本文在以下内容中提到：

引言

骨关节炎（OA）是一种关节疾病；它是最常见的关节炎，是由疾病引起的关节软骨和底层骨(1). 2004年，骨性关节炎导致中度-重度全世界4340万人的残疾(2). 2010年，全球人口的3.8%受到OA的影响(三,4).

OA影响工作和正常的日常活动关节疼痛和僵硬是最常见的症状。异常关节或肢体的发育、遗传因素和既往因素关节损伤可能导致OA，发生OA的风险是超重、腿长不同或从事关节压力大的工作(5,6). 办公自动化随着软骨丢失和底层骨骼受到影响而发展(5). 平衡含水量健康的软骨由压缩力维持将水排出，以及吸引水的静水压/渗透压英寸(7,8). 胶原蛋白纤维具有压缩性吉布斯-多南平衡的推动水流出的力软骨蛋白多糖产生渗透性吸水压力(8).然而，在OA进展过程中，胶原基质胶原纤维的紊乱和分解导致含水量总体增加(9).

SMAD家族成员2（SMAD2）是一种蛋白质在传递细胞外信号中起着关键作用来自转化生长因子β（TGF-β）配体超家族进入细胞核，导致a细胞过程的数量，包括细胞增殖，细胞凋亡与分化(10,11).在OA小鼠模型中，SMAD2被证明是过度磷酸化，这意味着其活化可能是与OA的开发相关(12). SMAD2表达也被报道OA组织中减少(13).

微小RNA（miRNA）是一种小型非编码RNA在转录后调控中起作用的分子基因表达(14,15). 目前尚不清楚是否存在靶向SMAD2并在治疗办公自动化。

本研究旨在调查miR-486-5p在骨关节炎中的表达和作用miR-486-5p在OA中上调。此外，miR-486-5p可能通过靶向SMAD2、，表明miR-486-5p在OA中的关键作用。因此，miR-486-5p可能是治疗OA的潜在靶点。

材料和方法

患者

25例OA患者的关节软骨组织接受全膝关节置换手术（男14例，女11例；年龄62.4±6.2岁）为实验组以及来自25名非OA患者的膝关节软骨组织（男性，16; 女性11人；年龄60.1±7.2岁），患有股骨颈骨折没有已知的OA或类风湿性关节炎病史控件。所有样本均在中国人民医院采集2015年3月至2016年8月，解放军第149医院。本研究由连云港东方医院（中国连云港）。所有本研究参与者提供了书面知情同意书中国人民解放军道德委员会149医院（中国连云港）。

细胞培养

CHON-001人软骨细胞培养于Dulbecco改良的Eagle培养基/营养混合物F12（DMEM/F12；吉布科；赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国），补充抗生素和抗真菌剂（10000单位/ml青霉素、10000μg/ml链霉素和25μg/ml真菌酮；吉布科；标准中的赛默飞世尔科技公司培养条件（37°C，5%CO2和95%湿度）。

细胞转染

miR-486-5p模拟物（50 nM；分类号miR10003130-1-5），miR-486-5p抑制剂（100 nM；目录号miR20003130-1-5）miR-486-5p（NC，50 nM；分类号miR01101-5）的阴性对照，对照siRNA（si-control）和SMAD2 siRNA购自广州瑞宝生物科技有限公司（中国广州）。执行CHON-001细胞转染®2000年（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）根据制造商协议。已确定转染效率使用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR），如下所述。然后将细胞培养24小时37°C和5%一氧化碳条件下的h2直到进一步分析。

MTT分析

CHON-001细胞（5×10三细胞/孔）生长在96-well板中。转染后总共24小时使用miR-486-5p模拟物、miR-485-5p抑制剂或37°C下的NC。随后，在24时将MTT溶液（20µl）添加到每个孔中，48和72小时，在37°C下培养平板额外4 h。抽吸MTT溶液并对其进行二甲基化在评估吸光度之前，添加亚砜（150µl）A570纳米；该值表示每个孔的细胞增殖检查。

Transwell迁移分析

CHON-001细胞的迁移能力为使用24孔Transwell腔室进行测试，上部和下部培养箱由聚碳酸酯膜隔开。细胞(2×104)悬浮在100µl无血清DMEM中播种到顶部室中。底部腔室含有0.5 ml含10%胎牛血清的DMEM（FBS，Thermo Fisher Scientific，股份有限公司）。亚培养约24小时后，上层细胞用棉签去除膜表面。单元格迁移至下表面用10%福尔马林固定30室温下的最小值。迁移能力由苏木精和伊红染色细胞计数使用倒置显微镜（放大，×200; 日本奥林巴斯公司）。

双荧光素酶测定

TargetScan生物信息学软件（TargetScanHuman7.1;网址：www.targetscan.org/vert_71)用于预测miR-486-5p的靶基因，表明SMAD2是潜在的miR-486-5p的靶点。验证miR-486-5p是否直接靶向SMAD2的3′-非翻译区（UTR），向量SMAD2-3′UTR-野生型（WT，GAGCTCTCCCAAAGGTTATAATAAACAGTAGTAGTGTACAGGTATATCAGAG）和SMAD2-3′UTR突变体（MUT，GAGCTCTCCCAAAGGTTATAATAAACAGTAGTAGTCATGTCCTAGTCATCTCGAG）pMIR-REPORT（GeneCopoeia，Inc.，Rockville，MD，USA）的分别含有SMAD2的野生型和突变的3′UTRmRNA的表达。对于荧光素酶报告分析，CHON-001电池（5×104细胞/孔）接种到24孔板材。CHON-001细胞与SMAD2-3′UTR-WT或SMAD2-3’UTR-MUT以及miR-486-5p模拟或使用脂多糖胺进行miR-阴性对照®2000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）在37°C下放置48小时。然后收集细胞并分析荧光素酶活性使用双荧光素酶报告分析系统（Promega公司，威斯康星州麦迪逊，美国）协议。雷尼利亚荧光素酶活性标准化为萤火虫荧光素酶活性。

总RNA分离和RT-qPCR

使用微孔膜均质关节软骨组织在4°C下快速冷冻1分钟1500转/分。使用RNeasy Mini试剂盒分离总RNA（Qiagen，Inc.，Valencia，CA，USA）根据制造商的协议。cDNA通过逆转录合成，使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒（应用生物系统；Thermo Fisher Scientific，Inc.）并用于qPCR反应根据制造商的协议。放大条件qPCR如下：95°C持续5分钟，然后进行40次循环95°C下变性15秒，60°C下退火/伸长率将GAPDH用作参考基因。这个2-ΔΔCq方法用于计算相对每个基因的数量(16).引物序列列于表我。

表一。 反向引物序列转录-qPCR。

表一。

反向引物序列转录-qPCR。

基因	底漆顺序(5′→3′)
座椅模块组件2	传真：ATGTCGTCCATCTTGCCATTC公司
	回复：AACCGTCCTGTTTTCTTAGCTT公司
II型胶原蛋白	传真：CCCTGAGTGGAAGAG公司
	回复：GAGGCGTAGGTCTTCTGTG公司
阿格雷坎	传真：CTAGAGATCAGTGCCT公司
	回复：技术规格
miR-486-5p	传真：CTCGCTTCGGCAGCACA公司
	传真：ACGCTTCACGAATTGCGT公司
6号机组	F： 通用_ RNU6B_底漆
	R： 单miR-qPCR底漆
间隙	传真：CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC公司
	回复：加他加他加他加他

[一]F、 向前；miR、，微RNA；定量聚合酶链反应；R、 反向；SMAD2，SMAD家族成员2；统一、通用。

蛋白质印迹分析

对数生长期细胞（90%汇合）用放射免疫沉淀分析裂解缓冲液采集并裂解（Beyotime生物技术研究所，中国海门）。这个通过BCA分析检测蛋白质浓度（Thermo FisherScientific，Inc.）。蛋白质用12%的SDS-PAGE分离裂解产物（每车道25µg），转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。在室内用5%脱脂牛奶封闭2小时温度，膜与初级抗体孵育针对SMAD2（1:1000；目录号5339；细胞信号技术，美国马萨诸塞州丹弗斯有限公司），II型胶原蛋白（1:1000；分类号。ab34712），aggrecan（1:1000；目录号ab36861；两者都是Abcam，英国剑桥）和β-肌动蛋白（1:2000；目录号4970；细胞信号Technology，Inc.）在4°C下过夜。随后，PVDF用含有0.1%吐温-20和与抗抗体IgG、HRP-连接抗体（1:5000；猫编号7074；Cell Signaling Technology，Inc.）在室温下进行~1 h。用SuperSignal West Femto Maximum开发印迹灵敏度基板（Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc.），以及ChemiDoc XRS+系统（Bio-Read Laboratories，Inc.，加利福尼亚州Hercules，美国）用于根据制造商协议。使用密度计分析数据Image Pro Plus v.6.0软件（Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，美国）。β-肌动蛋白作为所有细胞的内部控制实验。

统计分析

所有实验都至少进行了三次次。数据表示为平均值±标准偏差。单向使用Tukey的事后检验进行方差分析评估不同处理的效果。统计分析使用SPSS软件版本20.0（IBM Corp.，Armonk，美国纽约州）。P<0.05被认为是统计学上的差异显著。

结果

OA患者的SMAD2较低mRNA表达和miR-486-5p高表达

通过以下方法检测SMAD2的mRNA表达水平和患者关节软骨组织中的RT-qPCR没有OA。结果表明，SMAD2的表达是OA患者与对照组无OA（P<0.01）；图1A). 的表达式级别miR-486-5p在两种关节软骨组织中也有表达经RT-qPCR检测，结果显示骨性关节炎患者miR-486-5p表达水平升高与对照组比较（P<0.01）；图1B).

图1。 SMAD2的相对表达水平OA患者的mRNA和miR-486-5p。的相对表达式患有和不患有OA的患者的SMAD2和miR-486-5p分别为逆转录定量聚合酶链测定反应。（A） SMAD2的相对mRNA表达水平。（B） 相对miR-486-5p的表达水平**与对照组相比，P<0.01。miR、，微RNA；骨性关节炎；SMAD2，SMAD家族成员2。

SMAD2是miR-486-5p

TargetScan用于预测miRNAs靶SMAD2 mRNA和miR-486-5p的得分相对较高并与SMAD2的3′-UTR结合(图2A). SMAD2随后得到确认作为miRNA-486-5p的直接靶点实验表明，荧光素酶的相对活性为SMAD2-3′UTR-WT转染组显著降低miR-486-5p模拟物与共转染细胞的比较SMAD2-3′UTR-WT和miR-NC（P<0.01）；图2B).

图2。 SMAD2是miR-486-5页。（A） TargetScan用于预测交互miR-486-5p和SMAD2的野生型3′UTR之间。（B） 萤光素酶双核糖核酸酶活性测定。提供数据平均值±标准偏差**与miR NC相比P＜0.01。SMAD2，SMAD家族成员2；miR，microRNA；MUT，突变体；NC，负极控制；UTR，非翻译区；WT，野生型。

miR-486-5p模拟抑制CHON-001细胞增殖、迁移和II型表达胶原蛋白和聚集蛋白

研究miR-486-5p在用miR-486-5p转染OA、CHON-001细胞miR-486-5p抑制剂。miR-486-5p的表达是通过miR-486-5p模拟物和miR-486-5p抑制剂治疗显著抑制（与NC相比P<0.05；图3A). 作为预期miR-486-5p模拟物显著抑制了SMAD2mRNA表达水平（P<0.05）；图3B)显著降低SMAD2蛋白表达式(图3C和D)与NC组比较。相反，miR-486-5p治疗抑制剂对SMAD2 mRNA和蛋白表达水平（P<0.05）；图3B-D).

图3。 miR-486-5p和不同处理组CHON-001细胞中的SMAD2。以下用miR-486-5p模拟物或抑制剂转染反向检测CHON-001中miR-486-5p和SMAD2的水平转录定量聚合酶链反应与western吸墨纸。（A） miR-486-5p的相对表达水平。（B）SMAD2 mRNA（C和D）蛋白的相对表达水平SMAD2的表达水平。数据表示为平均值±标准差*P<0.05 vs.NC.miR，microRNA；SMAD2、SMAD家庭成员2。

miR-486-5p对CHON-001细胞的作用增殖和迁移由MTT和Transwell测定迁移分析。与miR-NC相比转染细胞，转染细胞的增殖能力miR-486-5p模拟物被显著抑制（P<0.05；图4A). 此外miR-486-5p模拟物转染组的迁移细胞为与miR-NC组相比降低，表明降低miR-486-5p模拟物转染后的迁移能力(图4B).

图4。 miR-486-5p对CHON-001细胞的作用扩散和迁移。细胞后总共24小时转染、CHON-001细胞增殖和迁移分别通过MTT和Transwell迁移分析测定。（A）miR-486-5p过度表达和抑制对CHON-001的影响细胞增殖。（B） miR-486-5p过度表达和抑制CHON-001细胞迁移。数据显示为平均值±标准偏差*与NC.miR相比，P<0.05和**P<0.01，微RNA；NC，阴性对照；外径，光密度。

II型胶原蛋白和聚集蛋白的表达是对关节软骨组织的发育很重要。RT-qPCR结果显示II型胶原蛋白和聚集蛋白在miR-486-5p对模拟转染的反应与miR-NC转染组（P<0.01）；图5A). western印迹结果也表明miR-486-5p模拟转染显著减少II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的蛋白表达水平(图5B-D).

图5。 microRNA-486-5p对II型的影响胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达。细胞后总共24小时转染、mRNA和蛋白表达水平反向检测II型胶原蛋白和聚集蛋白转录定量聚合酶链反应与western分别进行印迹。（A） 类型的相对mRNA表达水平II胶原蛋白和聚集蛋白。数据以平均值±标准表示偏差**与NC相比P<0.01II型胶原蛋白和聚集蛋白。NC，阴性对照。

miR-486-5p抑制剂促进CHON-001细胞增殖、迁移和II型表达胶原蛋白和聚集蛋白

进一步证实miR-486-5p在OA中的作用miR-486-5p抑制剂转染CHON-001细胞。与NC相比，转染miR-486-5p的细胞抑制剂的增殖和迁移增强能力(图4A和B,分别）。此外，II型的mRNA表达水平胶原蛋白和聚集蛋白显著增加miR-486-5p抑制剂治疗（P<0.01；图5A). 此外，蛋白质II型胶原和聚集蛋白聚糖的表达水平显著miR-486-5p抑制剂治疗后增加（P<0.01；图5B-D).

SMAD2静音将反转miR-486-5p抑制剂诱导CHON-001细胞上调增殖和迁移以及II型的表达水平胶原蛋白和聚集蛋白

SMAD2在OA开发中起着关键作用。收件人确定miRNA-486-5p是否通过SMAD2影响软骨细胞，小干扰（si）RNA用于沉默SMAD2在CHON-001细胞。Western blotting显示SMAD2蛋白相比之下，SMAD2 siRNA转染降低了表达水平用si对照处理的细胞(图。6A级). Western blotting和RT-qPCR结果表明，与转染miRNA-486-5p抑制剂的细胞比较+si-Con、SMAD2蛋白和mRNA表达水平在转染miRNA-486-5p抑制剂+si-SMAD2的细胞（P<0.05）；图6B和C). 在此外，miRNA-486-5p抑制剂诱导的II型细胞增多si-SMAD2逆转了胶原蛋白和聚集蛋白的表达水平联合转染(图6B和D).值得注意的是，miR-486-5p抑制剂诱导的增殖增加SMAD2沉默可抑制迁移(图7A和B）。这些结果表明，SMAD2的沉默逆转了上调CHON-001细胞增殖和迁移以及类型miR-486-5p诱导的II型胶原和聚集蛋白表达抑制剂处理。

图6。 siRNA-SMAD2对SMAD2型的影响II胶原蛋白和聚集蛋白的表达。（A） SMAD2蛋白表达在用si-SMAD2处理的细胞中减少。（B） 蛋白质SMAD2、II型胶原和聚集蛋白聚糖的表达水平不同的群体。（C） SMAD2，（D）II型胶原和聚集蛋白mRNA不同组的表达水平。数据表示为平均值±标准偏差*P<0.05和**P<0.01与。si-Con#与In相比，P<0.05和##P<0.01+si-Con.Con控制；in，miRNA-486-5p抑制剂；si，小干扰；SMAD2，SMAD家族成员2。

图7。 siRNA-SMAD2对CHON-001的影响细胞增殖和迁移。siRNA-SMAD2对增殖和迁移由MTT和Transwell测定迁移测定。（A） siRNA-SMAD2对CHON-001细胞增殖。（B） siRNA-SMAD2对CHON-001的影响细胞迁移。数据以平均值±标准表示偏差*与si-Con相比，P<0.05和**P<0.01；#与In+si-Con相比，P<0.05和##P<0.01。si-Con，控制siRNA；In，miRNA-486-5p抑制剂；si，小干扰；SMAD2，SMAD家族成员2。

讨论

OA是最常见的慢性关节疾病影响大多数65岁以上的人(17). OA的发病机制非常复杂复杂且涉及多种分子机制，例如TGF-β信号通路和Wnt/β-catenin的失调信号通路(18,19). miRNAs以前被表示为导致OA中的信号网络中断(20)，并且一些特定的miRNA具有已确定在OA发病过程中至关重要(21). 因此，密钥的发现miRNAs可能在OA的发展中起作用，可能提供对设计有效的miRNA靶向疗法有价值的见解。在本研究中，miR-486-5p可能是参与OA的开发，因此可能是一个有前途的OA治疗靶点。

TGF-β信号传导失控是常见的在OA中观察到(22,23). 之前的一项研究表明TGF-β信号通路通过激活素受体样激酶（ALK）5/SMAD2/SMAD3途径或ALK1/SMAD2/SMAD5通路(24).SMAD2似乎对软骨生成有更强的影响与SMAD3相比体内(25). 此外，SMAD2水平较低在OA患者中检测到蛋白表达在没有OA的患者中(13).TGF-β信号通路可能激活有丝分裂原激活的蛋白激酶1/细胞外信号调节激酶信号通路与SMAD2/SMAD3信号通路诱导II型蛋白表达大鼠软骨细胞中的胶原蛋白和聚集蛋白(26). 人软骨细胞系CHON-001，沉默SMAD2表达被证明触发II型胶原蛋白和聚集蛋白水平下降建议SMAD2在OA开发中发挥关键作用。

除了受TGF-β信号调节外，SMAD2还受其他几个分子控制，包括miRNA。例如，据报道，miR-155直接针对SMAD2并抑制SMAD2表达(27). miR-486-5p调节多重癌基因和被证明与癌症的发展(28,29).先前的研究表明miR-486-5p可能调节SMAD2晶状体上皮细胞的表达(30). 然而，SMAD2在OA中的作用仍然难以捉摸。在本研究中，证明了SMAD2表达降低，miR-486-5p表达降低OA患者中升高。本研究的发现与之前的研究一致(13,31).此外，刘等(30)据报道，miR-486-5p可能调节SMAD2在晶状体上皮细胞中的表达。本研究研究了miR-486-5p和SMAD2在CHON-001细胞，结果表明SMAD2为被证明是miR-486-5p的直接靶标。此外miR-486-5p对软骨细胞的影响也在本研究。研究结果表明miR-486-5p降低软骨细胞增殖和迁移。相反，抑制miR-486-5p导致软骨细胞增殖和迁移。值得注意的是SMAD2沉默可逆转增殖和迁移。这个II型胶原蛋白和聚集蛋白的表达水平miR-486-5p模拟转染反应降低miR-486-5p抑制剂可能增强。SMAD2静音反转miR-486-5p抑制剂诱导的II型胶原蛋白和聚集蛋白。

总之，本研究表明miR-486-5p靶向SMAD2 mRNA，这是OA发展的关键基因。签署人靶向SMAD2，miR-486-5p负调控表达软骨细胞中II型胶原蛋白和聚集蛋白的水平。因此，miR-486-5p的丢失可能会增加细胞的增殖和迁移软骨细胞。本研究的结果表明miR-486-5p在OA中的作用，这表明miR-485-5p可能代表诊断的潜在标记和目标OA的治疗。

致谢

不适用。

基金

没有收到资金。

数据和材料的可用性

当前生成的分析数据集可从通讯作者处获得关于合理请求。

作者的贡献

JS、SS和KG为研究、文献检索和手稿的概念和设计准备工作。JL和CL为统计分析和数据解释。

道德批准和同意参与

本研究得到了伦理委员会的批准连云港东方医院委员会（中国连云港）。所有患者均获得书面知情同意书。

出版同意书

不适用。

竞争性利益

作者声明他们没有竞争对手利益。

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