本文在以下内容中提到：

介绍

人类子宫是一个纤维肌肉器官，包括三层：子宫内膜（最内层粘膜）、子宫肌层（中间层）和子宫内膜（外层）(1). 子宫内膜是多层的，覆盖子宫肌层的可接受的动态器官胚泡植入(2).怀孕需要接受子宫之间的有效配合和上胚泡(三). 在牛和人的子宫内膜很容易感染细菌，可能导致严重的子宫疾病(4). 创伤或感染可能导致如果创伤或感染损害子宫内膜修复障碍子宫内膜基膜(5).子宫内膜过薄是导致子宫不孕，可能导致胚胎无法生长子宫内膜(6). 治疗薄子宫内膜主要包括药物治疗、刺激刮擦疗法与粒细胞宫内注射集落刺激因子(7,8).尽管有多种治疗方法总体疗效较差，导致这种情况生殖医学面临挑战。

干细胞是未分化的细胞群具有自我更新和多系分化潜能(9). 目前，干细胞用于治疗包括间充质干在内的薄子宫内膜细胞、人类胚胎干细胞、子宫内膜干细胞和脐带间充质干细胞(10–13).此外，成功修复妊娠期子宫内膜干细胞以前已有报道(14). 最近的一项研究表明子宫内膜基底层具有高增殖性、自我更新能力和干细胞的分化潜能(15). 子宫内膜干细胞被证明是治疗子宫内膜损伤引起的不孕(16). 然而，直接访问子宫内膜干细胞是一个可能引起巨大损伤的过程。在目前，大多数子宫内膜干细胞来源于子宫切除术患者的子宫内膜(17)，这意味着来源有限。一项研究表明，子宫内膜中的脱落细胞可以培养经血体外变成子宫内膜间充质干细胞，使用这种方法可能以更快的速度扩散(18). 同时，因为月经血液被认为是人类的废物，调查人员能够避免敏感的医学伦理问题。使用经血源性干细胞（MenSC）移植裸鼠子宫内膜损伤的修复之前已经对伤害进行过调查(19).

在本研究中，密度梯度离心分离MenSCs。此外建立裸鼠子宫内膜损伤模型MenSCs对子宫内膜修复作用的探讨受伤。这些数据可能为临床提供一种新的策略人类子宫内膜损伤的治疗。

材料和方法

道德声明

本研究得到了伦理委员会的批准南昌大学第一附属医院委员会（中国南昌），所有参与者提供书面通知在加入研究之前获得同意。动物实验和动物伦理委员会批准使用动物南昌市第二附属医院实验大学（中国南昌）。随后进行了动物实验已发布的准则(20)对于实验动物的保护和应用；一切努力是为了尽量减少痛苦。

培养和鉴定男性SCs

2016年3月至2017年3月，经血收集自10名健康女性志愿者（年龄20-35岁）。志愿者有规律的月经，月经周期为24-35天（平均28天），无医疗并发症。细胞将从经血中提取的血液放入PBS，用该方法分离月经血中的单核细胞400×g密度梯度离心15分钟淋巴细胞分层液温度（GE Healthcare Life英国Little Chalfont科学公司）(21). 中间层的细胞是提取，用PBS洗涤，然后去除上清液。随后，通过400×g离心获得细胞室温下保持5分钟，然后在Dulbecco’s中重新悬浮改良Eagle's medium（DMEM）/火腿F-12（目录号12634；Gibco；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技有限公司）补充10%胎牛血清（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.），混合均匀，计数并调整至适当密度(1×106细胞/ml）用于细胞培养。这些细胞是接种到DMEM高糖培养基（Hyclone；GE Healthcare美国犹他州洛根生命科学公司），含20%胎牛血清（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.），1%两性霉素B和1%用于孵化的mycillin（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。在37°C下培养72小时后，培养基为每3天更换一次。当细胞汇合达到90%时，细胞通过了。选择第三代细胞，重新悬浮在PBS中并放入2 ml Eppendorf管中(2×105单元格）。

细胞被放置在冰浴中，荧光标记的相关抗体（每个2µl）藻红蛋白-蓝蛋白5-共轭分化簇（CD）90（CD90-PE/Cy5；1:1,000; 猫。编号：ab25272；Abcam，剑桥，马萨诸塞州，美国）和异硫氰酸荧光素（FITC）共轭CD146（CD146-FITC；1:1,000; 猫。编号：ab78451；Abcam，Cambridge，MA，USA）被添加到每个试管在4°C下培养1小时。随后，细胞被在PBS中重新悬浮（20µl）。流式细胞仪和FlowJo软件版本6.1（Tree Star，Inc.，美国俄勒冈州阿什兰）用于检测表面标记物的表达以鉴定MenSCs。

腺病毒增强的绿色荧光蛋白（Ad-eGFP）转染

隔离MenSC（1×107细胞/ml）接种到六孔板中，Ad-eGFP[2×108颗粒形成单元（PFU）；最终浓度，1×108将PFU/ml]添加到每个孔中。转染24小时后，在荧光显微镜下观察MenSCs。MenSC用胰蛋白酶消化，通过以下方法检测转染率使用FlowJo软件6.1版（Tree Star，Inc.）的流式细胞术。简言之，用2.5 ml/l胰蛋白酶消化MenSC，在1000×g，室温下3分钟，然后收集到1.5 ml Eppendorf管。在此之后，DMEM/F12培养基（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）被添加到管中，以达到体积为200µl，细胞悬浮液密度调整为1×107将MenSC移植到模型小鼠子宫腔绿色荧光水平用BX53荧光显微镜（Olympus株式会社，日本东京）。

机械损伤的确定BALB/c裸鼠单侧子宫内膜模型的建立

共109只BALB/c雌性裸鼠（年龄10-12岁周；重量，17.5–20.5 g），从湖南SJA实验室购买本研究中使用了动物有限公司（中国长沙）其中79只小鼠被随机挑选并麻醉腹腔注射1%戊巴比妥钠（0.75ml/10g） ●●●●。小鼠被放置在22–24°C的温度下，湿度为45–70%，12/12小时光/暗循环，免费获取食物和水。当小鼠没有肢体反应时，将其置于仰卧位，四肢固定在手术台上无菌垫。手术区用75%酒精消毒，在顶部做了一个1.5厘米的纵向切口腹部中线的膀胱。眼钳用于抬起皮肤，用眼科剪刀剪断皮肤纵向逐层。在膀胱后部触摸双侧子宫，用直镊子夹住带子宫角的输卵管（双侧子宫角）暴露的。右子宫角切开4号针插入距离的2/3处在子宫角和子宫体之间旋转至将该区域刮4次。随后，链霉素（100 mg/ml）在切口处使用，并缝合肌肉和皮肤一层接一层。子宫内膜的机械损伤建立在右侧子宫（模型组），而左侧子宫未治疗子宫（正常组）。缝合后，护理在37°C下进行护理，以确保在2小时内恢复饲养后，第1天将3只小鼠颈部脱位处死，3和5，并且双侧子宫角暴露。子宫角在4%多聚甲醛中固定>24h，嵌入石蜡切片，厚度为4µm。这些部分是用苏木精和曙红（H&E）染色，如下所述，并使用光学显微镜观察机械损伤子宫内膜模型。

绿色荧光检测MenSC模型小鼠宫腔移植

从剩下的70只模型小鼠中，10只具有本研究使用了特定的无色素条件。MenSC细胞悬液（1×107细胞/ml；20微升）右宫腔注射10例机械损伤模型小鼠，左侧子宫腔注射等效PBS用作控制。总共5天注射后，处死小鼠，腹腔打开子宫角。随后，子宫角在室内与4%多聚甲醛孵育24小时温度，然后在4°C的20%蔗糖中脱水过夜。在此之后，组织被嵌入最佳切割温度化合物（Sakura Finetek USA，Inc.，Torrance，CA，USA）在−20°C下保持10–15分钟，然后使用冰冻切片进行切片制备仪器Cryostat（Leica Microsystems，Inc.，布法罗美国伊利诺伊州格罗夫）建立冰冻切片（10µm）。章节为然后在荧光电子显微镜下检查（放大倍数，×100）。

动物分组

在剩下的60只模型小鼠中，有30只是随机选择并注射20µl MenSC悬浮液(1×107细胞/ml）进入受损的右宫腔（MenSC组）和30只模型小鼠注射等效PBS进入右侧子宫腔（模型组）。此外30只右子宫角未受损的小鼠注射20µlMenSCs悬液进入右宫腔[阴性对照（NC）组]。所有组未经治疗的左子宫注射MenSCs或PBS并用作正常组（n＝90；n=每组30人）。治疗后，每组三只小鼠分别于第1、3和5天处死。子宫被切开切除双侧子宫组织。组织脱水酒精梯度增加，在二甲苯中清除，嵌入在石蜡中切片（4µm）并准备后续操作H&E染色，如下所述。治疗后第7天，21每组小鼠随机选择进行生育测试：雌性小鼠（3个发情周期；11–13周龄；体重，18.2–29.5 g）与相同品系雄性小鼠一起放置在笼子中（每笼一只雌鼠和一只雄鼠，位于上述笼下条件），购自湖南SJA实验动物有限公司（中国长沙）和每只小鼠的妊娠率观察组。

H&E染色

H&E染色切片用于观察子宫内膜损伤程度。切片中的石蜡用二甲苯去除，然后用从高到低的方式清洗切片酒精浓度（100酒精、95酒精、80酒精和70%酒精）和蒸馏水浸泡3分钟，苏木精染色3分钟，用自来水冲洗3次，用酒精脱水10分钟，用曙红染色，用二甲苯清洁并安装含树脂（Sigma-Aldrich；默克KGaA，德国达姆施塔特）。随后，在光学显微镜下观察切片（日本东京奥林巴斯公司）和五种不同的视觉效果每张幻灯片都对田地进行了拍照和检查。

免疫组织化学（IHC）和平均值子宫内膜厚度测量

分组后五天，分段根据前述进行选择、脱蜡和再水合然后在每片切片中添加50µl过氧化物酶封闭溶液（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）并培养10在室温下保持min以阻断内源过氧化物酶活性。用PBS冲洗后，去除PBS溶液子宫内膜切片与50µl正常非免疫细胞孵育动物血清（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）在房间内保存10分钟去除血清的温度。随后，主要抗体对抗vimentin（1:200；目录号ab92547；英国剑桥Abcam），血管内皮生长因子（VEGF；1:100；目录号ab9546；Abcam）和角蛋白（1:200；cat.no.ab8068；Abcam切片并在4°C下培养过夜。这些部分是在室温下放置1小时，用PBS清洗三次，10每个最小值。羊抗兔IgG抗体（1:1000；猫编号。ab6795；Abcam）被添加到分段中并在房间中孵化用3,3′-二氨基联苯胺处理后，温度保持2h在37°C下保持5分钟，在PBS中清洗切片用5%苏木精溶液复染（Beyotime Institute of生物技术，中国海门）在室温下放置3分钟。显影后，使用灯光对切片进行拍照显微镜（放大倍数，×400；奥林巴斯公司）对不同视野进行了分析。Image-Pro Plus 6处理软件（Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA）用于分析结果并计算平均光密度（AOD）；AOD=综合外径/测量面积。AOD越高蛋白质的表达越高。×400时的放大倍数为也用于测量子宫内膜的平均厚度。

统计分析

使用SPSS 21.0进行统计分析（美国纽约州阿蒙克市IBM公司）。枚举数据由提供百分比和χ检验2，而测量数据以平均值±标准差表示。比较两组之间进行了非配对Student t检验多组间的比较采用单向分析方差分析，然后进行Bonferroni校正。P<0.05被认为表明具有统计显著性差异。

结果

培养的月经血细胞有干细胞特性

在MenSC培养24小时后，蝌蚪显微镜下观察到多边形贴壁细胞(图1A). 72小时后更换整个培养基，去除不纯细胞。以下培养3-4天，细胞大小不均匀表现为不均匀分布的菌落生长。以下培养7天，少数多边形细胞观察到，大多数细胞明显呈梭形，富含透明的细胞质和卵圆形和交错的细胞核；此外，细胞按照非极性排列生长(图1A). 流式细胞术分析第三代细胞显示CD90-PE阳性细胞占96.2%，CD146-FITC阳性细胞占对于0.014%(图1B和C,分别），这表明造血干细胞标志物CD90与低表达间充质干细胞标记物CD146。这些结果表明培养细胞具有干细胞特性。

图1。 MenSC的培养和鉴定。（A） 不同时间点MenSC的形态学观察：左面板，24小时间隔的细胞形态（放大倍数，×100）；中间面板，72小时时的细胞形态时间间隔（放大倍数，×100）；右侧面板，细胞形态在7天的时间间隔（放大倍数，×100）。（B和C）MenSC流式细胞术检测显示（B）CD90-PE高表达CD146-FITC低表达。CD，分化簇；异硫氰酸荧光素；男性SCs，经血衍生干细胞；PE，藻红蛋白。

成功建立小鼠子宫内膜机械损伤模型

裸鼠单侧损伤模型为通过机械损伤建立，并对1进行建模，第3天和第5天，收集子宫并用H&E染色。模型组的子宫内膜组织在间隔1天，子宫内膜出现纤维化模型组在3天的时间间隔内，没有正常子宫内膜可见纤维化模型组第5天的子宫内膜；然而正常组未检测到纤维化(图2). 这些结果表明子宫内膜机械损伤模型成功已建立。

图2。 模型子宫内膜检查老鼠。从模型小鼠和第1天通过苏木精和伊红染色检查纤维化，子宫内膜损伤后3、5例；左子宫角未损坏，用作正常控件。黑色箭头表示子宫内膜纤维化。放大倍数，×100。

男性SCs生长在子宫内膜模型小鼠

转染24小时后，Ad-eGFP-MenSCs被荧光显微镜下观察，转染率达到48.5%(图3A和B).Ad-eGFP-MenSC移植到模型右侧子宫小鼠（MenSC组），模型组小鼠注射PBS；在经MenSC治疗的模型小鼠中，在子宫内膜(图3C)，其中表明MenSC能够在子宫内膜中生长裸鼠。

图3。 Ad-eGFP转染的MenSC能够在裸鼠体内生长。（A和B）MenSCs被转染Ad-eGFP和（A）在荧光显微镜下观察到的（B）阳性（绿色）细胞的数量通过流量进行量化转染后24h进行细胞分析。（C） Ad-eGFP转染将男性干细胞移植到子宫内膜的右子宫角损伤模型小鼠和子宫内膜切片在荧光显微镜；模型对照小鼠接受子宫内膜移植损伤和PBS治疗。Ad-eGFP，腺病毒增强绿色荧光蛋白；男性干细胞、经血干细胞细胞。

MenSC治疗增加子宫内膜厚度和促进子宫内膜修复

治疗后5天，IHC结果表明模型组的子宫内膜厚度为与正常组相比变薄（P<0.05；图4); 小鼠子宫内膜厚度在MenSC组中与在未经治疗的模型组，但未发现显著差异（P>0.05）。此外，MenSC的子宫内膜厚度组与正常组相比显著减少（P<0.05）；图4). 与相比NC组、Model组和MenSC组的子宫内膜厚度显著降低（P<0.05；图4). 无显著差异检测子宫内膜厚度的比较正常组和NC组（P>0.05；图。4). 这些结果表明子宫内膜厚度减少子宫内膜损伤后，这种影响可能会逆转在模型小鼠中进行MenSC治疗。

图4。 男性SCs治疗影响模型小鼠受损子宫内膜的厚度。（A）小鼠子宫内膜的免疫组织化学染色群体；放大倍数，×40。（B） 子宫内膜定量各组小鼠的厚度*与正常值相比，P<0.05。#与NC.月经干细胞、经血干细胞相比P<0.05细胞；NC，阴性对照。

男性SCs促进修复通过促进波形蛋白、VEGF和角蛋白

角蛋白在上皮细胞中表达与上皮生长相关(22). 波形蛋白主要表达于间充质细胞和内皮细胞，与基质细胞再生(22). 血管内皮生长因子与血管生成有关(23). 因此，角蛋白、波形蛋白和VEGF与子宫内膜修复相关。治疗后5天IHC结果显示波形蛋白阳性染色，VEGF和角蛋白呈棕色或棕色(图5). 无显著差异在AOD中检测到的波形蛋白、VEGF和角蛋白正常组和NC组（P>0.05）。波形蛋白、VEGF和模型组的角蛋白显著低于Normal和NC组中各自的表达水平（P<0.05）。MenSC中波形蛋白、VEGF和角蛋白的AOD与各自的未治疗模型组的表达水平（P<0.05）。这些数据表明，MenSCs可能促进子宫内膜的修复通过促进波形蛋白、VEGF的表达对模型小鼠的损伤和角蛋白。

图5。 波形蛋白、VEGF和模型小鼠子宫内膜中的角蛋白。（A）小鼠子宫内膜的免疫组织化学染色群体；放大倍数，×400。（B） 量化A部分的波形蛋白、VEGF和角蛋白*与正常相比P<0.05；#与模型相比，P<0.05。AOD，平均光密度；月经干细胞；NC，阴性对照；血管内皮生长因子。

男性SCs增加裸鼠子宫内膜损伤

生育力测试表明，未受损的婴儿每组小鼠的子宫均成功受孕（4242人中；100%;表I). 在模型组，21只右旋小鼠中有4只怀孕子宫角损伤（19.04%），而21例妊娠中有11例发生在MenSC治疗组（52.38%）与未经治疗的模型组相比显著升高（P<0.05）。结果表明，MenSC治疗可能提高受损小鼠的生育率子宫内膜。

表一。 每只小鼠的妊娠率组。

表一。

每只小鼠的妊娠率组。

生育率地位	正常（n=21）一	数控（n=21）b条	模型（n=21）b条	MenSC公司（n=21）b条
怀孕	21	21	4	11
不是怀孕	0	0	17	10
怀孕率(%)	100	100	19.04	52.38c（c）

正常组包括左子宫角来自Control和MenSC组。

b仅右子宫角。

c与模型相比，P<0.05。MenSC，月经血源性干细胞；NC，阴性对照。

讨论

良好的子宫内膜容受性，表现为子宫内膜厚度和血流，是成功怀孕(24,25).以前的研究表明子宫内膜厚度<7mm的患者减少(24,25). 虽然有几种治疗方法目前可用的薄子宫内膜治疗策略接受治疗的患者在全部(26,27). 本研究表明可以从经血中分离出MenSC并用于促进裸鼠子宫内膜病变的修复。

此前的一项研究报告称，骨髓间充质干细胞移植可用于宫内粘连综合征的治疗(28). 另一项研究表明男性SCs能够分化为子宫内膜上皮细胞(29). 以前的研究也有表明MenSCs表达阳性造血干细胞标志物CD90和阴性表达间充质干细胞标志物CD146(30,31).同样，在本研究中，从健康人中分离出MenSC女性与文化体外; 这些细胞呈干细胞高CD90表达和低CD46的细胞样特征表达式。目前，机械和热损伤是常见的建立子宫内膜损伤模型的常用方法(28,32). 然而，这些模型使用正常免疫小鼠及类似裸鼠模型的建立尚未报告。在本研究中成功构建裸鼠子宫内膜损伤模型Alawadhi的机械损伤方法等(28).

薄子宫内膜的特征是腺上皮；因此，上皮细胞的再生细胞对于改善薄子宫内膜(33). 男性SCs转染Ad-eGFP的人能够在子宫内膜中生长裸鼠。研究表明子宫内膜厚度减少子宫内膜损伤后，而MenSCs治疗增加子宫内膜厚度，促进子宫内膜修复并增加裸鼠受损子宫内膜的生育能力。这些结果与之前的研究相似，该研究表明男性SCs能够修复受损的子宫内膜并增加生育能力子宫内膜损伤小鼠(34). 此外，本研究证明经MenSC处理的模型小鼠表现出增加波形蛋白、VEGF和角蛋白的蛋白表达水平。波形蛋白是一种细胞骨架蛋白，主要表达于间充质细胞的细胞骨架和维持细胞结构的稳定性，与有丝分裂有关，分化、增殖与信号转导(35). VEGF是一种高度特异的促分裂原血管内皮细胞，是血管生成；它的表达反映了扩散的程度，血管内皮细胞的迁移与血管构建(36,37). VEGF在腺体中表达薄的和正常的上皮细胞和血管内皮细胞子宫内膜中VEGF的表达较低(38). 另一项研究表明淫羊藿苷治疗增加薄子宫内膜在血管内皮生长因子上调的大鼠内膜厚度模型中表达式(39). 角蛋白是一种上皮细胞的蛋白质标记物，起着重要作用保持上皮细胞的完整性(40). 之前的研究表明子宫内膜组织角蛋白表达增加(41). 与结果一致目前的研究，朱等(19)证明基于MenSC治疗可能是治疗AKT和p38信号调节对子宫内膜的损伤路径。

总之，本研究表明男性SCs可以从月经血中分离出来，并且能够在子宫内膜受损的裸鼠子宫内膜中存活。此外，MenSC能够改善胚胎植入可能是通过提高波形蛋白的表达水平，角蛋白和血管内皮生长因子。需要进行额外的实验来探索关联的可能分子机制MenSC与子宫内膜纤维化之间的关系。

致谢

作者想承认审稿人对手稿的修改。

基金

本研究得到了江西省政府的支持省卫生厅（批准号：20155114）。

数据和材料的可用性

当前生成的分析数据集可从通讯作者处获得关于合理请求。

作者的贡献

JH进行了动物实验，并写道并修改了手稿。BZT为实验做出了贡献设计。KYS进行细胞培养，腺病毒转染，绿色荧光检测和免疫组织化学实验。JZ公司采集月经血样并培养月经血源性干细胞。YQZ收集并分析了数据。

道德批准和同意参与

本研究得到了伦理委员会的批准南昌大学第一附属医院委员会（中国南昌），所有参与者提供书面通知在加入研究之前获得同意。动物实验和动物伦理委员会批准使用动物南昌市第二附属医院实验大学。动物实验遵循了实验动物的保护和应用；一切努力是为了尽量减少痛苦。

患者同意发布

受试者提供了知情同意书并同意本文的发表。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争对手利益。

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