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介绍

乳腺癌仍是癌症的主要病因妇女死亡，尽管由于早期诊断和改进的外科技术以及更好的化疗和放疗(1——三). 它据估计，约有252710例新的浸润性乳腺癌病例女性将被确诊，约40610名女性将死于2017年美国乳腺癌(4).

大约15-20%的乳腺癌被发现是雌激素受体、孕激素受体和HER2，定义为三阴性乳腺癌（TNBC）(5). TNBC预后不良，仅对化疗和放疗有效，但对激素治疗无效(6，7). 因此，新分子的发现治疗TNBC患者的目标一直很紧迫重大利益(8，9).

微RNA（miRNAs/miRs）是小的非编码RNA在基因表达调控中起重要作用转录后的(10).越来越多的证据表明，一些miRNAs在癌症，表现为致癌特征，而一些miRNAs在癌症中下调，并作为肿瘤抑制miRNA发挥作用。因此，miRNAs在肺癌等多种人类肿瘤的发生(11)，子宫内膜(12)和结肠癌(13). miRNAs很有潜力癌症治疗的目标。以前的研究表明miRNAs与乳腺癌。黄等表明miR-21改善了乳腺癌细胞浸润与调控上皮间质过渡（EMT）(14).miR-205的过度表达降低了细胞增殖和通过调节HMGB3增加乳腺癌细胞凋亡。miR-205显著调节HMGB3及其异位表达抑制乳腺癌细胞增殖促进细胞凋亡(15). 最近，刘等报告miR-374b-5p、miR-218-5p、，miR-126-3p、miR-27b-3p预测TNBC预后良好(16).

在这项研究中，我们检测了miR-27a的功能TNBC细胞在细胞增殖、侵袭和迁移中的作用线。

材料和方法

细胞系

MDA-MB-231和MDA-MB-468，人TNBC细胞系从美国类型培养物收藏中心（ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯，美国）。肿瘤细胞生长在Dubelcco’s改良Egale培养基（DMEM）（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）补充100µg/ml链霉素、100 U/ml青霉素和10%胎牛血清（Invitrogen），并在37°C的湿度下含有5%CO的培养箱2当所有细胞达到70-80%时合流，它们被用于我们的实验。

细胞转染与miRNA量化

转移miR-27a模拟物或抗-miR-27a抑制剂（Invitrogen）进入乳腺癌细胞，Lipofectamine 2000（Invitrogen）。随机序列miRNA模拟分子是用作阴性对照（mirVana™miRNA模拟物；Ambion，Austin，TX，USA）。然后，miR-27a表达水平在检测转染情况。总RNA提取自转染乳腺癌细胞，TaqMan miRNA逆转录工具包（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科学公司）用于根据制造商的说明合成cDNA。这个GAPDH是家政基因之一，被用作内源性参考基因。

细胞增殖试验

miR-27a对乳腺癌的影响分析细胞增殖，WST-1分析（罗氏诊断，印第安纳波利斯，美国印第安纳州）。简言之，转染的乳腺癌将细胞以2×104细胞/孔，隔夜培养。这些细胞是在37°C下，在5%的加湿培养箱中继续培养一氧化碳2向每个孔中加入.20µl WST-1试剂每24小时在37°C下培养至少1小时，然后测定吸光度在490 nm处测量。所有实验均在一式三份。

迁移和侵入分析

评估乳腺癌细胞迁移和进行Promega迁移和侵袭分析按照制造商的说明。简单地说，转染乳腺癌细胞接种在上Transwell室在没有FBS的DMEM中使用或不使用Matrigel。DMEM将含有5%FBS的溶液加入下室。这些细胞是在37°C下培养18小时。然后移除未充气的细胞通过棉签，并通过Diff Quik对侵入的细胞进行染色污渍。计算迁移和入侵的百分比显示为侵入细胞与第二次标准化细胞的比率生长曲线的天数。

蛋白质印迹分析

用冷水轻轻清洗乳腺癌细胞磷酸盐缓冲盐水，然后在冰镇溶解缓冲液中溶解（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.1%十二烷基硫酸钠，150 mM氯化钠，0.5%脱氧胆酸盐，1%NP-40和1X蛋白酶抑制剂），然后在100°C下加热5将蛋白裂解物（20µg）加载到SDS-PAGE凝胶中转移到PVDF膜（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）。PVDF膜在封闭缓冲液中培养1小时室温。不同的初级抗体[B细胞淋巴瘤（Bcl）-2、Bcl-2相关X（BAX）、AKT和p-AKT；细胞信号Technology，Inc.，Danvers，MA，USA]添加在5%非脂肪干在4°C的TBS-T缓冲液中过夜，然后进行二次抗体在室温下孵育1h。免疫信号使用EasySee Weatern Blot试剂盒（TransGen Biotech有限公司，中国上海）。

电离后的细胞凋亡活性辐射处理

检测乳腺癌细胞凋亡活性miR-27a表达改变的乳腺癌细胞在密度为2×10的24孔板中生长5/嗯，还有培养过夜。然后将乳腺癌细胞暴露于不同剂量的电离辐射。培养24小时后通过测定caspase 3/7活性来检测细胞凋亡活性使用Caspase-Glo3/7分析试剂盒（Promega Corp.，Madison，WI，美国）遵循制造商协议。简言之，Caspase-Glo将试剂添加到每个孔中，然后培养细胞将半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-Glo试剂置于暗处8小时在室温下摇动。测量了发光值使用1分钟滞后时间和0.5秒/井读时间。所有实验分三次进行。

荧光素酶报告试验

携带miRNA的pEZX-MT05报告载体磷酸酶和张力蛋白同源物3′-UTR的长度结合序列（PTEN）基因、BAX或控制序列（GeneCopoeia，Rockville，MD，美国）与has-miR-27a共同转染到HEK-293T细胞Lipofectamine 2000（Invitrogen）。转染两天后，收集培养基和高斯荧光素酶碱性磷酸酶活性用分泌的制造商提供的双发光套件说明（GeneCopoeia）。高斯荧光素酶活性为标准化为碱性磷酸酶活性。

裸鼠异种移植试验

雌性BALB/c无胸腺裸鼠（5周龄）购自Charles River Laboratories（美国马萨诸塞州威明顿）用于异种移植实验。小鼠被饲养在根据机构动物护理指南和动物实验指南。MDA-MB-231乳腺癌细胞(1×106)使用或不使用miR-27a模拟物与Matrigel ECM（重建基底膜）(17)并经皮下注射乳房脂肪垫。每个实验中包括10只小鼠组。每3天测量一次肿瘤大小长度（L）和宽度（W）用卡尺测量，肿瘤体积为计算为：肿瘤体积=πLW2/6 (18).

统计分析

我们实验中的所有结果均显示为平均值±标准偏差。SPSS程序（11.0版；SPSS公司。，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行统计分析学生的t检验。差异从统计学角度考虑如果P<0.05，则显著。

结果

miR-27a促进了体内外TNBC细胞

确定miR-27a对增殖的影响在TNBC细胞中，miR-27a被转染到MDA-MB-231和MDA-MB-468TNBC细胞与Lipofectamine 2000。MTT分析用于检查增长曲线(图1).如所示图1A，miR-27aMDA-MB-231和转染miR-27a模拟物后的MDA-MB-468细胞，以及miR-27a表达水平在转染抗-miR-27a抑制剂。miR-27a促进MDA-MB-231的增殖(图1B)和MDA-MB-468细胞(图1D)（P<0.05）。当抗miR-27a可降低miR-27a的表达水平MDA-MB-231增殖抑制剂(图1C)和MDA-MB-468细胞(图1E)被抑制（P<0.05）。

图1。 miR-27a促进TNBC细胞。（A） miR-27a表达水平由转染miR-27a模拟物或miR-27a抑制剂。P=0.002，P=0.008，P+0.006，P=0.004。（B） miR-27a过度表达后MDA-MB-231细胞的增殖。（C）转染MDA-MB-231细胞后的增殖抗miR-27a抑制剂。（D） MDA-MB-468细胞的增殖miR-27a过度表达后。（E） MDA-MB-468的增殖细胞转染抗miR-27a抑制剂后。（F） 在miR-27a模拟物转染MDA-MB-231细胞的体内生长裸鼠移植。（G） 裸鼠平均肿瘤重量脱口秀。（H） miR-27a在裸鼠体内的表达水平外移植物*P<0.05。miR，microRNA；TNBC，三阴性乳腺癌症。

检测miR-27a是否调节肿瘤生长体内，我们进行了皮下肿瘤异种移植注射转染MDA-MB-231乳腺癌细胞的实验变成免疫缺陷裸鼠。与病媒对照组相比，转染MDA-MB-231的肿瘤生长率和肿瘤重量异种移植物显著增加（P<0.01）(图1F和G). 这些体内结果与在体外实验结果，并显示miR-27a改善了乳腺癌细胞的肿瘤生长体内。miR-27a在肿瘤中的表达水平较高转染MDA-MB-231细胞(图。1小时).

miR-27a增强的迁移和TNBC细胞侵袭

检查miR-27a对迁移和TNBC细胞侵袭后，我们进行了迁移和Matrigel使用BD Transwell进行侵入分析。如所示图2、迁移和入侵MDA-MB-231型(图2A-D)和MDA-MB-468型(图2I-L)是miR-27a转染后显著增加。相反，MDA-MB-231的迁移和入侵(图2E-H)和MDA-MB-468细胞(图2M-P)显著减少了抗miR-27a抑制剂。

图2。 miR-27a增加迁移和TNBC细胞的侵袭。（A-D）miR-27a增加迁移和MDA-MB-231细胞的侵袭。（E-H）抗miR-27a治疗后MDA-MB-231细胞减少抑制剂。（I-L）miR-27a增加了MDA-MB-468细胞。（M-P）MDA-MB-468的迁移和入侵抗miR-27a抑制剂处理后细胞数量减少。所有实验均进行三次，一式三份。miR、，微RNA。

miR-27a改变了辐射诱导的对TNBC细胞增殖的抑制作用

我们进一步检测了辐射诱导的抑制miR-27a对TNBC细胞增殖的影响。这个MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞转染miR-27a暴露于不同剂量的电离辐射（30，50和100 Gy）。进行MTT分析以评估增殖。如所示图3，辐射对两者增殖的抑制作用MDA-MB-231型(图3A-C)和MDA-MB-468型(图3D-F)个单元格miR-27a过度表达后呈剂量依赖性下降，与对照细胞相比。

图3。 miR-27a提高了TNBC的生存率辐照后的细胞。（A-C）miR-27a对MDA-MB-231细胞在不同剂量的辐照处理。（D-F）miR-27a对增殖的影响MDA-MB-468细胞经不同剂量的辐射处理后的细胞凋亡率。miR，microRNA；TNBC，三阴性乳腺癌。

miR-27a减少辐射诱导TNBC细胞的凋亡

确定miR-27a在caspase 3/7测定辐射诱导TNBC细胞凋亡活性和凋亡相关蛋白。如所示图4，miR-27a抑制caspase 3/7MDA-MB-231中的放射性(图。4A级)和MDA-MB-468(图4B)细胞呈剂量依赖性。BAX和Bcl-2的表达是在MDA-MB-231中更改(图4C和D类)和MDA-MB-468(图4E和F类)与对照组相比，miR-27a过表达后细胞。

图4。 miR-27a抑制辐射诱导TNBC细胞凋亡。（A） MDA-MB-231中caspase 3/7的活性不同剂量照射后转染miR-27a的细胞治疗。（B） MDA-MB-468细胞中caspase 3/7的活性不同剂量照射后转染miR-27a治疗。（C和D）MDA-MB-231中的凋亡蛋白水平辐射后的细胞。（E和F）细胞凋亡蛋白水平辐射后的MDA-MB-468细胞。miR，microRNA；TNBC、，三阴性乳腺癌；Bcl、B细胞淋巴瘤；BAX，B电池淋巴瘤-2相关X。

TNBC中miR-27a激活AKT细胞

我们进一步检测了p-AKT的表达miR-27a后MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中AKT和PTEN的表达过度表达。我们发现miR-27a增加了p-AKT，并降低MDA-MB-231中PTEN的表达水平(图5A和B)和MDA-MB-468(图5C和D)细胞。

图5。 miR-27a激活TNBC细胞中的AKT。（A） p-AKT、AKT和PTEN在MDA-MB-231细胞中的表达用miR-27a模拟物转染后。（B） 相对表达式转染MDA-MB-231细胞后的蛋白质水平通过密度分析模拟miR-27a。（C） 的表达式转染MDA-MB-468细胞后的p-AKT、AKT和PTENmiR-27a模拟。（D） 上蛋白质的相对表达水平miR-27a模拟物转染MDA-MB-468细胞后密度分析。（E和F）潜在结合序列miR-27a与靶基因（PTEN和BAX）和荧光素酶之间以剂量依赖的方式转染miR-27a后的活性含有PTEN和BAX 3′-UTR的荧光素酶报告子。miR、，微RNA；TNBC，三阴性乳腺癌；PTEN，磷酸酶和张力蛋白同源物；Bax，B细胞淋巴瘤-2相关X。

研究miR-27a是否能够调节PTEN和BAX的直接表达，我们搜索miR-27a的潜在表达miRNA靶向PTEN 3′-UTR和BAX 3′-UTR内的结合位点基因预测软件（TargetScanHuman）。搜索结果表明miR-27a在PTEN 3′-UTR和BAX中有潜在的结合位点3′-UTR(图5E和F).

评估miR-27a对PTEN和BAX的影响表达，我们用报告基因（HMI）进行了萤光素酶测定含有PTEN和BAX基因的3′-UTR。荧光素酶活性结构（HMI）显著增加，呈剂量依赖性miR-27a模拟物的联合转染方式呈剂量依赖性方式(图5E和F). 然而，miR-27a转染对荧光素酶活性无影响缺乏PTEN 3′-UTR融合的控制质粒（CMI）(图5E和F).

讨论

最近的研究表明，miR-27a发挥了在包括肾脏在内的许多器官的肿瘤发生中起重要作用(19)，胸部(20)，胃(21)和子宫颈(22). 例如，平移等建立miR-27a能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭调节MAP2K4表达的人骨肉瘤细胞(23). miR-27a的过度表达是通过调节与胃癌细胞转移的关系电子病历(24). 一直以来证明Wnt/β-catenin信号通路与随着乳腺癌的扩散和迁移。香港et（等）铝发现miR-27a促进乳腺癌的增殖通过Wnt/β-catenin信号通路靶向SFRP1细胞在体外和体内(25). 此外，德雷顿等据报道，miR-27a通过以下途径导致顺铂耐药靶向半胱氨酸/谷氨酸交换器SLC7A11(26). 最近的研究表明miR-27a可能作为乳腺癌的预后标志物(27). 此外，miR-27a可能与乳腺癌细胞中的其他miRNA协同(28). 在我们的研究中，我们发现miR-27a促进TNBC细胞增殖。此外，我们还表明miR-27a的过度表达增强了两者的迁移和侵袭MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞。然而，miR-27a的下调减少MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞。众所周知，TNBC更有可能复发且预后不良(29). 转移是重要原因之一TNBC复发。因此，我们的研究表明miR-27a在TNBC进展中起重要作用。

放射治疗是一种高效的辅助疗法乳腺癌患者术后的治疗(30). TNBC的特点是快速生长和局部复发。已经发现放射治疗可以减少T1-2N0患者的局部复发改良乳腺癌根治术后的疾病(31). 在本研究中，我们发现miR-27a可提高照射后TNBC细胞的存活率。同时，miR-27a抑制辐射诱导的细胞凋亡TNBC细胞。

PTEN是第二常见突变肿瘤抑癌基因在人类癌症中起关键作用肿瘤细胞的增殖、凋亡和细胞周期。PTEN公司通过靶向多个信号通路参与肿瘤的发展，如MAPK通路、FAK通路和PI3K/AKT通路。最近研究表明PI3K/AKT途径是关键途径PTEN通过其发挥抗肿瘤作用(32). PI3K/AKT途径调节多种生物过程并调节下游反应包括细胞增殖、凋亡和代谢。一直以来发现由于PTEN丢失，TNBC中PI3K/AKT被激活(33). 我们的结果表明PTEN表达水平下降，p-AKT表达水平下降过度表达miR-27a后TNBC细胞中增加。此外，荧光素酶分析显示PTEN和BAX被miR-27a与3′-UTR结合。这些结果表明miR-27a靶向PI3K/AKT调节TNBC细胞增殖信号通路。需要进一步的研究来证明分子机制。

miR-27a调节肿瘤发生和恶性TNBC的进展。本研究表明miR-27a可能是用作预测放射治疗反应的潜在生物标志物TNBC的预后。

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