本文在以下内容中提到：

介绍

肺癌是导致全球癌症相关死亡(1,2). 更多75%以上的肺癌是非小细胞肺癌（NSCLC）(三,4)只有少数非小细胞肺癌患者在早期被诊断(5). 迄今为止，非小细胞肺癌的主要治疗方法是手术切除，而手术后复发率很高高和II–III期患者接受佐剂治疗化疗对患者的改善有限几项随机临床试验的生存率(三,6).尽管在传统治疗中已经有了很大的进步，例如作案手法和补充佐剂化疗，相当数量的非小细胞肺癌患者诊断为晚期，预后不良(7,8). 因此，新的生物靶点预防癌细胞侵袭和转移对非小细胞肺癌的治疗至关重要(9,10).

据报道FBXW7是一种肿瘤几种癌症中的抑制物及其靶向转录激活物和原癌基因泛素介导的降解(11)，包括cyclin E、c-Myc(12,13),槽口(14)，c-6月(15)，p53，雷帕霉素的哺乳动物靶点，和MCL1(16,17). FBXW7基因异常表达在卵巢、乳腺、子宫内膜、肾脏、淋巴瘤和结直肠癌(18–24). 因此，改变了FBXW7被认为是致癌或癌症发展。以前的研究已经阐明FBXW7与乳腺预后不良显著相关癌症、胃癌和神经胶质瘤。同样，低表达据报道，FBXW7与非小细胞肺癌预后不良相关(25). 然而上述相关性的机制尚不清楚。

微RNA（miRNAs）是一大类内源性调节人类基因表达的非编码RNA(26). 越来越多的证据表明miRNAs可以作为致癌基因或肿瘤抑制剂通过序列特异性研究癌症的发展和进展与mRNA靶点结合(27). 这些miRNAs在各种复杂的生物过程，包括细胞发展和分化，但调查才刚刚开始以验证它们在致癌作用中的意义。考虑到关键FBXW7与非小细胞肺癌预后的关系(28)，我们假设FBXW7由miRNAs在转录后水平调控。在我们的在之前的研究中，我们确定miR-367是FBXW7的调节因子在人非小细胞肺癌细胞中表达。我们的研究结果表明miR-367促进了肿瘤的侵袭和转移，并阻止了通过直接调节FBXW7诱导NSCLC细胞凋亡。在此外，我们还重点研究了miR-367与非小细胞肺癌的预后，发现miR-367可能是一种潜在的预测非小细胞肺癌患者生存率的生物标记物。

材料和方法

临床组织和细胞培养

我们分析了113例患者的肿瘤标本接受原发肿瘤切除手术的肺癌在第一附属医院胸外科南京医科大学医院（中国南京）。书面根据样本采集前的机构指南，以及该研究得到了道德审查委员会的批准南京医科大学的研究。新鲜冷冻和/或福尔马林固定和石蜡包埋样品用于miR-367和FBXW7表达分析。人肺癌细胞系H226、H1792和A549在RPMI-1640培养基中培养补充10%的FBS（均来自Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA），100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素在5%CO中2/37°C时95%空气。这些细胞系从美国类型培养物收藏馆（ATCC；Manassas，弗吉尼亚州，美国）。

质粒和转染

通过结扎产生荧光素酶结构含有野生型或突变型假定靶点的寡核苷酸FBXW7 3′-UTR进入荧光素酶报告质粒的位点pEZX-MT01载体（GeneCopoeia，Inc.，Rockville，MD，USA）下游萤光素酶基因。FBXW7 CDS序列被克隆到pcDNA3载体。所有序列均已完全测序。我们使用Lipofectamine 2000试剂盒进行转染（Invitrogen）。细胞系转染miR-367模拟物或抑制剂及其对照（基因制药，中国上海）。这个针对FBXW7的短干扰RNA（Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA，USA）转染到细胞中根据制造商说明。转染效率>70%（microRNA）和60%（质粒）（数据未显示）。

RNA分离和实时PCR

使用以下方法从组织和细胞中分离出总RNATRIzol（Invitrogen）和小RNA富集使用miRVana miRNA分离试剂盒（Ambion公司，德克萨斯州奥斯汀，美国），根据制造商的说明。小RNA使用TaqMan MicroRNA反向转录到cDNA转录试剂盒（美国加利福尼亚州圣地亚哥应用生物系统公司）根据制造商的说明。然后cDNA被用作用于实时PCR扩增的模板。实时PCR是在StepOnePlus™实时PCR仪器上运行（已应用生物系统）。使用的底漆可根据要求提供。实时使用SYBR-Green（Takara Bio，Inc.，Otsu，Japan）进行PCR比较FBXW7 mRNA的相对表达水平按照制造商的说明。对于miR-367实时PCR商用Hairpin-it™miRNAs qPCR定量试剂盒（带引物）从GenePharma购买。mRNA的引物实时PCR为：FBXW7正向，5′-GGCAAAAATGATTCCAGCAA-3′和背面为5′-ACTGGAGTCGTGACACTGTTTA-3′。

蛋白质印迹分析

从培养物中提取总蛋白细胞或组织，并使用BCA蛋白检测试剂盒定量（中国江苏Beyotime），BSA为标准。等量的用10%SDS-PAGE和转移到PVDF膜上。膜被5%堵塞BSA（PBS中5%w/v+0.1%吐温-20）并与原代培养室温下的抗体。抗FBXW7和根据制造商的说明使用GAPDH（圣诞老人克鲁兹生物技术公司）。使用二级抗体后（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）在PBS中1:2000（v/v）稀释+0.1%吐温-20，信号由SuperSignal West检测Pico化学发光底物试剂盒（Pierce Biotechnology，Inc。，美国伊利诺伊州罗克福德市）说明。

荧光素酶检测

H226和H1792细胞与荧光素酶报告质粒pEZX-MT01（GeneCopoire，Inc.），和miRNA-367和对照。转染后24小时，萤火虫和雷尼利亚测定荧光素酶活性使用Luc-Pair™miR荧光素酶检测试剂盒（GeneCopoeia，Inc.）。每次转染一式三份，重复三次次。

细胞增殖与凋亡化验

通过细胞计数进行细胞增殖套件8（CCK-8）（Dojindo，东京，日本）。根据说明，在0、24、48和72小时添加CCK-8试剂播种后分别为4×10三96 well中的细胞/孔平板，并在37°C下培养2小时使用微孔板阅读器（Bio-Read）检测450 nm实验室，美国加利福尼亚州里士满）。使用Annexin V/PI检测试剂盒（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国）。流量FACSCalibur细胞术（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）进行评估结果。

Transwell侵入试验

使用Transwell评估细胞侵袭试验细胞板（康宁Costar公司，美国纽约州康宁）和8-µm孔Matrigel入侵室（BD Biosciences）的大小根据制造商说明(29).电池（1.0×104)在无血清培养基中播种上部腔室，允许侵入10%FBS下腔室。在37°C和5%的温度下培养24小时后一氧化碳2细胞侵入膜并粘附到膜的下面。然后入侵和迁移细胞固定并用结晶紫染色。这些图像是使用NIS Elements图像分析软件（尼康，日本东京）。对于膜图像，我们计算了使用图像分析软件image-Pro Plus 6.0迁移细胞（媒体控制论，美国医学博士贝塞斯达）。

统计分析

所有结果均表示为平均值±SD学生的t检验用于分析显著差异样品之间。miR-367与FBXW7的相关性表达水平通过计算Spearman的相关系数。所有直方图均使用执行GraphPad Prism 4.0版Jolla，加利福尼亚州，美国）。P<0.05表示具有统计学意义结果。

结果

临床病理学意义非小细胞肺癌中的miR-367

我们检测了113例患者中miR-367的表达水平利用实时PCR对非小细胞肺癌临床样本进行定量分析用于计算miR-367/U6比率的值。我们的结果证明miR-367的相对表达水平为癌组织中的含量明显高于在非癌组织中发现(图。第1页). 根据miR-367表达水平的中值，我们将113名非小细胞肺癌患者分为两组：miR-367高表达组（57例）和miR-367低表达组（56例）。然后，我们进行了Chi-square（χ2)测试到探讨临床病理学之间的联系特征和miR-367表达。总结了调查结果在里面表一。有显著的肿瘤大小、分期和转移状态的差异在小组之间。

图1。 miR-367和FBXW7在非小细胞肺癌病例。（A）miR-367的代表性实时PCR分析和（B）FBXW7在肿瘤组织和匹配的副肿瘤中的表达显示了组织。n=113。值表示为带四分位区间*经t检验，P<0.05。（C） 相关性非小细胞肺癌患者miR-367和FBXW7 mRNA的表达使用Spearman相关分析进行评估。n=113；P<0.001。

表一。 miR-367之间的相关性非小细胞肺癌的表达及临床病理特征患者（n=113）。

表一。

miR-367之间的相关性非小细胞肺癌的表达及临床病理特征患者（n=113）。

特点	所有患者	miR-367低表达（<中位数一)	miR-367高表达式（≥中值一)	P值(χ2测试）
病例总数（N）	113	56	57
年龄（岁）
<60	46	23	23	0.938
≥60	67	33	34
性别
男	59	28	31	0.641
女性	54	28	26
组织学
交流	69	33	36	0.645
标准立方厘米	44	23	21
肿瘤大小
T1-T2段	36	23	13	0.037b条
T3-T4层	77	33	44
肿瘤分期
I–II级	39	25	14	0.025b条
III–IV类	74	31	43
转移
是的	30	20	10	0.029b条
没有	83	36	47

a使用miR-367的中位数表达水平作为切口。AC、腺癌；鳞状细胞癌癌症。

b P<0.05。

miR-367是NSCLC和miR-367中的FBXW7通过直接瞄准其3′-UTR

越来越多的证据表明FBXW7与非小细胞肺癌患者的预后显著相关。因此，我们假设miR-367参与了FBXW7的规定。然后，我们评估了通过实时PCR检测113例非小细胞肺癌组织中的FBXW7，发现癌组织中FBXW7表达水平明显降低比非癌症组织中的要多(图1B). 分析表明FBXW7表达水平为负与非小细胞肺癌中miR-367的表达水平相关(图1C).

研究miR-367与NSCLC，我们用miR-367转染人类NSCLC H228和H192细胞模拟上调miR-367的表达，然后我们使用实时荧光定量技术评估miR-367和FBXW7的表达水平PCR。结果表明miR-367表达上调（数据未显示）而FBXW7显著下调与阴性对照细胞比较。值得注意的是在下调miR-367的A49非小细胞肺癌细胞中FBXW7的表达是明显上调(图2A).miRNA预测程序TargetScan(http://www.targetscan.org)和米兰达(网址：http://www.microrna.org)利用了，其中预测FBXW7 3′非翻译区的一个片段（3-UTR）含有推测的miR-367结合位点。进一步证实了这一预测，miR-367模拟物与含野生型和突变型FBXW7的荧光素酶报告子构建物3′-UTR(图2B). 如所示图2C，我们共同转染了miR-367与包含野生型或突变型FBXW7 3′-UTR，转染相比之下，miR-367模拟物的荧光素酶活性下调与对照组转染。结果表明miR-367是FBXW7的潜在调节剂。

图2。 miR-367下调FBXW7直接针对其3′-UTR的表达。（A） 非小细胞肺癌细胞转染对照组或miR-367和抗miR-366抑制剂。20小时后，FBXW7 mRNA和用实时PCR和western blot检测蛋白质分别进行分析。（B） 人FBXW7 3′-UTR片段含有克隆了野生型或突变型miR-367结合序列荧光素酶报告基因下游。（C） H226和H1792细胞与阴性对照（NC）或miR-367联合转染mimics和包含WT或突变型FBXW7 3′-UTR（MUT）。对于每个实验，结果是归一化为细胞中检测到的荧光素酶活性用控制载体转染。结果来自三个独立实验被表示为平均值±SD.NS，不重要*经t检验，P＜0.05。

miR-367促进增殖和非小细胞肺癌细胞的侵袭和凋亡抑制

miR-367之间的显著相关性非小细胞肺癌的表达及临床病理特征病例提示miR-367可能在非小细胞肺癌的发展和进展。根据表达式miR-367的模式，miR-366过度表达的影响细胞增殖、凋亡和侵袭人非小细胞肺癌细胞株H229和H1792。细胞系是miR-367模拟物转染后，miR-366的表达通过实时PCR确认（数据未显示）。结果证明miR-367的上调促进了增殖、侵袭和防止凋亡能力与非小细胞肺癌细胞的阴性对照相比(图3). 此外，为了进一步调查miR-367的作用在体外，我们转染了NSCLC A549使用miR-367抑制剂下调miR-366表达的细胞。功能损失实验结果表明miR-367的下调阻止了增殖、侵袭和诱导凋亡与阴性对照比较(图3). 综上所述，我们的发现证实miR-367可以促进增殖、侵袭和抑制NSCLC细胞凋亡。

图3。 miR-367促进增殖和侵袭和抑制NSCLC细胞凋亡。（A） 扩散在转染NSCLC H226和H1792细胞中进行检测使用miR-367模拟物，A549细胞转染抗miR-367抑制剂和对照细胞。数据表示为平均值±标准偏差。（B）在非小细胞肺癌中进行细胞凋亡分析转染miR-367模拟物A549的H226和H1792细胞用抗miR-367抑制剂转染的细胞和对照细胞。流式细胞术检测细胞凋亡。（C）在NSCLC H226和H1792细胞中进行侵袭试验转染miR-367模拟物后，A549细胞转染使用抗miR-367抑制剂和对照细胞。数字通过细胞膜的细胞数量被计算为8个领域。三个独立实验的结果如下表示为平均值±标准偏差。*经t检验，P<0.05。

FBXW7介导miR-367的功能非小细胞肺癌细胞

鉴于miR-367和FBXW7之间的相关性，我们进行了救援实验，以进一步检查miR-367对NSCLC细胞系的功能作用通过以FBXW7为目标。根据我们之前的结果，FBXW7是在NSCLC细胞中下调，然后转染miR-367模拟。因此，我们联合转染了NSCLC细胞系H226和H1792，带有pcDNA3-FBXW7和miR-367模拟物。转染用miR-367模拟物转染的细胞和共转染的带有载体控制和miR-367模拟物的细胞被用作对照组。增殖测定显示过度表达FBXW7部分取消了对细胞增殖的促进作用由miR-367诱导(图4A). 然后，我们进行了细胞凋亡检测。结果表明：H226和H1792细胞凋亡部分增加pcDNA3-FBXW7和miR-367模拟物联合转染(图4B). 同样，侵入能力当FBXW7在细胞中过度表达时，会在一定程度上逆转与对照组相比，miR-367高表达(图4C). Moverover，我们联合转染带有siRNA-FBXW7和miR-367抑制剂的人类NSCLC细胞系A549。然后，我们进行了增殖、凋亡和Transwell入侵测定。值得注意的是，研究结果表明，当我们miR-367低表达细胞中沉默的FBXW7与控件(图4). 在结论，这些结果表明miR-367对NSCLC细胞株部分依赖FBXW7。

图4。 FBXW7调节miR-367在非小细胞肺癌细胞中的致癌促进作用。（A）使用NSCLC细胞进行增殖测定与miR-367模拟物和FBXW7表达载体联合转染，或联合转染抗miR-367抑制剂和FBXW7 siRNA（siFBXW7）。（B） 流式细胞术分析细胞细胞凋亡。（C） 在NSCLC细胞中进行侵袭试验。通过膜的细胞数被计算在内八个字段。从三个独立的实验结果表示为平均值±标准偏差。*P<0.05t检验。

讨论

我们目前的研究表明miR-367是与对照组相比，人类非小细胞肺癌组织中的表达明显上调在相应的非癌组织中，以及NSCLCmiR-367高表达的患者明显较差预后较低表达者好。皮尔逊相关分析还提供了证据，证明存在负面关联非小细胞肺癌中miR-367和FBXW7蛋白的表达患者。此外，越来越多的证据表明FBXW7与癌症患者预后显著相关(25,30–32).这些发现表明miR-367的过度表达可能与非小细胞肺癌患者预后不良有关抑制FBXW7蛋白的功能。

研究发现FBXW7缺陷小鼠死亡子宫内胚胎期血管异常10.5–11.5 (33). 此外，尽管p53缺乏小鼠不会发生肿瘤FBXW7验证了p53缺陷小鼠的肿瘤特征，并且他们患上肺癌(34).此外，已报道FBXW7的抑制和突变参与各种类型的恶性肿瘤(35–37). 一个大量研究表明FBXW7的缺失或突变可能在肺部的发育和进展中发挥重要作用致癌作用。FBXW7通过控制癌蛋白如细胞周期蛋白E、MYC、TOP2A、MCL1的表达，和P53都与肿瘤的发展和进展(12,13). 这些数据以及FBXW7与肿瘤患者预后的相关性，表明FBXW7在人类中起到抑癌作用肿瘤发生。在本研究中，我们发现FBXW7在NSCLC临床中显著下调样本与对照组和表达水平的比较癌组织中FBXW7与miR-367呈负相关。作为众所周知，miRNAs调节其靶基因的表达在转录后水平(38). 他们通过以下方式阻止翻译与相应的互补序列直接结合它们的靶mRNA，从而下调蛋白质表达。许多研究表明，miRNAs的异常表达与患有各种人类疾病，包括恶性肿瘤(39–42).例如，雷等确定了miR-92b通过靶向逆转诱导富含半胱氨酸在非小细胞肺癌中的表达带有Kazal基序的蛋白质（RECK）。张等报告说miR-150通过靶向p53促进NSCLC细胞增殖(43). 相反，miR-638和miR-625通过靶向性决定发挥肿瘤抑制作用区域Y（SRY）-分别为方框2（SOX2）(44). 然而，FBXW7是否miR-367对转录后的调控尚不清楚。因此，我们旨在确定miR-367是否参与FBXW7的规定。值得注意的是，通过使用miRNA预测程序，我们发现FBXW7 3′-UTR的一个片段包含假定的miR-367结合位点。为了进一步证实这一预测，miR-367mimics与荧光素酶报告子结构共转染含有野生型FBXW7 3′-UTR。我们的结果表明miR-367转染模拟荧光素酶活性下调与NC转染相比。此外实验进一步证实了上述结果，表明miR-367是FBXW7的潜在调节剂。因此，我们专注于miR-367可能对进展和非小细胞肺癌的发展。χ2测试表明肿瘤大小、分期、转移的统计相关性miR-367表达。基于上述相关性，我们进行了一系列功能实验来测试非小细胞肺癌细胞上的miR-367。我们的研究结果表明miR-367的过度表达促进了增殖、侵袭和抑制各类非小细胞肺癌细胞株的凋亡。我们首先证明miR-367的过度表达与非小细胞肺癌患者预后较差。由于FBXW7在癌症中，我们开发了一系列拯救实验进一步研究miR-367对非小细胞肺癌的功能作用通过靶向FBXW7施加细胞系。我们的发现证实了我们的假设是增殖、侵袭和凋亡当我们在低浓度的细胞中沉默FBXW7时，在一定程度上逆转了与对照组相比，miR-367的表达。此外，我们也证实miR-367高表达和FBXW7低表达表达可作为独立的预后因素，分别是。

总之，我们确定了miR-367/FBXW7轴，参与增殖、凋亡非小细胞肺癌细胞的侵袭。根据我们的发现，miR-367和FBXW7可能作为人类治疗的治疗靶点非小细胞肺癌，尤其是具有高侵袭潜能的癌症。此外，miR-367和FBXW7的表达可以分别起作用作为独立的预后因素。

致谢

这项研究部分得到了国家江苏省自然科学基金（81572263）省自然科学基金（BK20151584）和江苏省六个专业的顶级专家计划（WSW-028）。

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