本文在以下内容中提到：

介绍

皮肤暴露于紫外线辐射和环境有毒化学品，如空气污染物、重金属或臭氧，会导致氧化应激，而氧化应激反过来会加速皮肤老化过程并可直接导致疾病(1). 此外，皮肤暴露于化妆品和药品中的氧化性化学物质会导致氧化应激，导致皮肤组织和细胞损坏。氧化应激本质上是抗氧化剂无法控制的活性氧（ROS）防御系统。生理条件下细胞产生活性氧条件对维持细胞功能很重要完整性。在正常情况下，ROS不断生成通过细胞呼吸和其他代谢过程(1,2). 这些高活性分子广泛的生理功能，作为杀菌剂参与细胞增殖和分化和调节多种细胞信号路径(三). 然而外源性ROS可在皮肤细胞中诱导过度生成刺激物，如紫外线辐射或化学试剂，对蛋白质、脂质和DNA造成直接氧化损伤(2). 多种内源性细胞中存在防御机制来限制这种损伤，包括抗氧化蛋白谷胱甘肽的诱导过氧化物酶（GPx）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD），具有酶活性。细胞可以进一步合成缺乏酶活性的抗氧化剂，包括谷胱甘肽（谷胱甘肽）、维生素C和E、泛喹啉(4). 这些内源性抗氧化剂保护通过减少和中和自由基，使细胞免受自由基的侵害。正常情况下，抗氧化系统和ROS生成，但这种平衡是动态的、脆弱的。任何氧化还原导致ROS过度生产或故障的干扰皮肤细胞的抗氧化机制可能诱导或加重皮肤疾病。

叔丁基过氧化氢（tBHP）是一种有机物细胞色素P450可在细胞内代谢的过氧化物产生过氧自由基和烷氧自由基或脱毒为叔丁醇，导致细胞GSH快速氧化和耗尽。这些途径会导致细胞的氧化损伤。因此，tBHP为通常被用作细胞和实验室研究中的组织(5-7).先前的研究表明，tBHP可导致角质形成细胞在体外和体内(8,9). 因此，使用外源性氧化应激诱导剂，如tBHP，可能模拟皮肤细胞氧化应激增强的情况。

在哺乳动物细胞中，核因子红细胞2-相关因子2（Nrf2）调节抗氧化蛋白表达本身是一种氧化还原敏感转录因子(10). 在没有氧化应激的情况下，Nrf2留在细胞质中，通过与Kelch-ECH-associated protein 1（KEAP1）结合，KEAP1是介导Nrf2泛素化的Cul3/Rbx1 E3泛素连接酶和退化。Keap1能够应对细胞内的变化氧化还原条件，因为它含有多种反应性半胱氨酸残留物，其氧化导致构象变化通过改变Keap1-Nrf2破坏Nrf2蛋白酶体降解复杂。其他调节机制，例如Nrf2中的特定残基也可以稳定蛋白质，减少其随后的破坏(10). 激酶，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt、，蛋白激酶C和腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）都被认为是上游激酶介导Nrf2磷酸化(11). Nrf2型稳定导致其在细胞核中积聚，从而使其驱动目标基因的转录，包括抗氧化剂包含抗氧化反应元件（ARE）的基因。大量研究表明，Nrf2可以通过调节其与Keap1结合的途径及其范围随后的稳定。适当的法规和细胞保护细胞可能需要同时激活两种或多种这样的途径，它们共同调节细胞类型和刺激依赖性方式(12).

鉴于Nrf2对细胞保护的重要性氧化应激和活性氧在人类生理学背景，开发调节Nrf2/Keap1/ARE通路具有很高的研究兴趣(13). 研究表明，许多天然具有已知抗氧化活性的化合物主要引发这种反应通过激活Nrf2进行活动(11). Nrf2本身也与线粒体内环境平衡的调节有关，蛋白酶体活性、自噬和干细胞更新，所有这些从而有助于改善皮肤健康和恢复活力(14,15). 因此，有大量各团体开发天然衍生化合物的机会可以引发Nrf2介导的皮肤保护。

五味子乙素（Sch B）来源于传统的中草药，五味子，哪个是传统上用于治疗肝炎和心血管疾病(16). 研究已经确定那个五味子有很多好处，包括抵御包括热量在内的多种压力源的能力休克、烧伤、冻伤、在低氧环境中游泳，无菌炎症、辐射与重金属毒性(17). 作为主要活动之一成分五味子，附件B已经广泛研究其多种药理作用(18). 以前的研究有证明Sch B具有有效的抗氧化和细胞保护作用对不同类型氧化应激诱导细胞的影响肝细胞损伤(19-21)，心肌细胞(22,23)，神经细胞(24,25)，肾小管细胞(26)和滋养层细胞(27). 在大多数这些单元类型中Sch B的抗氧化作用来源于Nrf2的激活和随后抗氧化酶表达上调。几个体内研究表明，Sch B处理可以增强肝脏、心脏组织、大脑和肾脏的抗氧化活性在各种氧化应激动物模型中(18,28-35). 最近，抗氧化剂在人类皮肤细胞中测试了Sch B的能力，表明SchB可以保护BJ人成纤维细胞免受阳光照射辐射诱导的氧化损伤(36)，保护人类角质形成细胞-衍生HaCaT细胞对抗UVB诱导的氧化损伤(37,38). 然而，Sch B是否增强Nrf2激活对人皮肤细胞抗氧化防御的影响尚待阐明。

在本研究中，Sch B在研究了tBHP刺激的HaCaT细胞探讨了其作用机制。主要重点领域包括对细胞凋亡、细胞内活性氧生成、线粒体的影响功能障碍、氧化生物标志物、抗氧化酶表达以及Nrf2活化对细胞保护的要求tBHP引起的氧化损伤。

材料和方法

材料

Sch B来自自然标准生物技术有限公司（中国上海）。DMEM购买自赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素来自Gibco（ThermoFisher Scientific公司）。购买了叔丁基过氧化氢来自Sigma-Aldrich（默克公司，德国达姆施塔特）。蛋白质总蛋白提取试剂盒来自Beyotime生物化学研究所（中国江苏）。BCA试剂盒来自赛默飞世尔科技公司。

Nrf2抗体（分类号ab62352），p-Nrf2（分类号ab76026）、Keap1（分类号ab218815）、JNK（分类号。ab179461）、p-JNK（产品目录号ab124956）和GAPDH（产品目录编号ab181602）购自Abcam（英国剑桥）。抗p38抗体丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK；分类号8690），phospho-p38 MAPK（目录编号4511）、Akt（目录编号4685）、p-Akt。4060号）、Erk1/2（产品目录号4695）、p-Erk1/2（产品目录编号4370）、AMPK（目录号5832）和磷酸AMPK（目录号2535）来自Cell Signaling Technology，Inc.（美国马萨诸塞州丹弗斯），以及抗拉明B（目录号sc-6217）是从圣克鲁斯获得的生物技术公司（美国德克萨斯州达拉斯）。山羊抗鼠IgG H&L（分类号ab216772）和山羊抗兔IgG H&L（分类号。ab216773）二级抗体从Abcam购买（英国剑桥）。

细胞培养

HaCaT细胞购自上海中桥忻州生物科技有限公司（中国上海；目录号：。，ZQ0044）并在含有10%FBS和青霉素/链霉素。细胞培养在37°C下进行，5%一氧化碳2试验在70%的汇流处进行。

细胞活力测定

细胞计数试剂盒-8（CCK-8；Dojindo Laboratories，据报道，日本熊本）被用于可行性评估制造商的协议。可行性表示为%控制光密度（OD）。

细胞凋亡测定

Annexin V，FITC细胞凋亡检测试剂盒（Dojindo日本熊本实验室）用于染色细胞，根据制造商的协议。荧光是在FACS Calibur流式细胞仪（BD Biosciences，富兰克林湖，新泽西州，美国）。Annexin V-FITC阳性细胞数允许测定凋亡频率。

细胞内活性氧测量

活性氧物种检测试剂盒（Beyotime生物技术研究所）被聘请来评估活性氧的生产，根据制造商的协议。使用流式细胞仪监测生产，并使用CellQuest Pro软件（版本5.2.1；BD Biosciences）。

线粒体膜电位（MMP）评估

线粒体膜评估MMP损失JC-1潜在分析试剂盒（Beyotime Institute of生物技术）。细胞然后使用流式细胞仪进行评估。结果是使用CellQuest Pro软件（版本5.2.1；BD）进行分析生物科学）。

ATP液位测量

HaCaT细胞中的细胞间ATP水平为通过生物发光分析试剂盒进行测量（中国江苏省贝尤泰姆）基于提供的协议。ATP水平根据荧光素酶发光，归一化为总蛋白后内容。

氧化生物标志物的测量

丙二醛（MDA）含量采用脂质过氧化MDA检测试剂盒（Beyotime Institute of生物技术）。这个DNA损伤标记物8-oxo-2'-脱氧鸟苷（8-oxo-dG）的含量，使用人类8-OhdG ELISA试剂盒（AMEKO，上海，中国），根据制造商的说明。蛋白质羰基水平通过蛋白质羰基比色法测定检测试剂盒（Cayman Chemical，Ann Abort，MI，USA），根据制造商协议。

逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

从HaCaT细胞中分离出RNA使用RNA提取RNA快速的200（上海法士塔根中国上海生物科技有限公司）。逆转录cDNA合成使用高容量cDNA反向转录试剂盒（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）。基因各种抗氧化酶的表达用SYBR-Green Master混合（应用生物系统）。特异性引物如下所示：CAT前进，5′-ATTCTG GAG AAG TGC GGA GA-3′和反向，5′-CGG CAA TGT TCT CAC ACA GA-3′；HO-1正向，5′-CCAGGC AGA GAA TGC TGA GT-3′和背面，5′-CTT GTT GCG CTC AAT CTCCT-3′；SOD正向、5′-AGG CTG TAC CAG TGC AG G TC-3′和反向，5′-CAA标记ACA-CAT-CGG-CCA-CA-3′；GPx转发，5′-CCA AGC TCA TCACCT GGT CT-3′和反向，5′-TCG ATG TCA ATG GTC TGG AA-3′；和GAPDH正向，5′-CAG GAG GCA TTG CTG ATG AT-3′和反向，5′-GAAGGC TGG GGC TCA TTT-3′。热循环条件如下如下：在95°C下预变性30秒，放大40秒在95°C下变性5秒，在60°C下退火34秒秒，然后是95°C的最终解离循环15秒，60°C持续1分钟，95°C持续15秒。GAPDH用作内部标准化控制。靶基因的相对表达为由2分析-ΔΔCt方法(39).

蛋白质印迹

从中提取总蛋白和核蛋白HaCaT细胞并通过BCA分析定量。总共40个µ克蛋白质在每一条车道上装载，并在运输前用8%的SDS-PAGE分离转入0.45-µm硝化纤维素膜。膜在室温下用5%的非脂肪酸封闭1h干牛奶。在4°C下隔夜用初级探针探测膜抗Nrf2抗体（稀释，1:1000），磷酸-Nrf2（稀释，1:3000），Keap1（稀释，1:1500），JNK（稀释，1:2000）、p-JNK（稀释，1:2000），GAPDH（稀释，1:1000），Akt（稀释度，1:1000），磷-Akt（稀释度：1:1000）（稀释，1:1000），p-Erk1/2（稀释，1-1000），p38 MAPK（稀释，1:1000），磷酸化p38 MAPK（稀释，1-1000），AMPK（稀释度，1:1000）和p-AMPK。二级抗体培养随后，使用山羊抗鼠或山羊抗兔IgG H&L二级抗体（稀释，1:2000）在房间内2小时温度。奥德赛CLx红外成像系统（美国LI-COR）用于获取和分析印迹。GAPDH用作内部控制。蛋白质条带的灰度为使用ImageJ（版本1.4.3.67；美国国立卫生研究院Health，Bethesda，MD，美国）。

统计分析

GraphPad Prism（版本5.0；GraphPad-Software，Inc.，CA，USA）用于所有统计分析。单向方差分析和Dunnett检验用于平均值的比较。P<0.05表示具有统计学显著性差异。

结果

Sch B调节tBHP诱导的HaCaT细胞死亡

为了评估Sch B的保护效果对于tBHP诱导的HaCaT细胞氧化损伤，我们首先评估Sch B单独的细胞毒性作用（1、5、10、20、50和100µM） 通过CCK-8分析检测HaCaT细胞。当HaCaT细胞在<20时接受Sch B治疗µM持续24小时，电池生存能力没有下降(图。1安培)表明Sch B对HaCaT无细胞毒性小于20的单元格µM。

图1 Sch B影响tBHP诱导的毒性。（A） 指定浓度Sch下HaCaT细胞的存活率B持续24小时；（B） HaCaT细胞经6h内tBHP的指示浓度；（C） 的生存能力在指定的时间段内，HaCaT细胞处理0.4 mM tBHP；（D） 经10µM Sch B处理的HaCaT细胞的活性指定的时间段，然后用0.4 mM治疗tBHP持续6小时；（E） 用Sch B的指示浓度持续6小时，然后是0.4 mM tBHP持续6 h。数据表示为三个不同实验的平均值#P<0.05与。未经治疗的对照组和*P<0.05，而tBHP仅为对照组。Sch B，五味子苷B；tBHP，叔丁基过氧化氢。

评估HaCaT细胞对氧化的反应对tBHP处理的应激反应、生存能力进行测定。tBHP治疗（0.2-0.6 mM）6小时后，在剂量依赖型(图1B).此外，用0.4 mM tBHP处理HaCaT细胞3-12小时以时间依赖的方式进一步降低生存能力(图1C). 使用0.4 mM治疗后tBHP持续6小时可产生约50%的存活率，该剂量用于关于氧化应激的后续实验。

确定Sch B如何影响tBHP诱导的细胞毒性，用10µM Sch B用于0、3、6、9和12小时，然后依次用0.4 mM tBHP培养6小时。CCK-8分析表明，用Sch B预处理6小时对tBHP诱导的HaCaT细胞的细胞毒性(图。一维). 因此，选择了6小时的预处理时间在随后的实验中。用2.5-10处理HaCaT细胞µM Sch B在0.4 mM tBHP治疗前6小时诱导氧化应激。如所示图。1E级单独使用tBHP治疗6小时后，细胞活力然而，与不处理对照相比减少了50%以上，Sch B预处理介导细胞活力增加tBHP以剂量依赖的方式损伤细胞(图1E)表明Sch B保护了tBHP诱导的细胞死亡。我们通过以下方法进一步测量了生存能力Annexin V-FITC/PI染色。细胞死亡诱导的时间进程通过tBHP检测，发现凋亡细胞的数量Annexin V染色阳性在与未处理对照组相比，0.4 mM tBHP处理组。tBHP暴露时间增加（6-12小时）导致晚期凋亡细胞比例（附件阳性/PI阳性；图。2A和B). 评估Sch B对tBHP诱导细胞凋亡，用Sch B预处理HaCaT细胞用tBHP诱导细胞凋亡前6小时，持续3小时证明Sch B预处理导致剂量依赖性凋亡率降低，表明Sch BtBHP诱导细胞凋亡的保护作用(图2C和D). 这些加在一起实验表明，Sch B可以阻止tBHP诱导的HaCaT细胞死亡。

图2 Sch B影响tBHP诱导的细胞凋亡。（A） 流式细胞术分析0.4 mM不同时间段的tBHP，（B）量化结果表示为三个平均值的平均值±标准误差不同的实验。（C） HaCaT细胞的流式细胞术分析用指定浓度的Sch B预处理6 h，然后使用0.4 mM tBHP进行3 h。然后使用Annexin V/PI染色量化细胞凋亡。（D） 凋亡率表示为平均值±三个不同实验平均值的标准误差。#与未经治疗的对照组和*与仅tBHP对照组相比，P<0.05。Sch B，五味子苷B；tBHP，叔丁基过氧化氢；PI，碘化丙烷。

Sch B影响细胞内ROS水平tBHP损伤的HaCaT细胞

评估氧化应激在tBHP诱导的HaCaT细胞损伤，DCFH-DA荧光探针用于测量随时间变化的细胞内活性氧水平。结果表明tBHP治疗显著增加了HaCaT细胞荧光强度，指示细胞内ROS生成。2.5-10µM Sch B抑制了剂量依赖型(图。三).

图3 Sch B影响tBHP诱导的活性氧生成。HaCaT细胞用Sch B浓度持续6 h，然后使用0.4 mM tBHP持续6 h（A）然后使用DCFH-DA分析量化细胞内ROS水平。（B） 荧光强度表示为平均值±标准误差三个不同实验的平均值#P<0.05与未经治疗的对照组相比，*P<0.05与仅tBHP控件。Sch B，五味子苷B；tBHP，叔丁基过氧化氢；ROS、，活性氧物种。

Sch B影响tBHP诱导的线粒体HaCaT细胞功能障碍

氧化应激可导致线粒体功能障碍是细胞凋亡的主要原因。评估线粒体功能、线粒体膜电位（MMP）和细胞内测量ATP水平。MMP表达缺失和ATP能量供应的中断指示细胞凋亡。作为据预测，tBHP降低了MMP的表达JC-1荧光降低(图。4A和B)和ATP生产(图4C). 有趣的是，Sch B治疗挽救了tBHP损伤对MMP水平和ATP生成的影响HaCaT细胞，表明Sch B可以阻止线粒体tBHP诱导HaCaT细胞功能障碍(图4A-C).

图4 Sch B减弱tBHP诱导的线粒体功能障碍。HaCaT细胞用指示量的Sch B持续6小时，然后用0.4 mM的tBHP处理持续6h（A）JC-1染色评估MMP的丢失；（B）荧光强度表示为的平均值±标准误差三个不同实验的平均值。（C） 细胞内ATP通过生物发光法测量水平，平均值±给出了三个不同实验平均值的标准误差。#与未经治疗的对照组和*与仅tBHP对照组相比，P<0.05。Sch B，五味子苷B；tBHP，叔丁基过氧化氢；MMP，线粒体膜潜力。

Sch B影响tBHP诱导氧化HaCaT细胞中的生物分子

通过评估进一步分析氧化应激脂质、蛋白质等细胞生物分子的氧化损伤和DNA。Sch B显著降低了tBHP诱导的MDA生成HaCaT细胞，表明对这种化合物的反应(图。5A级). 羰基化蛋白质水平用于评估蛋白质氧化，结果见图5B：tBHP诱导的蛋白质氧化，而Sch B显著抑制了这种诱导。同样，基于损伤标记物8-oxo-2'-脱氧鸟苷的测量（8-氧代-dG），Sch B也显著减弱了tBHP诱导的DNA损坏(图5C). 因此，Sch B有效减轻tBHP诱导的氧化损伤HaCaT细胞中的生物分子。

图5 Sch B影响tBHP诱导氧化细胞生物分子。HaCaT细胞用指示浓度的Sch B持续6小时，然后用0.4mM处理（A）MDA、（B）蛋白羰基和（C） 测量8-oxo-dG。数据表示为平均值±三个不同实验平均值的标准误差。#与未经治疗的对照组和*与仅tBHP对照组相比，P<0.05。Sch B，五味子苷B；tBHP，叔丁基过氧化氢；丙二醛；8-oxo-dG，8-氧代-2'-脱氧鸟苷。

Sch B影响tBHP损伤HaCaT细胞中的抗氧化酶

确定Sch B是否保护HaCaT细胞免受tBHP通过诱导内源性抗氧化酶，Sch B预处理的效果抗氧化酶（包括HO-1）mRNA表达水平，在tBHP损伤的HaCaT细胞中检测SOD、GPx和CAT。我们的图1和2指示快速诱导HaCaT细胞中tBHP导致的细胞死亡以及HaCaT暴露细胞对4 mM tBHP持续3 h足以诱导显著的凋亡率增加。为了证明抗氧化酶的诱导起到保护作用Sch B的作用及其对对暴露于tBHP 2h后的抗氧化酶进行分析。如所示图6，暴露于tBHP持续2小时未显著改变HO-1、SOD或GPx在HaCaT细胞中表达，但导致其显著下降CAT的。值得注意的是，暴露tBHP前的Sch B治疗HO-1、SOD和GPx的表达显著增加tBHP的恢复降低了HaCaT细胞中CAT mRNA的水平。这些结果表明，Sch B可以通过以下途径增强抗氧化系统增加各种抗氧化酶的表达。

图6 Sch B影响tBHP损伤细胞中的抗氧化酶。HaCaT细胞用指定量的Sch B预处理6小时，然后用0.4 mM的tBHP处理2小时HO-1、SOD、CAT和GPx然后通过逆转录定量法测量表达聚合酶链反应。数据表示为平均值±三种不同实验平均值的标准误差#与未经治疗的对照组和*与仅tBHP对照组相比，P<0.05。Sch B，五味子苷B；tBHP，叔丁基过氧化氢歧化酶；HO-1，血红素加氧酶1；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶；GPx、，谷胱甘肽过氧化物酶。

Sch B对Nrf2的影响激活

由于Nrf2/Keap1/ARE路径被视为主路径抗氧化酶诱导的调控途径氧化应激，我们检查Sch B是否发挥抗氧化作用通过激活Nrf2信号通路的活性。tBHP单独导致核和总Nrf2略有下降蛋白质水平与未处理细胞相比，而Sch B处理tBHP刺激前，核和总Nrf2进一步增加与tBHP组相关的蛋白质水平呈剂量依赖性时尚(图7A和B). 这个表明Sch B处理导致Nrf2积累核移位。Sch B治疗并未改变Keap1表达水平，但确实显著增加了磷酸化Nrf2水平(图7),表明Sch B可能通过调节其磷酸化而不是作用于负调控因子。作为AMPK，Akt和MAPK（包括Erk1/2、JNK和p38）已被提议用于作为上游激酶介导磷酸化和接下来研究了Sch B如何影响AMPK，Akt和MAPK信号，以研究它们在Sch B对Nrf2的调节作用。证明了Sch BtBHP刺激后的预处理导致AMPK、Akt、Erk1/2、JNK和p38相对的磷酸化水平仅tBHP处理(图7B和C类). 这表明Sch B对Nrf2的调节作用由多种上游激酶介导，包括AMPK、Akt和MAPK（地图）。

图7 Sch B影响Nrf2激活。哈卡（HaCaT）用指定量的Sch B预处理细胞6小时，然后用0.4 mM的tBHP处理1小时（A）核Nrf2蛋白水平通过western blotting进行评估，并通过密度分析（n=3）。（B） 总Nrf2的水平，评估Keap1、Akt、AMPK和磷酸化水平通过western印迹，并通过密度分析进行定量。（C）MAPK水平（包括JNK、Erk1/2和p38）及其磷酸化水平通过western blotting和通过密度分析定量（n=3）。数据表示为三种不同的平均值的平均值±标准误差实验#与未经治疗的对照组相比，P<0.05。*与仅tBHP对照组相比，P<0.05。Sch B，五味子苷B；核因子-红细胞生成素2相关因子2；叔丁基tBHP过氧化氢歧化酶；Keap1，Kelch-ECH相关蛋白1；AMPK，单磷酸活化蛋白激酶；MAPK公司，丝裂原活化蛋白激酶；Erk，细胞外信号调节激酶；p-，磷酸化。

讨论

在本研究中，Sch B的屏蔽能力研究了tBHP诱导的细胞氧化损伤HaCaT细胞。证明Sch B显著降低tBHP诱导的细胞毒性和凋亡细胞死亡。此外，Sch B有效预防tBHP诱导的线粒体功能障碍以及HaCaT细胞中的生物分子氧化。值得注意的是，Sch B诱导Nrf2积累并促进其主要基因的转录靶向抗氧化酶，同时抑制tBHP诱导的活性氧HaCaT细胞生产过剩。这些发现表明Sch B可以通过加强其保护HaCaT细胞免受tBHP诱导的细胞损伤内源性酶抗氧化防御系统。

线粒体是细胞内主要的活性氧产生菌，但他们自己对氧化应激很敏感。氧化还原损伤可通过抑制与ATP生成相关的线粒体定位酶(2,40). 氧化破坏磷酸化直接影响呼吸链电子通量，导致MMP表达减少(41). 这可能伴随着线粒体呼吸链中电子泄漏增加，提高ROS产量。这会产生破坏性的反馈loop，可能驱动内在凋亡途径的激活(42). 线粒体功能障碍，活性氧的过度生产和细胞死亡率的增加衰老和其他人类病理过程中的重要因素(43,44). 在本研究中MMP、线粒体ATP生成减少和在HaCaT细胞中tBHP激发后观察到ROS。这些tBHP对线粒体功能障碍的负面影响是通过Sch B预处理减弱，从而干扰tBHP诱导的存活率和凋亡率降低。这些结果表明Sch B可以增强或维持线粒体功能，从而允许HaCaT细胞能够更好地抵抗tBHP诱导的氧化损伤。

活性氧会破坏蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物。在抗氧化系统减弱的情况下，氧化损伤可能导致氧化还原状态的永久改变破坏了正常的生理机能。例如，细胞膜中的脂质过氧化可破坏细胞表面或线粒体膜(45). 线粒体膜损伤turn导致细胞色素c释放和内在凋亡(46). 衍生出大量产品生物分子氧化被用作氧化生物标志物评估氧化变化。最广泛使用的生物标记物包括MDA用于脂质过氧化，羰基化蛋白质用于蛋白质DNA氧化和8-OHdG(47,48). 研究发现MDA、羰基化蛋白和8-OHdG均显著增加暴露于tBHP的HaCaT细胞中升高，表明氧化应激。用Sch B处理细胞可降低所有氧化生物标志物中，证实其有能力克服tBHP诱导的氧化损伤。

抗氧化酶，包括HO-1、SOD、GPx和CAT对保护细胞免受氧化至关重要压力源。HO-1可诱导并代谢血红素生成速率限制中的一氧化碳（CO）、胆绿素和铁时尚。这些血红素衍生物具有抗氧化作用(49). SOD、GPx和CAT负责灭活和消除超氧化物和过氧化氢(50).因此，这些抗氧化酶具有重要的细胞保护作用保护细胞免受活性氧毒性影响的药物维持相对较低的细胞内活性氧水平。目前研究表明，Sch B治疗增加了tBHP损伤的HaCaT细胞中抗氧化酶的表达，表明内源性抗氧化酶的诱导调节Sch B的保护作用，至少部分如此。

Nrf2是调节基因表达的关键转录因子抗氧化酶表达。其活动主要受监管通过与Keap1的相互作用，Keap1将Nrf2固定在细胞质中并引导其被蛋白酶体降解。Nrf2型磷酸化还通过以下途径调节Keap1的活性促进其转位到细胞核(51). 在本研究中，Sch B治疗导致总Nrf2和核Nrf2增加tBHP攻击HaCaT细胞，表明Nrf2途径是由Sch B激活，参与Sch B介导的抗氧化酶的诱导。Sch B也诱导Nrf2磷酸化而不改变Keap1的水平，这表明Sch B很可能通过调节其磷酸化。许多蛋白激酶，如PI3K/Akt，MAPK和AMPK作为调节Nrf2的上游信号氧化应激下的磷酸化(52-54). 这些激酶的磷酸化被评估为其激活的读数证明Sch B治疗显著诱导多种激酶的磷酸化，包括MAPK的3个成员（Erk1/2、JNK和p38）、Akt和AMPK，表明激活Akt、MAPK和AMPK可能参与Sch B诱导的Nrf2磷酸化及其随后的转录激活。这个与之前的研究部分一致，该研究确定MAPK信号在Sch B治疗肝细胞和心肌细胞中的作用细胞系导致Nrf2活化(19,22). 这些结果表明Sch B可以通过诱导多个上游激酶磷酸化，进而磷酸化Nrf2和促进其核移位，导致抗氧化酶。

总之，本研究表明，在人角质形成细胞衍生的HaCaT细胞中，Sch B表现出对tBHP诱导的细胞毒性和凋亡的保护能力通过防止线粒体功能障碍抑制细胞死亡细胞内活性氧的生成，减缓生物分子氧化。这些发现进一步表明Sch B通过以下途径激活Nrf2上游激酶的磷酸化，包括Akt、MAPKs（Erk1/2，JNK和p38）和AMPK，导致抗氧化酶，包括HO-1、SOD、GPx和CAT保护细胞免受氧化应激。这些结果支持使用Sch B保护皮肤免受氧化应激，以及包括皮肤老化在内的相关疾病和状况。

致谢

不适用。

基金

预置研究得到了开幕式的支持浙江省药学重点学科项目科学（批准号：YKFJ3-010）。

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据如下包含在本文中。

作者的贡献

ZH和MD构思并设计了实验。MD、FW、YC和YG进行了实验。ZH、TL、PS和GH分析了数据。ZH、SG、WD准备了手稿。ZH和MD修改了手稿。所有作者阅读并批准了最终版本手稿。

患者同意发布

不适用。

道德批准和同意参与

不适用。

竞争性利益

作者声明他们没有竞争对手利益。

工具书类