本文在以下内容中提到：

介绍

血管平滑肌细胞（VSMC）是血管壁的主要细胞成分，主要是负责调节血流分布和血液压力(1,2). 在生理条件下，VSMC保持极低的扩散率，但它们可塑，可从分化表型转化为去分化表型对环境的适应性反应更改(2–4). 在表型过程中调制，VSMC的特点是扩散和迁移，以及细胞外基质蛋白沉积加速动脉粥样硬化、高血压和糖尿病血管并发症(5,6). 越来越多的研究已经显示了包括生长因子在内的多种因素，细胞因子、有丝分裂原、细胞粘附、细胞间接触、机械影响，细胞外基质相互作用可能控制VSMC的表型调控(7). 在糖尿病患者中，积累证据已经证明先进的生产和积累糖基化终产物（AGEs）在调节血管平滑肌细胞的增殖和迁移(8–11),表明AGEs是各种血管中的重要介质疾病，尤其是糖尿病血管并发症。

AGEs由缓慢的非酶糖基化引起糖和蛋白质中的胺基之间的反应，脂质或DNA，可在糖尿病患者中形成和积聚(12). AGE形成可以激活受体（RAGE），进而导致包括核因子κB（NF-κB）在内的多种信号通路(11)，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）(12)和PI3K/AKT(13). 我们之前的研究也表明AGEs可以促进增殖并抑制通过减少VSMCs中的组织蛋白酶D实现自噬(14). 值得注意的是，有几种途径是通过增加活性氧（ROS）(14–17)表明氧化应激可能是扩散和AGEs诱导的VSMC迁移。然而，潜在的机制如此复杂，仍有很多工作要做探索。

Bcl-2-相关athanogene 3（BAG3）是BAG家族，在多种细胞中发挥重要作用包括细胞凋亡、自噬、增殖、，粘附、迁移和分化(18–20). 正如之前的研究总结，BAG3的表达可能在多种人类中上调原发性肿瘤(21). 正常除心肌细胞和骨骼外，组织很少表达BAG3肌肉细胞，但其表达是在暴露于各种压力刺激(22).近年来，越来越多的证据表明，BAG3也是与心肌等多种心血管疾病相关肥厚、扩张型心肌病、Takotsubo心肌病和慢性心力衰竭(23–26). 迄今为止，BAG3在VSMCs的增殖和迁移尚未被探索。

因此，本研究旨在研究ROS在AGE诱导的增殖和VSMC的迁移以及BAG3是否参与该过程。

材料和方法

道德声明

本研究中使用的动物在符合NIH实验室护理和使用指南动物。程序符合道德规范中国动物实验委员会标准医科大学（项目识别码，SCXK-2013-0001）。

材料

实时聚合酶链反应（qPCR）该系统是从Applied Biosystems（加利福尼亚州福斯特市，美国）。Click iT Nascent RNA捕获试剂盒购自Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。蛋白质印迹分析相关设备是从Invitrogen购买的。EdU Alexa Fluor 555公司成像套件从Invitrogen购买。丹明甲酯（TMRE）购自Molecular Probes（Eugene，俄勒冈州，美国）。2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），N个-乙酰半胱氨酸（NAC）、环己酰亚胺（CHX）和放线菌素D从Sigma（美国密苏里州圣路易斯）购买。BSA和AGEs-BSA从Merck-Millipore（德国达姆施塔特）获得。A类荧光显微镜（CKX41-F32FL）购自奥林巴斯（日本东京）。Microchemi 4.2购自DNR Bio-ImagingSystems，Ltd.（以色列耶路撒冷）。Transwell相关设备(8-µm孔）从BD Biosciences（Franklin）购买Lakes，NJ，USA）。Microplate阅读器购自Bio-Read（Hercules，加利福尼亚州，美国）。BAG3抗体（sc-292154）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH；sc-47724）购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（加利福尼亚州圣克鲁斯，美国）。慢病毒载体购自GeneChem（上海，中国）。

原代大鼠的分离培养车辆安全监控中心

新生大鼠（1-2天大）由颈椎脱位，用75%酒精消毒，然后移动坐在干净的长凳上。切除胸主动脉去除血管的内外层。初级新生儿然后按照我们之前的研究所述分离大鼠VSMCs(14). VSMC培养于包括10%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素（100 U/ml-100µg/ml）在37°C时，5%一氧化碳2以及之前描述的增湿大气(14,27). 媒体每隔一天更换一次。在原代细胞达到80–90%的融合后，0.25%的胰蛋白酶加入培养皿中消化。30秒后，用含血清培养基终止消化。随后，将部分细胞移到新的培养基中盘子。细胞贴壁后，用完全培养基，即VSMC第2代。使用这些方法，获得第2代至第8代之间的细胞，并应用于接下来的实验。

BAG3质粒和细胞的构建转染

BAG3质粒的构建由GeneChem发布。细胞被脂质体2000转染试剂（Invitrogen）如前所述(28). 慢病毒质粒含有针对大鼠BAG3或对照的短发夹RNA（shRNA）shRNA用绿色荧光蛋白（GFP）标记并使用在击倒实验中。有五个shRNA大鼠BAG3特异性寡核苷酸，即shBAG3#1、#2、#3、#4和#5。对照shRNA和shBAG3#1、#2、#3、#4和#5的滴度是8×108, 4×108, 4×108,3×108, 3×108和4×108时间单位/ml，分别是。将细胞接种到6孔板中并孵育载体上清液的多重感染（MOI）100培养12小时，然后去除旧培养基并更换用含10%FBS的DMEM培养2天后在荧光显微镜和转导下观察到使用以下公式计算效率：转导效率=GFP+单元格/总单元格。消化后，转导的细胞再培养2天。为了确认这一点转导成功，mRNA和蛋白表达用定量PCR（qPCR）和western分别进行印迹分析。

蛋白质印迹分析

Western blot分析如我们之前的研究(14,29).简单地说，细胞在放射免疫沉淀中溶解测定（RIPA）裂解缓冲液30分钟，然后测定总蛋白用BCA蛋白检测试剂盒（Beyotime，中国上海）。样品经热变性后在12或14%甘氨酸梯度凝胶上进行分析，然后转移到PVDF膜中，并用5%脱脂牛奶封闭室温下三缓冲溶液（TBS）1.5小时。这个将膜与一级抗体在4°C下孵育过夜。用TBS洗涤三次后，培养膜二级抗体在室温下作用1.5小时。在洗涤步骤，免疫反应结合检测增强化学发光（ECL）（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，美国）。使用ImageJ 1.47软件量化带强度GAPDH作为对照。

3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）化验

MTT法测定细胞活力。VSMC以96-well板的密度播种4×10三细胞/孔。培养48小时后用MTT溶液培养细胞（最终浓度，5mg/ml）在37°C下持续4小时。然后含MTT的培养基为删除并替换为100µl二甲基亚砜。然后盘子是在线性和轨道振动筛上轻轻旋转5分钟完全溶解沉淀。吸光度用570nm波长的微孔板阅读器。百分比根据以下公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=治疗组的光密度（OD）/OD对照组×100%。

EdU合并分析

如我们之前的研究所述(14,30)并根据制造商的说明，血管平滑肌细胞的DNA合成速率由EdU测定使用Click-iT™EdU Alexa Fluor 555 Imaging进行合并分析配套元件。简单地说，用EdU标记溶液培养细胞37°C下放置8h，然后用4%冷甲醛固定30室温下的最小值。用1%Triton®声波风廓线仪渗透后X-100，细胞与Click-iT反应鸡尾酒反应（Invitrogen）培养30分钟。随后细胞用Hoechst 33258染色30分钟。最后，使用ImageJ 1.47软件和归一化为Hoechst染色细胞总数。至少每个实验中计数500个细胞，EdU阳性细胞表示为占总单元格的百分比。

伤口愈合试验

80-90%汇合处的细胞受到200-µl移液管尖端，与BSA或AGEs孵育24小时。拍摄了划痕前缘的多个视图在显微镜下0和24小时进行实验三次独立进行。

Transwell迁移分析

对于Transwell迁移测定，接种细胞密度为2×106上部腔室中的细胞。这个下腔充满BSA或AGEs。经过培养24小时，轻轻取出上腔细胞用棉签擦伤，下室的细胞固定并用Hoechst 33258染色。三个实验是独立执行。穿过滤光片在荧光显微镜下拍摄紫外线。五个代表性的Hoechst标记细胞使用ImageJ 1.47软件计算显微视野。

RNA提取和qPCR

使用Qiagen RNeasy提取总RNA迷你套件。浓度测定后，合成cDNA的表达。使用我们合成的引物设计软件每个片段的正反义引物：BAG3正反义，5′-CATCCAGGAGTCTGAAAGTG-3′和反义引物，5′-TCTGAACCTTCCTGACACCG-3′；GAPDH意义，5′-GCACCTGTCAGAGAAC-3′和反义引物5′-TGTGAAGCGCCAGTGGA-3′。运行qPCR并使用7500 Real-Time-PCR系统进行分析。结果是根据GAPDH标准化，表示为任意单位。

新生RNA的标记和捕获

使用Click-iT Nascent RNA捕获试剂盒检测根据制造商的说明，新合成的RNA。5-乙基尿苷（EU）是一种炔修饰尿苷类似物有效且自然地并入新生RNA。细胞在0.2 mM EU中孵育4小时，总RNA标记为使用Trizol试剂（Invitrogen）分离EU。然后标记为EURNA在具有0.5mM的Click-iT反应缓冲液中被生物素化生物素叠氮化物，随后被链霉亲和素磁性物质捕获珠。

线粒体膜的测量潜在的

我们使用TMRE（Ex/Em，549/573 nm）检测变化线粒体膜电位，如我们之前所述研究(31). 简短、不固定活细胞在黑暗中与100 nM TMRE孵育30分钟37°C，5%CO2.清洗后，细胞在荧光显微镜下分析。荧光用ImageJ定量TMRE染色强度。

细胞内活性氧的测定

细胞内ROS的形成用DCFH-DA（Ex/Em，485/530 nm）方法，如我们的以前的研究(31). DCFH-DA公司转化为荧光化合物二氯荧光素（DCF）活性氧氧化后。简单地说，细胞是用DCFH-DA最终浓度为5 mM，37°C，5%一氧化碳2在黑暗中放置40分钟。清洗后细胞在荧光显微镜下进行分析。这个DCFH-DA染色的荧光强度用图像J。

统计分析

数据来自至少三个人实验。连续变量表示为平均值±SD并通过单因素方差分析或学生t检验进行测试。所有的使用SPSS统计数据进行统计分析Windows（版本17.0；SPSS，美国伊利诺伊州芝加哥）和p值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

AGEs增加BAG3的表达原代大鼠VSMC

用不同浓度处理细胞AGE（25、50、100和200µg/ml）和BSA（2.5、5、10和20µg/ml）分别作用24小时。我们发现AGEs增加BAG3 mRNA(图1A)和蛋白质(图1B)表达式使用qPCR和western blot以剂量依赖性方式在VSMC中分别进行分析。接下来，我们讨论了转录和翻译抑制剂（分别为放线菌素D和CHX）可以调节AGEs对BAG3表达的影响VSMC。qPCR结果显示放线菌素D显著降低AGEs诱导的BAG3 mRNA表达，而CHX无影响(图1C)，其中表明AGEs主要通过以下途径增加BAG3 mRNA的表达增加RNA合成而不是抑制RNA翻译。接下来，为了进一步支持这些观察结果，我们使用Click-iT评估AGEs对BAG3 mRNA表达的影响新生RNA捕获试剂盒，用于分离新合成的RNAqPCR结果表明，AGEs显著增加BAG324小时mRNA合成浓度为100µ克/毫升(图1D). 然后，培养细胞用活性霉素D和100µg/ml AGEs或10µ克/毫升不同时间（0、1、2、4、8和24小时）的BSA。我们发现AGEs增加BAG3新生mRNA的表达时间相关方式(图1E).因此，在下一个实验中，我们使用了剂量（100µg/ml AGEs/10µg/ml BSA）和测定时间（24小时）AGE诱导增殖和迁移的分子机制VSMC。

图1 高级糖基化终产物（AGEs）增加Bcl-2相关athanogene 3的表达（BAG3）在原代培养大鼠血管平滑肌细胞中的表达（VSMC）。用不同浓度的AGEs处理细胞（25、50、100和200µg/ml）和BSA（2.5、5、10和20µg/ml）。mRNA和蛋白质表达水平通过（A）RT-PCR和（B）western blotting，分别是。（C） 放线菌素D（10µg/ml），a转录抑制剂和环己酰亚胺（CHX）（20μg/ml），一种翻译抑制剂，用于研究AGEs对BAG3 mRNA表达的影响。（D） Click-iT初创RNA捕获试剂盒用于标记和分离新合成的RNA。（E） 用10µg/ml放线菌素D培养细胞和100µg/ml AGEs或10µg/ml BSA时间（0、1、2、4、8和24小时），然后检测采用RT-PCR检测BAG3。实验重复了三次具有可重复结果的时间*比较p<0.05使用控件。

BAG3促进原代大鼠VSMC

进一步调查BAG3参与VSMC增殖，我们生成了包含shRNAs对抗BAG3（shBAG3）以敲低BAG3在VSMC。GFP的测量+荧光下的细胞显微镜显示，通过100 MOI时的慢病毒载体为80-90%(图2A). qPCR结果(图2B)和western blot分析(图2C)证明了两个shRNAs（shBAG3#3和shBAG3#5）显著降低mRNA和BAG3在VSMC中的蛋白表达。重要的是，MTT分析结果(图2D)和EdU染色(图2E和F)一致证明BAG3的强制敲除显著降低细胞活力和增殖VSMC。

图2 Bcl-2相关的影响athanogene 3（BAG3）对大鼠原代血管增殖的影响平滑肌细胞（VSMC）。（A） 我们产生了慢病毒载体含有针对BAG3（shBAG3）的shRNAs以击倒BAG3在VSMC中表达。BAG3的mRNA和蛋白表达水平分别用（B）RT-PCR和（C）western blotting检测。*与对照组相比p<0.05。（D） 细胞活力由确定3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）化验。通过（E）EdU染色和（F） EdU掺入量计算为EdU+细胞/总数细胞，通过ImageJ量化。实验重复了三次具有可重复结果的时间*比较p<0.05使用控件。

AGEs促进原代细胞增殖通过BAG3的大鼠VSMC

调查BAG3在AGEs和含有shRNA的VSMC诱导的VSMC增殖对照BAG3用100µg/ml AGEs或10µg/ml BSA 24小时。MTT分析结果(图3A)和EdU染色(图3B)证明BAG3击倒可以显著减少由老年人。

图3 高级糖基化终产物（AGEs）促进原代大鼠血管平滑肌的增殖肌肉细胞（VSMC）通过Bcl-2-相关athanogene 3（BAG3）。用针对BAG3的shRNA转染的VSMCs（shBAG3）被处理使用100µg/ml AGEs或10µg/ml BSA 24小时（A）MTT法测定细胞活力。（B） 细胞增殖通过EdU染色测定，计算EdU掺入量作为EdU+细胞/总细胞，由ImageJ量化。这个实验重复三次，结果可重复。*与对照组比较p<0.05；#与craft+AGEs组相比，p<0.05。

AGEs促进原代大鼠迁移通过BAG3的VSMC

细胞用100µg/ml AGEs或10µg/ml BSA持续24小时。伤口愈合试验显示AGEs与之相比，VSMC的迁移显著增加在对照组中记录(图4A).Transwell分析表明侵袭细胞的数量AGE治疗组显著高于在对照组中(图4B和C类). 然后我们继续调查潜在的牵连BAG3在VSMC迁移中的作用。伤口愈合的结果化验，化验(图4D)和Transwell化验，化验(图4E)证明了BAG3基因敲除显著降低了VSMC。

图4 高级糖基化终产物（AGEs）促进大鼠原代血管平滑肌的迁移细胞（VSMC）通过Bcl-2-相关的athanogene 3（BAG3）。VSMC是用100μg/ml AGEs或10μg/ml BSA处理24小时。（A） 通过伤口愈合试验检测细胞迁移和（B）Transwell分析。（C） 迁移细胞通过ImageJ进行定量。然后转染针对BAG3的shRNA的VSMCs的迁移（shBAG3）通过（D）伤口愈合试验和（E）Transwell检测化验。实验重复三次，重复性好结果*与对照组相比p<0.05。

敲除BAG3可减少氧化应激和维持线粒体膜电位车辆安全监控中心

DCHF-DA检测结果表明BAG3敲除明显减少了VSMC中的ROS生成(图5A和B). ROS主要线粒体呼吸链复合物的结果线粒体(32). 然后我们研究了BAG3对线粒体的潜在影响TMRE结果显示，BAG3基因敲除逆转了AGEs诱导的线粒体膜电位(图5C和D).

图5 Bcl-2相关athanogene的作用3（BAG3）对氧化应激和线粒体膜的影响血管平滑肌细胞（VSMC）的潜能。（A） 细胞用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）标记（Ex/Em，485/530 nm）检测活性氧物种（ROS）和用荧光显微镜分析（标尺，20µm）。（B） 定量DCFH-DA染色的荧光强度使用ImageJ，由加扰组规范化，*与打乱组相比p<0.05。（C） 线粒体用四甲基罗丹明甲酯（TMRE）（Ex/Em，549/573nm）检测线粒体膜电位并进行分析荧光显微镜（比例尺，20µm）。（D） TMRE染色的荧光强度用图像J，由干扰组归一化，*p<0.05 vs。加扰组#与打乱相比p<0.05+晚期糖基化终产物（AGE）组。

AGEs促进增殖和氧化应激对原代大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响

活性氧，如超氧阴离子和氢过氧化物在调节增殖和VSMC的迁移。我们测试了以下假设：AGEs对VSMC增殖和迁移的影响ROS生产。接下来，我们使用NAC，一种强效抗氧化剂研究氧化应激对VSMC的潜在影响。细胞与100µg/ml NAC和100µ克/毫升AGEs或10µg/ml BSA持续24小时。DCFH-DA的结果检测表明NAC可以完全阻止其生成AGE刺激后细胞内ROS水平的变化(图6A和B). 此外，结果EdU染色(图6C和D类)和MTT分析(图6E)持续证明NAC显著降低了AGEs诱导的VSMC增殖。伤口的结果治愈(图6F)和Transwell化验(图6G和H)持续证明NAC显著降低了AGEs诱导的VSMC迁移。总体而言，我们的结果表明细胞内活性氧的生成在AGE诱导VSMC增殖和迁移。

图6 晚期糖基化终产物（AGEs）促进血管平滑肌的增殖和迁移肌肉细胞（VSMC）通过氧化应激。培养细胞含100µg/ml N-乙酰半胱氨酸（NAC）和100μg/ml AGEs或10μg/ml BSA 24小时（A）反应DCHF-DA法检测氧物种（ROS）。（B） 2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯的荧光强度（DCFH-DA）染色用ImageJ定量，通过加扰组。（C和D）EdU检测细胞增殖分析*比较p<0.05和p<0.05与BSA组。（E） 通过以下方法检测细胞活力3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）化验。通过（F）伤口愈合试验和（G和H）Transwell分析。实验重复了三次具有可重复结果的时间*比较p<0.05使用BSA控件。

讨论

本研究证明了BAG3的新作用在调节由年龄。我们发现AGEs促进了增殖和迁移通过上调BAG3表达，ROS在其中发挥作用一个重要的角色。

体内，AGEs在高血糖中缓慢形成环境和老化期间，并在多种糖尿病的微血管和大血管并发症(13). 积累的证据表明AGEs促进VSMC的增殖和迁移加速经皮动脉硬化和再狭窄冠状动脉介入治疗(9,33,34). 我们的结果与这些先前的研究。AGEs与其相互作用受体RAGE在AGE诱导的细胞损伤中起着重要作用。众所周知，RAGE的过度表达是由AGEs参与血管功能障碍并导致细胞凋亡、氧化压力和炎症反应(35). 越来越多的证据这表明AGE-RAGE与正反馈回路的相互作用与VSMC功能障碍有关(10,36–38). 之前的一项研究发现，100µg/ml AGEs通过RAGE/氧化应激途径(38). 在血管形成过程中钙化、VSMC的增殖和迁移关键角色。基于这些先前的研究，本研究继续探索强调促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移。我们发现AGEs显著促进BAG3的表达和BAG3减少了由年龄。

BAG3在一系列细胞包括细胞增殖、迁移、凋亡、，自噬、粘附与细胞周期进展(18–20,39). 一些证据表明BAG3在各种肿瘤中的表达升高，包括胶质母细胞瘤、急性淋巴细胞白血病和前列腺癌(40–42). 然而，正常组织很少表达BAG3，心肌细胞和骨骼肌细胞除外(22). BAG3的表达可以被多种刺激诱导，如早期生长应答基因-1（Egr-1）(43),热冲击系数-1（HSF-1）(44)，蛋白酶体抑制剂(45)重金属以及热应激(46,47). BAG3在正常情况下很少表达组织，但其表达是在暴露于各种压力刺激，似乎是一种保护机制(22). 以前的研究表明BAG3参与各种心血管疾病，如心肌肥厚，扩张型心肌病、Takotsubo型心肌病和慢性心脏故障(23–26). 然而BAG3的表达与血管平滑肌细胞的增殖和迁移目前尚不清楚。

这项研究首次发现了AGEs和表明shBAG3可以减少增殖和AGEs诱导的VSMC迁移。据我们所知，水流关于AGE和BAG3的数据很少。然而，这是合理的推测未折叠蛋白反应（UPR）是调解人。内质网（ER）负责翻译后修饰、折叠和贩卖大约三分之一的细胞蛋白质(48). 生理条件下，ER可以在折叠和错误折叠的蛋白质之间保持平衡。然而，当未折叠/错误折叠的蛋白质积累损害内质网时体内平衡，内质网应激发生，可能进一步激活UPR(48). 总结如下(49)，AGEs在不同的细胞类型包括内皮细胞、神经细胞、胰腺细胞和足细胞，表明这种串扰是一种潜在的病理学导致代谢性疾病的机制。同时，BAG3作为一种分子伴侣，在蛋白质中起着重要作用质量控制，可以检测错误折叠的蛋白质并指导它们到蛋白质降解系统(50). 因此，增加的表达BAG3似乎可以防止细胞在极端刺激下死亡。然而，AGEs诱导VSMC中的BAG3需要进一步调查。

此外，我们的数据表明shBAG3减少VSMC和ROS的增殖和迁移生产；NAC减少ROS生成的同时也抑制了VSMC的增殖和迁移。这些结果表明BAG3是ROS的调节器。之前的研究(51)发现BAG3过表达显著降低脂质过氧化产物MDA含量，但增加SOD和GSH-Px活性（两种重要的抗氧化酶）缺氧/复氧损伤后的心肌细胞，这表明BAG3在减少心肌细胞。这两项研究之间的差异表明BAG3调节ROS的机制可能不同于不同的细胞类型和是由于各种信号通路。在VSMC、ROS主要由NOX活性和线粒体产生氧化呼吸过程中的呼吸电子传递链(32). 活性氧包括超氧化物阴离子、羟基自由基和过氧化氢，它们是氧化应激的破坏性特征(17). 先前的研究表明活性氧通过调节参与各种血管细胞信号传导氧化还原敏感的转录和转导途径(52). 此外，越来越多的证据已经证明ROS积累在血管平滑肌细胞的增殖和迁移(15–17). 因此，减少ROS生成可能是预防血管形成过程中血管平滑肌细胞的增殖和迁移糖尿病并发症。

总之，本研究证明AGEs首次增加ROS产量并促进上调BAG3促进VSMC增殖和迁移表达。这项研究表明，BAG3是预防和/或治疗糖尿病。

致谢

这项研究得到了国家自然科学基金会的支持中国科学基金（批准号81470417和81670231）。

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