSB介导的细胞周期阻滞和HR修复途径。因此，缺乏修复DNA损伤的时间和能力CHK1抑制将导致DNA损伤和增加细胞凋亡，导致增殖和菌落形成。此外，CCT245737可能是一个理想的候选CHK1抑制剂，表现出戏剧性和特异性在野生型和IM处理的K562细胞中与VP16的协同作用。这些结果为促进这一战略提供了令人信服的证据CML甚至TKI耐药CML的未来临床治疗方案。

致谢

不适用。

基金

本项工作得到了中国科学技术部（批准号：2016YFE0107200）国家重大科技专项《重大新药开发》（2018ZX09201002-005）国家自然科学基金（31471029、31671055，81461138037）和徐军专家工作站（2017IC025）。

数据和材料的可用性

当前使用和/或分析的数据集可从通讯作者处获得关于合理请求。

作者的贡献

本文的第一作者ZF设计了研究，收集样本，进行实验，分析数据并撰写手稿。HL、JZ、FW、WZ、JW、SL、，QL、YX、GW、AL和JX参与了样本收集、数据收集和分析。所有作者阅读并批准了并同意对研究确保任何部分的准确性或完整性这项工作得到了适当的调查和解决。

道德批准和同意参与

不适用。

患者同意发布

不适用。

竞争性利益

作者声明不存在竞争利益。

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