本文在以下内容中提到：

介绍

甲状腺癌占所有恶性肿瘤的2%疾病病例和近90%的神经内分泌癌病例是最常见的内分泌恶性肿瘤(1,2).乳头状甲状腺癌（PTC）是最常见的甲状腺恶性肿瘤，过去三年发病率增长较快几十年(三,4). PTC患者的生存率被认为是相对有利的甲状腺切除术及左旋甲状腺素和放射性治疗碘(5). 然而，10–15%的PTC患者出现复发和远处转移(6,7). 因此，需要改进PTC的治疗策略。先前的研究表明PTC发病机制中的遗传学，包括激活癌基因与抑癌基因的沉默(8,9).然而，需要更多的努力来识别可能参与PTC的开发潜在的治疗靶点。

微RNA（miRNAs）是一系列小的非编码基因RNA，长度为19–25个核苷酸(10)，调节转录后与3′-非翻译区（3′-UTR）结合的基因表达目标mRNA的(11). miRNAs服务细胞增殖、凋亡和其他生物学中的关键功能癌症过程(12). 异常miRNAs的表达和失调在胰腺癌患者以及癌细胞行(8,13–15),表明miRNA谱作为癌症的潜在价值生物标记物和新药开发。

miRNA（miR）-150因其正常造血的关键调节作用(16). 然而，近年来，研究人员已经证明miR-150与各种类型的血液学密切相关恶性肿瘤(17)和实体瘤(18). miR-150可能作为癌细胞或肿瘤抑制物，取决于靶向mRNA(17). 斯里瓦斯塔瓦等(19)观察到miR-150下调恶性胰腺组织和miR-150的作用PC中粘蛋白（MUC）4的调节和肿瘤抑制作者假设恢复miR-150水平可能是吴氏囊炎的治疗价值等(20)发现miR-150加速了通过下调促凋亡基因来传播胃癌，早期生长反应2。此外，王先生等(21)强调了一个新的功能细胞周期素依赖性激酶3（CDK3）与成肌细胞增殖和证实CDK3是进一步增强肿瘤的关键靶点miR-150的抑制功能。然而miR-150及其在PTC中的直接靶点尚不明确。

基于以前的报告(19–21)，它假设miR-150可能在与PTC细胞的生物学功能相关。因此，在本研究中，miR-150表达谱为通过反向评估PTC组织和细胞系转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和西方印迹法。通过生物信息学分析miR-150的靶点被确定，结果进一步荧光素酶报告分析证实。细胞活力，迁移并对PTC细胞系的侵袭率进行了研究。

材料和方法

细胞系和甲状腺组织试样

人PTC细胞系TPC-1与正常甲状腺Nthy-ori 3-1细胞系购自（Sigma-Aldrich；默克德国达姆施塔特KGaA）。对细胞进行培养和维持在RPMI-1640介质中（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc。，Waltham，MA，USA），含10%胎牛血清（FBS；Gibco；ThermoFisher Scientific，Inc.）和青霉素-链霉素（1:100；Sigma-Aldrich；默克（Merck KGaA）根据之前的研究(22)在含有5%CO的培养箱中237°C时。

甲状腺肿瘤组织和邻近正常甲状腺组织样本取自30名患者（年龄范围34-65岁年；中位年龄，46岁；12名男性和18名女性）从5月开始接受PTC2015年至2016年7月，江苏省武进市附属医院大学（中国常州）。所有涉及人类的实验组织由伦理委员会审查和批准武进附属医院人体研究回顾江苏大学医院。所有患者均书面提供知情同意使用其组织。

细胞转染

miR-150模拟物（5′-UCUCCAACCUGUACCAGUG-3′）和阴性对照miR序列（5′-CCGAACCUCGGUUGAUGCGG-3′）为购自上海基因制药有限公司（中国上海）。Lipofectamine 2000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）是用于进行TPC-1细胞转染，根据制造商协议。然后将细胞培养24小时37°C和5%CO2以便进一步分析。

MTT分析

MTT检测试剂盒（Beyotime Institute of生物技术，中国上海）用于测量TPC-1细胞根据基因转染后24、48和72小时的存活率制造商协议。TPC-1电池（5×104每口井）在96孔板中培养并孵育24、48和72小时温度为37°C。然后将PBS中总计10µl MTT（5 mg/ml）添加到每个孔，在37°C下培养4小时。随后，将培养基用二甲基溶解甲醛晶体亚砜（150µl/孔）在37°C下保持30分钟。吸光度为使用Bio-Rad iMark板在450nm的波长下测量阅读器（Bio-Read Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）。

细胞迁移和侵袭化验

伤口愈合和Transwell侵入实验分别用于评估细胞迁移和侵袭。对于伤口愈合试验，TPC-1细胞的融合单层在24孔培养板中培养，使用10-µl吸管尖端。冲洗井以去除细胞碎片细胞迁移24小时。典型图像在倒置显微镜下放大100倍拍摄（日本东京奥林巴斯公司）。重复实验至少三次。该分析在24小时后进行转染。

对于Transwell入侵实验，TPC-1细胞在200µl RPMI-1640悬浮培养基（5×10）中培养5细胞/ml）并接种到Transwell插入物的上腔中具有8 mm孔径的膜和Matrigel涂层膜基质。将含有10%FBS的RPMI-1640培养基添加到下层作为化学引诱剂。孵育24小时后，用棉签在上部去除非迁移细胞Transwell插件的腔室和迁移的细胞将滤膜底部固定在100%甲醇中15室温下至少30分钟，用0.1%结晶紫染色30分钟37°C下的min（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）迁移细胞为随机五次计数并拍照（×100倍放大）倒置显微镜下选定的微观区域。

RNA分离和RT-qPCR

三唑试剂（Invitrogen；Thermo FisherScientific，Inc.）从TPC-1细胞中提取总RNA和甲状腺肿瘤组织，然后使用逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Inc.）根据制造商的协议。miR-150的表达用bulg-lop™miRNA qPCR引物集测定（中国广州市广州RiboBio有限公司）和SYBR-GreenqPCR试剂盒（Takara生物技术有限公司，中国大连）。已送达U6作为内部控制。MUC4 mRNA的表达通过使用SYBR Premix Ex Taq™试剂盒进行qPCR（Takara Biotechnology，Co。，有限公司）。GAPDH被用作内源性对照。的引物qPCR来自GenScript（美国新泽西州皮斯卡塔韦）。底漆序列如下：MUC4，正向：5′-GGACCAGAGAGAGAAGCATTTGCC-3′，背面：5′-TCAATCTCTCGTGTGTCGAACGC-3′；GAPDH，转发：5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，背面：5′-AAGTGGTGTTGAGGGCAATG-3′；miR-150，转发：5′-CTCAACTGGTGTGGAGTCGTCGGCAATTCAGTGAGCACTGTA-3′，背面：5′-ACCTCCAGCTGGGTCTCCACCTTGTA-3′；U6，前进：5′-CTCCGCTTCGGCAGCACA-3′，反面：5′-AACGCTCACGAATTTGCGT-3′。全部根据制造商的协议。qPCR的热循环条件如下：95°C持续5分钟，然后在95°C下进行40次变性循环15秒，在60°C下退火/伸长率30秒2-ΔΔCq方法(23)曾经用于计算每个基因的相对数量。数据为从三个独立的实验中获得。

蛋白质印迹分析

使用以下方法从TPC-1细胞中提取总蛋白RIPA裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Inc.），然后使用BCA蛋白检测试剂盒定量（Beyotime Institute of生物技术）然后将总蛋白（50µg/车道）分离为10%SDS-PAGE并转移到聚偏氟乙烯膜（EMDMillipore，Billerica，MA，美国）。然后隔膜被堵塞加入5%脱脂牛奶2小时，在4°C下孵育过夜1:1000稀释度的以下主要抗体：抗MUC4（目录号ab60720），抗人表皮生长因子受体2（HER2；目录号ab16901），抗p-HER2（目录号ab53290），抗粘着斑激酶（FAK；目录号ab40794），抗p-FAK（目录号ab81298），抗细胞外信号调节激酶（ERK；目录号ab196883），反p-ERK（目录号ab4819），反GAPDH（目录号ab8245）（全部为英国剑桥Abcam）。这个然后清洗膜并用辣根培养过氧化物酶结合二级抗体（目录号ab191866和ab218695；稀释率，1:1000；Abcam）在室内1小时温度。使用ChemiDoc检测免疫反应带XRS+系统（Bio-Read Laboratories，Inc.）和ECL Plus套件（Beyotime生物技术研究所）。数据分析依据使用Image Pro Plus v.6.0软件（媒体控制论公司，美国马里兰州罗克维尔）。GAPDH作为内部控制所有实验。

生物信息学预测和双荧光素酶报告分析

目标扫描(网址：www.targetscan.org/vert_71)和miRWalk(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/micrornapredictedtarget.html)用于预测miR-150的假定靶基因。收件人研究miR-150对MUC4表达的直接影响，使用含有MUC4 3′-UTR区的pEZX-MT01靶向报告质粒（GeneCopoeia，Inc.，美国马里兰州罗克维尔）。此外，一个突变体MUC4 3′UTR（MUT-MUC4 3'UTR）报告子结构由生成miR-150假定靶位点的定点突变使用Quickchange XL的野生型（WT）MUC4 3′-UTR定点突变试剂盒（安捷伦科技公司，圣塔克拉拉，加利福尼亚州，美国）。将报告质粒共转染到含有miR-150模拟物的细胞或使用脂质内酰胺的控制载体2000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.），24井盘子。双荧光素酶报告检测系统（Promega公司，威斯康星州麦迪逊，美国）用于执行荧光素酶转染后48小时的活性，根据制造商协议。肾素荧光素酶活性正常化萤火虫荧光素酶活性。结果来自三个独立的实验。

统计分析

使用SPSS进行所有统计分析19.0软件（IBM Corp.，Armonk，NY，USA）。数据表示为平均值±标准偏差。各组之间的差异是使用双尾学生t检验进行分析。P<0.05为被认为表明统计学上的显著差异。

结果

miR-150和PTC中MUC4的上调

miR-150在PTC标本中的表达水平通过RT-qPCR初步检测邻近正常甲状腺组织分析。结果显示，PTC中miR-150水平为与匹配的正常组织相比显著降低(图1A). 的表达式级别PTC标本和邻近正常甲状腺组织中的MUC4也表达测定结果表明MUC4显著与邻近正常组织相比，PTC上调(图1B-D). 的表达模式miRNA-150在TPC-1人PTC细胞和正常甲状腺细胞系中的表达对Nthy-ori 3-1进行了分析，以确认上述发现。如所示图2A，的PTC细胞中miR-150的表达显著下调。MUC4在PTC细胞和正常甲状腺细胞中的表达水平然后通过RT-qPCR和western blotting进行测量。mRNA和PTC细胞中MUC4蛋白水平显著升高与正常甲状腺细胞比较(图。2B-D公司).

图1。 miR-150和PTC组织中MUC4的上调。（A） 定量分析PTC和邻近正常组织中miR-150水平由RT-qPCR。（B） PTC中MUC4水平的定量分析RT-qPCR检测邻近正常组织。（C） 蛋白质MUC4在PTC（4,5,6）及邻近匹配正常组织中的表达水平（1,2,3）是western blot检测。（D） 密度分析MUC4蛋白水平**与匹配的相邻正常值相比P<0.01组织。miR-150，microRNA-150；MUC4，黏蛋白4；PTC，乳头状甲状腺癌；RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应。

图2。 miR-150和甲状腺乳头状癌细胞MUC4的上调。（A）在TPC-1和Nthy ori 3-1细胞系中miR-150的相对表达。（B） TPC-1和TPC-1中MUC4 mRNA和（C）蛋白的表达水平反向测定Nthy-ori 3-1细胞系转录定量聚合酶链反应与western印迹分析。（D） MUC4蛋白水平的密度分析。**与Nthy-ori 3-1细胞相比，P<0.01。miR-150，microRNA-150；MUC4，粘蛋白4。

miR-150上调抑制人PTC细胞增殖与转移

研究miR-150的生物学功能人类PTC细胞的增殖和侵袭与肿瘤发生、获得功能实验密切相关通过在TPC-1细胞中转染miR-150模拟物进行。通过RT-qPCR评估处理细胞中miR-150的水平。结果表明，miR-150的表达水平为转染miR-150模拟物的细胞显著增加与阴性对照相比(图。第3页). 这一结果表明miR-150的转染TPC-1细胞模拟成功。因此，在以下方面在实验中，miR-150的水平是通过转染来控制的为了研究miR-150模拟物的潜在作用miR-150在人PTC细胞增殖和侵袭中的作用。

图3。 miR-150上调抑制人乳头状甲状腺癌细胞增殖与转移。（A） TPC-1细胞中miR-150的相对表达转染后。（B） TPC-1细胞增殖转染。（C） 伤口愈合的典型显微照片转染后对TPC-1细胞进行检测（比例尺=50µm）。（D）Transwell入侵实验的代表性显微照片转染后的TPC-1细胞（比例尺=50µm）。（E）创伤愈合试验结果的统计分析。（F）Transwell侵入分析结果的统计分析。*P<0.05 vs.mimic-Con，**P<0.01 vs.mimic-Con.miR-150，microRNA-150；mimic-Con，阴性对照转染；外径，光学密度。

miR-150对细胞增殖的影响是使用MTT分析进行检查。结果表明：上调miR-150显著抑制细胞增殖在转染miR-150模拟物后72小时，与对照组(图3B). 这是重要的是，因为晚期疾病的转移增加了癌症治疗的难点(24). 因此，伤口护理和Transwell进行侵袭试验以评估miR-150对细胞迁移和侵袭。如所示图3C-F，上调miR-150显著抑制癌细胞迁移和侵袭。

MUC4是miR-150的直接靶点PTC电池

通过Targetscan进行生物信息学分析(网址：www.targetscan.org/vert_71)以及米尔沃克(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/micrornapredictedtarget.html)MUC4被确定为miR-150的潜在靶点。如所示图4A，一个假定在MUC4 3′-UTR中鉴定出miR-150的结合位点。收件人确定MUC4表达是否由miR-150介导进行双核糖核酸酶报告分析。MUC4的3′-UTRmRNA，包括推测的miR-150结合序列（WT 3′-UTR）或突变序列（MUT 3′-UTR）亚克隆到荧光素酶中记者质粒。然后将TPC-1细胞与WT联合转染或MUC4和miR-150的MUT 3′-UTR模拟或控制。这个荧光素酶结果表明，miR-150的过度表达与MUC4 WT联合转染的TPC-1细胞导致荧光素酶活性降低，但没有这种降低在与MUC4 MUT联合转染的TPC-1细胞中(图4B). 这些结果表明MUC4是miR-150的直接靶点。荧光素酶活性miR-150转染的细胞与控件(图4B). 影响miR-150上调TPC-1中MUC4 mRNA和蛋白表达同时对细胞进行了分析。与转染阴性对照序列，转染miR-150模拟物的细胞MUC4的mRNA和蛋白水平显著降低(图4C-E).

图4。 MUC4是miR-150的直接靶点甲状腺乳头状癌细胞。（A） miR-150及其靶点MUC4 3′-UTR中。突变碱基用方框表示。（B）转染荧光素酶报告基因的TPC-1细胞的荧光素素酶报告分析含有WT或MUT MUC4 3′-UTR的载体。（C） MUC4 mRNA表达通过逆转录定量聚合酶进行评估转染miR-150模拟物的TPC-1细胞中的链式反应mimic-Con.（D）MUC4蛋白表达由western转染miR-150模拟物的TPC-1细胞的印迹分析mimic-Con.（E）MUC4蛋白水平的密度分析。*与对照组相比P<0.05**与模拟对照组相比P<0.01。miR-150，microRNA-150；mimic-Con，阴性对照转染；MUC4，粘蛋白4; 3′-UTR，3′-非翻译区；NC，阴性对照；WT，野生类型；MUT，突变。

miR-150对HER2和FAK/ERK的影响下游信号

为了阐明miR-150的分子机制，HER2，MUC4和下游FAK/ERK的互动合作伙伴对TPC-1细胞的信号转导进行了研究。如所示图5HER2的表达转染后p-HER2显著降低与对照组相比，miR-150在TPC-1细胞中模拟。A类还观察到p-FAK和p-ERK的显著降低miR-150转染细胞与对照组相比总FAK和ERK表达水平的显著变化观察到。结果表明MUC4在HER2和p-HER2的表达及FAK的磷酸化和ERK，关键的癌症生存分子。此外，激活HER2和FAK/ERK信号被指示减弱PTC中miR-150的上调。

图5。 miR-150对HER2和下游FAK/ERK信号。（A） 蛋白质水平由western blot分析。（B） 每种蛋白质的密度分析级别**与模拟对照组相比，P<0.01。miR-150，microRNA-150；模拟康，阴性对照转染；HER2，人表皮生长因子受体2；FAK，粘着斑激酶；ERK，细胞外信号调节激酶。

讨论

miRNAs不仅在调节许多基本的细胞过程，但也可能在多种人类中充当致癌基因或抑癌基因癌症类型，包括PTC(25).在过去几年中，越来越多的研究关注miRNA表达在PTC中的作用(26,27). 它据报道，miRNA失调与PTC的病理过程，如甲状腺外浸润、肿瘤大小和淋巴结的存在转移(8). miRNA-146，−222和−221是参与这些过程的最常见的miRNA它们与肿瘤细胞增殖密切相关，分化、迁移与凋亡(8). 明确识别独特癌症特异性miRNA及其靶点的表达谱对于阐明其在肿瘤发生中的作用至关重要，miRNAs具有在癌症生物标记物和新型治疗药物(8). 它有据报道，miR-150在多种实体癌类型，包括宫颈癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、，胃癌、肝癌、胰腺癌和食道癌(19–21,28–30).然而，miR-150在人类PTC中的作用尚未完全阐明阐明。

在本研究中，观察到miR-150在PTC组织中减少，在人类PTC细胞中下调线。因此，用miR-150模拟物转染PTC细胞以上调miR-150的表达。转染率为经RT-qPCR检测，结果令人满意。生物学然后检测miR-150对人PTC细胞的影响结果表明miR-150的过度表达显著72小时后抑制人PTC细胞增殖miR-150模拟物转染。此外miR-150的过度表达显著抑制人PTC细胞转移。进行了进一步的实验以确定miR-150的潜在潜在分子机制。

通过生物信息学分析检测miR-150的靶基因，并将MUC4鉴定为潜在目标。MUC4是高分子量I型跨膜蛋白和MUC4的改变通常相关有癌症(31). 上调监管MUC4已在多种癌症中得到证实，包括PTC公司(32). 在一项对98名患者的研究中作者：Nam等(33)，基因MUC4在PTC和蛋白中的表达增加约78倍与PTC相比，MUC4染色分数也显著增加甲状腺组织正常。结果表明，高MUC4表达与小肿瘤大小和乳头状突起有关甲状腺微小癌亚型。MUC4可能在以下方面发挥关键作用PTC的早期致癌。然而，MUC4的功能作用在PTC中，其失调尚未明确确定。在本研究中，MUC4的mRNA和蛋白水平为PTC细胞中的PTC细胞明显高于正常甲状腺细胞，而miR-150显著模拟降低MUC4水平。此外，双核糖核酸酶报告系统表明MUC4是miR-150。由于miR-150有许多靶基因需要进行实验来进一步研究miR-150作为PTC中通过MUC4的肿瘤抑制剂。深入研究将是在未来进行。

大多数癌症相关死亡病例归因于转移(34).癌细胞转移涉及一系列复杂的表型生物化学过程和事件，包括细胞迁移和入侵(35). FAK服务至关重要在肿瘤细胞增殖、存活和迁移中的作用。FAK（传真）缺乏导致细胞运动减少和病灶增强粘附接触形成与对照细胞的比较(36). FAK与HER2的互动促进肿瘤发生和微转移细胞表达活化/p-FAK和HER2，提示HER2-FAK激活在恶性肿瘤和侵入性生长(37). ERK是一个丝裂原活化蛋白激酶家族成员涉及广泛的细胞功能和生理过程(38). ERK是一家著名的FAK的下游信号分子，并作为关键调节因子细胞运动成分(39). 在在本研究中，HER2和p-HER2的表达减少在miR-150过度表达的PTC细胞中鉴定。类似的减少miR-150转染细胞中也观察到p-FAK和p-ERK，表明MUC4在激活这些与癌症相关的分子，这种效应可能被部分调节通过PTC中miR-150的改变。

总之，本报告的调查结果表明miR-150具有抗肿瘤特性并抑制PTC细胞的生长和恶性行为，至少部分通过下游目标MUC4的调节。这些发现可能为诊断和治疗策略提供新的见解用于PTC。然而，本研究受到以下事实的限制：只研究了一种肿瘤细胞系，因此进行了深入的研究将在未来进行，以验证这些结果。

致谢

作者想感谢教授上海市头颈外科黄彩萍癌症医院为他提供了亲切的手术建议。此外作者感谢常州薛志新博士的帮助武进市人民医院在收集组织样本。

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